JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

التوصل إلى فهم مستوى النظم من العمليات الخلوية هو هدف بيولوجيا الخلية في العصر الحديث. نحن هنا وصف استراتيجيات للصحفيين وسيفيراز المتنوعة من مختلف وظيفة الخلوية نقطة نهاية لاستجواب وظائف الجينات باستخدام الجينوم على نطاق والمكتبات رني.

Abstract

الاستجواب على نطاق الجينوم وظيفة الجين باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي (رني) يحمل وعدا هائلا لتحديد السريع للين العريكة كيميائيا نقاط الضعف الخلايا السرطانية. مما يحد من إمكانيات هذه التكنولوجيا هو عدم القدرة على ترسيم بسرعة أساس الآلية من نتائج المظهري وبالتالي يسترشد بها في وضع استراتيجيات علاجية تستهدف جزيئيا. نحن هنا الخطوط العريضة الأساليب لتفكيك الظواهر الخلوية الناجمة عن الجين رني بوساطة استهداف باستخدام أنظمة مراسل المضاعفة التي تسمح رصد سرطان مفتاح عمليات الخلية المرتبطة. هذه المنهجية الفرز نسبة عالية هي متعددة ويمكن تكييفه بسهولة لفحص أنواع أخرى من مكتبات الجزيئية كبيرة.

Introduction

مجموعة متنوعة من الصحفيين على وسيفيراز لرصد مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية خلية متاحة تجاريا. غالبية هذه البروتينات الحمض النووي يبني ترميز وسيفيراز التي يسببها وصريح من قبل المحفزات خلية معينة أو اضطرابات. الأكثر صحفيين قوية مقرها transcriptionally وضع التعبير عن انزيم luciferase المراسل تحت سيطرة عناصر محسن الاصطناعية أو مناطق المروج الجين راسخة لموثوقيتها في الإبلاغ عن ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية النسخي 1،2 حدث. وهناك أيضا نظم عبر مراسل luciferase التي تستخدم GAL4-UAS لدفع وسيفيراز تعبير البروتين. GAL4 هي الخميرة النسخي المنشط وUAS هو محسن الذي يربط GAL4 خصيصا لتفعيل النسخ من تسلسل الجينات وضعت أسفل تيار من ذلك 3. وعادة ما يتم اعتماد هذه الأنواع من أنظمة وسيفيراز من قبل اثنين من البلازميدات الحمض النووي - واحد بترميز البروتين GAL4 تنصهر إلى regulatoراي جزء من البروتين من الفائدة، والثاني يشفر بروتين وسيفيراز وضعت تحت سيطرة واحدة أو أكثر UAS متواليات. وهكذا، فإن إشارة وسيفيراز الخلوية يعكس مستوى النشاط من البروتين من الفائدة. آخر الاستخدام المشترك للصحفيين المستندة إلى وسيفيراز هو لرصد استقرار البروتين حيث يتم تنصهر بروتين من الفائدة إلى إنزيم وسيفيراز 4. بغض النظر عن نوع من المراسل، ويلاحظ على مسؤولية المشتري هنا كما لا يستطيع المرء تحمل خصوصية أي مراسل لتم استجوابه بشكل جيد. وبالتالي، مطلوب العناية الواجبة في إدماج بنيات مراسل جديدة في أي استراتيجية للبحوث.

اختيار الانزيم وسيفيراز قراءة خارج يمكن أن تكون مهمة مثل الاعتماد على عناصر DNA التي تتحكم في التعبير عنها. في حين luciferase يراعة (FL) هو انزيم الأكثر استخداما في التركيبات المتاحة تجاريا، وظهور أنظمة مراسل luciferase الجديدة التي لا تتطلب ATP (كما في حالةمن ردود الفعل على أساس FL) أو التي تتضمن الإنزيمات أكثر استقرارا التي تنبعث منها إشارات أقوى نعد لتحسين كفاءة وموثوقية منصة الأبحاث هذه. ملاحظة هامة فيما يتعلق باختيار صحفيين وسيفيراز في الدراسات الكيميائية هو قابلية FL على تثبيط المواد الكيميائية التي يمكن أن تؤدي إلى تقارير كاذبة. في تجربتنا، والإنزيمات الأخرى مثل Renilla أو Gaussia وسيفيراز (RL وGL، على التوالي) التي تستخدم coelenterazine باعتبارها الركيزة هي تثبيط أقل بسهولة بواسطة الجزيئات الصغيرة 5.

الشكل الأكثر شيوعا لتعدد وسيفيراز قراءة عموميات تنطوي على استخدام FL وRL نظرا إلى حد كبير بتوافر سهلة الاستخدام لمجموعات مع القدرة على قياس بالتسلسل الأنشطة الأنزيمية من عينة واحدة. في معظم مجموعات، ويتعرض العينات الأولى للوسيفيرين للكشف عن مستويات النشاط FL تليها كاشف التبريد التي يتم إيداعها في وقت واحد مع coelenterazine أن تسفر عن الشركة السعوديةدارى RL إشارة. مع إضافة luciferases الأخرى التي يمكن أن يفرز مثل GL أو التي تستخدم حتى الآن الركيزة أخرى مثل Cypridina وسيفيراز (CL)، وهو عدد أكبر من إمكانيات لتوليد ظهرت محتوى البيانات عالية باستخدام luciferases. مثال على شاشة رني الجينوم على نطاق باستخدام هذه التقنية يمكن العثور عليها هنا 6. هذه التقدم التكنولوجي قد بدوره حفز تطوير آليات محددة لإرواء كل نوع من انزيم luciferase المراسل من أجل الحد عبر الحديث 7. في أيدينا، ونحن نلاحظ تردد أكبر من "آثار الحافة" (الاتجاهات لا يمكن تفسيره في النشاط الخلوي المرتبطة حافة عالية لوحات ثقافة عيار)، مع luciferases يفرز مثل GL أو CL. من ناحية أخرى، مثل luciferases يفرز هي مفيدة لفحوصات الحركية كما أنها تمكن أخذ العينات إشارة دون غش بقاء الخلية.

لدراستنا المعروضة هنا، وسوف نقوم في نفس الوقت مراقبة النشاط من ثلاثة السرطان ذات الصلةالعمليات الخلوية: وP53، KRAS، وWNT مسارات نقل الإشارة. للصحفيين أدرجت في دراستنا هي FL مراسل pp53-TA-لوك من Clontech (المشار إليه فيما مراسل P53-FL) 8، نظام مراسل Elk1-GAL4/UAS-CL (من الآن فصاعدا إلك-1 المراسل؛ اجيلنت)، وTCF مراسل RL 8X الذي يشتمل على عدة عناصر محسن الاصطناعية معترف بها من قبل WNT مسار المنظمين النسخي المعروف باسم العوامل تي خلية (أو TCFs) 9-11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

بروتوكول كامل يستغرق حوالي 4 أيام.

1. إعداد الخلايا لسيرنا ومراسل ترنسفكأيشن

وسوف أعرض هنا بروتوكولا لاستجواب المكتبات سيرنا باستخدام مجموعة صغيرة من الرناوات siRNAs (384 مختلفة سيرنا برك مجموعة في 96 شكل جيد مع كل تجمع يتألف من الرناوات siRNAs 4X استهداف جين واحد) من مكتبة سيرنا على نطاق الجينوم لأغراض التوضيح. لهذه الدراسة خاصة، ونحن سوف يستغل HCT116 الخلايا التي تظهر إشارات WNT وKRAS المنحرف، والنشاط P53. فإن خط الخلية المناسبة في الدراسات التي تهدف إلى استجواب العمليات الخلوية الأخرى ذات الاهتمام يتعين تحديدها وتقييمها بطريقة مماثلة.

  1. يغسل 5 × 10 سم 2 لوحات من 80-90٪ متموجة HCT116 الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثم حصاد الخلايا بواسطة trypsinization باستخدام 1 مل من محلول trypsinization / لوحة تليها تحييد مع 10 مل من Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) التي تحتوي على 2٪ FEتل المصل البقري (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين / لوحة.
  2. نقل الخلايا علقت في أنبوب مخروطي 50 مل ونباذة في ~ 130 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف، وإعادة تعليق بيليه خلية في 10 مل من DMEM / FBS 2٪ / 1٪ البنسلين / الستربتوميسين.
  3. حساب عدد الخلايا مع عداد الخلية، ثم جعل الحل الخلية مع 10 5 خلية / مل، والحفاظ على 150 خلية مل تعليق للخطوة التالية. لوحة 10 4 خلايا (100 ميكرولتر) في كل بئر من 96 لوحة جيدا ثقافة الخلية باستخدام Multidrop موزع السائل الآلي (Multidrop من الآن فصاعدا). يجب أن يكون التعليق الخلية كافية في هذه الحالة لتصفيح 12 × 96 لوحات جيدة.
  4. احتضان لوحات مع الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5٪ CO 2 أثناء إعداد خليط ترنسفكأيشن.

2. إعداد مراسل بناء الحل الأسهم

  1. عزل مراسل عالية الجودة بناء الحمض النووي باستخدام معيار midiprep مجموعات (ينتج NucleoBond إكسترا ميدي بواسطةClontech) ويخفف من الحمض النووي إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل لكل مراسل.
  2. إعداد 100 ميكرولتر من محلول المخزون مراسل بناء عن طريق الجمع بين 30 ميكرولتر من P53-FL، 30 ميكرولتر من 8X TCF-RL، 30 ميكرولتر من Elk1-GAL4، 6 ميكرولتر UAS-CL و 4 ميكرولتر من H 2 O لتحقيق مزيج الحمض النووي مع نسبة 1:1:1:0.2 النهائي للصحفيين. تركيز الحمض النووي DNA النهائية لهذا المزيج محلول المخزون هو 0.3 ملغ / مل.

3. إعداد سيرنا / DNA ترنسفكأيشن ميكس

في هذا الجزء من البروتوكول، ونحن نستعد سيرنا / DNA يمزج ترنسفكأيشن من شأنها أن تكون كافية لtransfecting 12 × 96 لوحات جيدة. لهذه المكتبة الاختبار من 4 × 96 لوحة جيدا من الرناوات siRNAs، وسوف نقوم بالنقل كل تجمع سيرنا في ثلاث نسخ. كاشف ترنسفكأيشن سوف نستخدم ما يسمى Effectene (QIAGEN). في أيدينا وهذا هو كاشف الوحيدة التي تعمل من أجل تسليم في وقت واحد من سيرنا والحمض النووي في الخلايا المستزرعة.

  1. تمييع 80 ميكرولتر من مراسل بناء المخزون سولution في 8 مل من EC العازلة (Effectene كيت) للتوصل إلى حل الحمض النووي مع تركيز النهائي من 3 ميكروغرام / مل. بشكل عام، وإعداد ما يكفي من الحمض النووي حل مزيج للاستخدام الفوري.
  2. لوحة 20 ميكرولتر من هذا الحل DNA إلى كل بئر من 96 جيدا / لوحة. فإن عدد 96 لوحات جيدة تعتمد على عدد وسيتم اختبار برك سيرنا. على سبيل المثال، في هذه الحالة سوف نحتاج إلى 4 × 96 لوحات جيدة لتقييم 384 برك سيرنا مختلفة.
  3. ينبغي أن الرناوات siRNAs لفحصها يكون في تركيز الأسهم من 5 ميكرومتر. إذا لم يكن كذلك، فإنها يمكن أن تكون متماثلة المطلية وتخفيفه إلى هذا التركيز باستخدام العازلة تخفيف الموصى بها المرتبطة بكل مكتبة.
  4. نقل 2 ميكرولتر من كل سيرنا الأسهم 5 ميكرومتر إلى المقابلة بئر من لوحة PCR التي تحتوي على الحمض النووي الأسهم المخفف مع Biomek الآلي معالج السائل. اعتمادا على مقياس الدراسة، وهو pipettor متعدد القنوات قد يكون كافيا.
  5. الآن، سوف نقوم بإضافة 1 ميكرولتر من الحل محسن (Effectene عدة) إلى كل بئر من الحمض النووي / سيرنا جيش التحرير الشعبى الصينىالشركة المصرية للاتصالات. هذا مرة أخرى يمكن أن يتحقق إما مع معالج السائل الآلي أو pipettor الأقنية.
  6. السماح للتفاعل محسن أن تحدث في RT لمدة 5 دقائق ثم تضاف 3 ميكرولتر من Effectene كاشف ترنسفكأيشن إلى كل بئر واحتضان في RT لمدة 10 دقيقة إضافية.
  7. لوقف ترنسفكأيشن تشكيل معقدة، إضافة 10 ميكرولتر من DMEM / FBS 2٪ / 1٪ البنسلين / الستربتوميسين إلى كل بئر من لوحة PCR.
  8. نقل 10 ميكرولتر من مزيج ترنسفكأيشن إلى كل بئر من لوحة جيدا 96 التي تحتوي على الخلايا (التي تم استردادها من الخلية الحاضنة). كما سيتم تنفيذ كل ترنسفكأيشن في ثلاث نسخ، وسيتم تطبيق نفس المزيج لمدة 96 لوحات جيدة إضافية تحتوي على خلايا.
  9. احتضان الخلايا مع مخاليط ترنسفكأيشن أضاف عند 37 درجة مئوية في بيئة ترطيب مع 5٪ CO 2 لمدة 36 ساعة.

4. تحديد الأنشطة luciferase المراسل من عينات الخلايا

بعد 36 ساعة، والأنشطة وسيفيراز مستعدون لقياسفي الخلايا transfected. وينبغي تحديد نقطة النهاية على أساس التجربة في. في دراستنا، كان له فترة حضانة 36 ساعة أسفرت سابقا إشارة قوية بما فيه الكفاية لمعنى تقرير النتيجة. كما تتضمن هذه الدراسة للصحفيين متعددة (واحد يفرز في مستنبت، واثنين آخرين أعرب في السيتوبلازم الخلية)، وسوف نقوم حصول على قياسات من كل من مستنبت فضلا عن المحللة الخلوية.

  1. الكشف عن النشاط CL في مستنبت:
    1. 20 ميكرولتر من مستنبت هي طبق الاصل مطلية مبهمة في 96 لوحة جيدا أبيض (إما باستخدام معالج السائل Biomek أو pipettor الأقنية).
    2. إضافة 20 ميكرولتر من العازلة مقايسة CL (استهداف الأنظمة) إلى كل بئر.
    3. إضافة 10 ميكرولتر من Cypridina الركيزة luciferin (استهداف الأنظمة) إلى كل بئر وكشف النشاط CL باستخدام luminometer (القارئ لوحة Pherastar التي تنتجها بي إم جي على سبيل المثال).
  2. كشف FL والنشاط RL:
    1. ليز جells عن طريق إزالة أول ثقافة المتوسط. ويمكن تحقيق ذلك بسرعة من خلال تحويل لوحة رأسا على عقب والقذف المتوسطة في بالوعة. المتبقية المتوسطة يمكن إزالتها عن طريق التنصت بلطف لوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية. إضافة 30 ميكرولتر من 1X سلبية الاحتياطي تحلل (PROMEGA) إلى كل بئر من الخلايا باستخدام Multidrop ومكان على الكرسي الهزاز منصة (Bellco هي شركة واحدة أن يجعل هذه) تعيين سرعة متوسطة لمدة 5 دقائق على RT.
    2. إضافة 20 ميكرولتر من كاشف الفحص luciferase المراسل الثاني (جزء من PROMEGA كيت luciferase المراسل المزدوج) باستخدام النشاط FL Multidrop وقياس فورا باستخدام luminometer. المقبل، إضافة ستوب اند جلو الكاشف (PROMEGA) التي من شأنها إخماد النشاط FL ويسمح بقياس النشاط RL. ملاحظة: إلا إذا كنت تستخدم خلطات الركيزة التي تسمح المدة إشارة الموسعة (مثل أطقم luciferase المراسل ثنائي جلو من PROMEGA)، واستخدام فلاش مجموعات يتطلب قياس السريع على إضافة الركيزة (في غضون 5 دقائق).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

على الرغم من التقدم في رسم المشهد طفرية من السرطانات المختلفة باستخدام ضخمة جهود تسلسل الجينوم 12-14، ونحن ما زلنا لا نملك في مكان مقاربة منهجية لترجمة هذه الملاحظات إلى استراتيجيات التدخل. في سرطان القولون والمستقيم (CRC)، والطفرات التي من المتوقع أن تؤثر على مكو?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وهناك العديد من مروجي أنظمة المستندة إلى مراسل luciferase المراسل (مثل PROMEGA، نظم الاستهداف، نيو انغلاند Biolabs، والحرارية فيشر) التي توفر الموارد على الخط مفيدة لأولئك مسلية شاشة عالية الإنتاجية للمرة الأولى. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن عددا من الاستعراضات ممتازة بشأن تحقيق ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

موافق وLL هي الكتاب على براءات الاختراع في انتظار المتعلقة المضاعفة التكنولوجيا وسيفيراز.

Acknowledgements

ونحن نعترف الدعم المالي من CPRIT (RP100119) ومؤسسة وولش (I-1665).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
PathDetect Elk1 Trans-Reporting SystemAgilent Technologies Inc.219005
Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc VectorClontech Lab Inc.631914
Effectene Transfection ReagentQiagen Inc.301427
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromega Corp.E1960
Cypridina Luciferase Assay reagentTargeting SystemsVLAR-1
HCT116 cellsATCCCCL-247
CytoTox-Fluo Cytotoxicity AssayPromega Corp.G9260
EQUIPMENT
MultiFlo Microplate DispenserLabsystems Inc.Model 832
Biomek FXP Laboratory Automation WorkstationBeckman Coulter Inc.A31842
PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate readerBMG Labtech Inc.0471-101A
Bright-Line Reichert HemacytometersHausser Scientific Company1490

References

  1. Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays. Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).
  2. Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. Seeing the light: luminescent reporter gene assays. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).
  3. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).
  4. Smirnova, N. A., et al. Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators. Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).
  5. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).
  6. Tang, W., et al. A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).
  7. Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems. United States patent. , (2012).
  8. Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes. Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).
  9. DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway. Science. 308, 826-833 (2005).
  10. Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
  11. Korinek, V., et al. Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse. Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).
  12. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487, 330-337 (2012).
  13. Koboldt, D. C., et al. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. , (2012).
  14. Wood, L. D., et al. The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
  15. Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens. Science Signaling. 2, pt4(2009).
  16. Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide. Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).
  17. Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. Analysis of cell-based RNAi screens. Genome Biology. 7, R66(2006).
  18. Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS ONE. 6, e28338(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

77 PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved