كله المشبك التصحيح الخلايا لدراسة آليات التحفيز العصبية الأشعة تحت الحمراء

Summary

وقد اقترح تحفيز العصب تحت الحمراء كبديل للالتحفيز الكهربائي في مجموعة من أنواع العصبية، بما في ذلك تلك المرتبطة بالنظام السمعي. يصف هذا البروتوكول طريقة المشبك التصحيح لدراسة آلية تحفيز العصب الأشعة تحت الحمراء في ثقافة من الخلايا العصبية السمعية الأولية.

Abstract

وقد ثبت في السنوات الأخيرة أن نابض، ضوء ليزر الأشعة تحت الحمراء يمكن استخدامها لانتزاع استجابات الكهربائية في الأنسجة العصبية، مستقلة عن أي تعديل آخر على النسيج المستهدف. تم الإبلاغ عن التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء في مجموعة متنوعة من الأنسجة العصبية الطرفية الحسية في الجسم الحي و، باهتمام خاص هو مبين في تحفيز الخلايا العصبية في العصب السمعي. ومع ذلك، في حين لم تظهر INS للعمل في هذه الأماكن، الآلية (أو الآليات) التي ضوء الأشعة تحت الحمراء يسبب الإثارة العصبية حاليا ليست مفهومة جيدا. بروتوكول المعروضة هنا يصف التصحيح خلية كاملة طريقة المشبك مصممة لتسهيل التحقيق في التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء في مثقف الخلايا العصبية السمعية الأولية. بواسطة تميز بدقة استجابة هذه الخلايا إلى إضاءة ليزر الأشعة تحت الحمراء في المختبر تحت ظروف خاضعة للرقابة، قد يكون من الممكن للحصول على فهم أفضل للفيزيكا الأساسيةL والعمليات الكيميائية الحيوية التي تقوم عليها التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء.

Introduction

مجالات الفسيولوجيا العصبية والطبية البيولوجية الالكترونية تعتمد بشكل كبير على التقنيات التي تسمح التحفيز يمكن السيطرة عليها من الاستجابات الكهربائية في الأنسجة العصبية. بينما التحفيز الكهربائي لا يزال المعيار الذهبي في الإثارة العصبية، أنها تعاني من عدد من السلبيات مثل وجود القطع الأثرية التحفيز عند تسجيل الاستجابات العصبية، وعدم وجود خصوصية التحفيز نظرا لانتشار الحالية إلى الأنسجة المحيطة ^1.

شهدت خلال العقدين الماضيين تطوير بصريا تقنيات التحفيز بوساطة ^2. العديد من هذه التقنيات تتطلب التعديل من الأنسجة المستهدفة، إما عن طريق إضافة جزيء معين (على سبيل المثال الجزيئات في قفص) ³ أو شكلا من أشكال التلاعب الجيني (على سبيل المثال optogenetics) ^4، لا من التي من السهل أن يطبق خارج إعداد البحوث. ذات أهمية خاصة لذلك هو التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء (INS)، wherebهو متحمس Y الأنسجة العصبية بواسطة نابض ضوء الليزر تحت الحمراء. INS لديه القدرة على التغلب على كثير من أوجه القصور في التحفيز الكهربائي من خلال تمكين محددة للغاية، والتحفيز وعدم الاتصال من الأنسجة العصبية ^2. ومع ذلك، فإنه بينما ثبت INS بنجاح في مجموعة متنوعة من إعدادات في الجسم الحي، وآلية دقيقة من الإثارة لا يزال غير مؤكد.

وقد أظهرت بعض المنشورات الحديثة التقدم نحو كشف آلية وراء INS ^5-7. التسخين السريع بسبب امتصاص ضوء الليزر من قبل الماء ويبدو أن تلعب دورا رئيسيا. ومع ذلك، وراء هذا الإجماع لم يتحقق بعد. شابيرو وآخرون. ⁷ اقتراح آلية عامة للغاية حيث يسبب التسخين السريع اضطراب في توزيع الجسيمات المشحونة المتاخمة لغشاء الخلية، مما يؤدي إلى تغيير في السعة من غشاء الخلية والاستقطاب اللاحقة. وبالإضافة إلى ذلك، ألبرت وآخرون. ⁵ يؤكدون أن عالج بالليزرR الناجم عن التدفئة ينشط فئة معينة من درجة الحرارة القنوات الأيونية الحساسة (مستقبلات عابر قنوات الأنانداميد المحتملة)، والسماح لتمرير الأيونات عبر غشاء الخلية. في هذه المرحلة ليس واضحا كيف الجمع بين هذه الآليات، أو في الواقع ما إذا كانت هناك عدة عوامل أخرى لا يزال يتعين تحديدها.

على الرغم من أن عدد قليل من المطبوعات (المراجع ^5،7-9) حققت INS في المختبر، وقد تم تنفيذ الغالبية العظمى من الأعمال المنشورة في هذا المجال في الجسم الحي (مثل المراجع ^{1،6،10-18).} وقد تم تحفيز الأشعة تحت الحمراء من الخلايا العصبية السمعية وهي منطقة ذات أهمية خاصة، نظرا لالتطبيقات المحتملة في زراعة قوقعة ^10،14-18. بينما في التجارب المجراة مهمة للتحقق من فعالية هذه التقنية في مختلف البيئات، وزيادة مستوى الرقابة التي يوفرها في الدراسات المختبرية ومن المتوقع أن يؤدي إلى فهم أكثر تفصيلا للالميكانيكيةanism المسؤولة عن INS. يصف هذا التقرير إعداد الخلايا العصبية مثقف العقدة الحلزونية للتحقيقات المشبك التصحيح، وهذه يمكن استخدامها لدراسة آليات الأساسية في سياق ربط أيضا إلى مجموعة كبيرة من البيانات الموجودة في الجهاز السمعي.

تقنية المشبك التصحيح هو أداة ممتازة لتحقيقات من الظواهر الكهربية، وتوفير وسيلة لتسجيل النشاط الكهربائي في الخلايا واحد ودراسة مساهمة التيارات الكامنة الفردية ^19. عندما يتم تطبيق هذه التقنية لمستقر في إعداد المختبر من الخلايا العصبية الأولية، مثل الخلايا العصبية مثقف العقدة الحلزونية، فإنه يوفر الفرصة للدراسة في عمق الآليات التي يتم التحكم النشاط العصبي والتلاعب بها.

البروتوكولات المحددة في هذا العمل أساليب مخطط للتحقيق في تأثير التحفيز الليزر على الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية العقدة الحلزونية من خلال التصحيح المشبكالتسجيلات. ويستند هذا النهج على الليزر الألياف الديناميكي بدلا من الليزر في الفضاء الحر، مما يسمح بتشغيل أكثر أمنا وكذلك أسهل وأكثر تكرار المواءمة دون الحاجة إلى تعديل تكوين المجهر القياسية. على أساس من هذه البروتوكولات، وينبغي أن يكون من الممكن إجراء مجموعة واسعة من التجارب من أجل تحديد أكثر وضوحا الآلية أو الآليات وراء INS.

Protocol

1. ثقافة من الخلايا العصبية العقدة الحلزونية

1. تعقيم جولة صغيرة (مثل 10 مم) coverslips الزجاج وملقط المنحني في الأوتوكلاف. نقل coverslips على تعقيمها في الآبار الفردية العقيمة 4 حلقة 35 مم طبق بتري أو لوحة 4 بشكل جيد، وذلك باستخدام ملقط معقم. تطبيق 150 ميكرولتر من بولي-L-الأورنيثين (500 ميكروغرام / مل)، والماوس laminin (0.01 ملغ / مل) على السطح العلوي للساترة ومكان في حاضنة (37 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 48 ساعة. تأكد من أن coverslips على لا تطفو بعيدا عن قاع البئر.
2. تحضير 50 مل سائل الإعلام Neurobasal العقيمة (مصرف مولدوفا الوطني) لكل ثقافة العصبية: 47.5 مل neurobasal A، 0.5 مل N ₂ الملحق، 1 مل B27 الملحق، 0.5 مل L-الجلوتامين، و 0.5 مل البنسلين، الستربتوميسين. ملاحظة: يمكن تجميد ملاحق، وتخزينها في -20 درجة مئوية، وأضاف أن وسائل الإعلام في اليوم المطلوب.
3. فصل الخلايا العصبية العقدة دوامة من بعد الولادة اليوم 4-7 الفئران الوليدة كما هو موضح سابقا ^20،21، لناجي على حد سواء الأنزيمية (0.025٪ التربسين و 0.001٪ الدناز I) والتقنيات الميكانيكية. الرجوع إلى Whitlon وآخرون. ²² وفييرا وآخرون. ²³ لإجراءات تفصيلية من دوامة العقدة ثقافة العصبية، أو باركر وآخرون ²⁴ لمظاهرة من العزلة عماد القوقعة.
4. نضح أي حل poly-L-ornithine/laminin المتبقية من coverslips على وتغسل لفترة وجيزة مع مصرف مولدوفا الوطني.
5. إضافة 150-200 ميكرولتر من العقدة الحلزونية فصل الخلايا العصبية التعليق على coverslips على ومكان في حاضنة (37 درجة مئوية، و 10٪ CO _2). ملاحظة: يمكن إعداد ما يصل إلى 20 coverslips على من متوسط ​​القمامة من 8 الفئران الوليدة.
6. بعد أربع ساعات الخلايا العصبية والطلاء، ونضح الحل لإزالة الحطام الخلية واستبدالها مع 150-200 ميكرولتر NBM الطازجة تحسنت. ملاحظة: قد تتطلب وسائل الاعلام التجديد اليومي لتجنب الجفاف.
7. عودة إلى coverslips على الحاضنة حتى المطلوبة للتسجيلات الكهربية. ملاحظة: دوامة نأتالثقافات الخلايا العصبية العقدة يمكن استخدامها لتجارب الكهربية بعد أربع ساعات وتفارق لمدة تصل إلى يومين بعد ذلك. ينبغي أن تؤخذ وقت في المختبر بعين الاعتبار خلال تحليل النتائج. تجديد مصرف مولدوفا الوطني كل 24-48 ساعة.

2. التحضير للتسجيلات المشبك التصحيح

1. إعداد الحلول
   1. داخل الخلايا (micropipette) الحل: 115 ملم K-غلوكونات، 7 ملم بوكل، 10 HEPES ملي، 0.05 ملم EGTA، 2 ملي نا ₂ ATP، 2 مم MgATP، 0.5 ملي نا ₂ GTP (ضبط درجة الحموضة إلى 7.3 مع KOH؛ ضبط إلى 295 mOsmol / كغ مع السكروز). تمرير حل من خلال مرشح العقيمة (0.2 ميكرون) وتقسم إلى 200 ميكرولتر مأخوذة ليتم تخزينها في -20 درجة مئوية حتى يوم تسجيل.
   2. خارج الخلية (حمام) الحل: 137 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 2 مم CaCl _2، 1 ملم MgCl _2، 10 HEPES ملي و 10 ملي الجلوكوز (ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم؛ التكيف مع 300-310 mOsmol / كغ مع السكروز) . يرصد هذا الحل في يوم التسجيل.
2. إعداد بال micropipettes تسجيل مع المقاومة من 2-6 MΩ. ونحن نستخدم CO ₂ الليزر ساحبة (P-2000؛ الادوات سوتر) والبورسليكات الزجاج (1.0 مم القطر الخارجي؛ 0.58 مم القطر الداخلي و 75 مم طول).
3. إعداد الليزر. ويهدف هذا البروتوكول للاستخدام مع الألياف يقترن الليزر، مثل 1،870 نانومتر الأشعة تحت الحمراء محفز العصب من OptoTech P / L. الألياف الضوئية المستخدمة للتسليم في ضوء تجاربنا هو 200/220 ميكرون الأساسية / الكسوة قطر الألياف السيليكا مع الفتحة العددية من 0.22 والموصلات FC-PC عند كلا الطرفين (AFW تقنيات MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). وقطعت الحبال التصحيح في نصف لإنتاج نوعين من أسلاك التوصيل المصنوعة من الألياف (أي connectorized في نهاية واحدة والمشقوق في الطرف الآخر). وقد نوقشت آثار الألياف الأساسية قطرها والفتحة العددية على الليزر التغيرات في درجات الحرارة التي يسببها بالتفصيل من قبل طومسون وآخرون. ²⁵
   1. يلتصق غيض من الألياف تسليم الضوء باستخدام التقنيات القياسيةوتأكد من أن الرأس الناتج هو من نوعية عالية عن طريق الملاحظة مع المجهر الضوئي (أي طرف يجب أن يكون عمودي على محور الألياف وتظهر مسطحة على الفحص البصري). توصيل الألياف تسليم ضوء لإخراج الألياف الديناميكي ليزر التحفيز باستخدام المناسبة من خلال موصل (مثل Thorlabs ADAFC2).
   2. قياس قوة الليزر الإخراج من طرف المشقوق من الألياف تسليم الضوء باستخدام أداة مناسبة (مثل FieldMate متماسك مع LM-3 كاشف الرأس). فمن المستحسن للتحقق من قوة الليزر في كل مرة يتم المشقوق الألياف تسليم ضوء أو يتم إجراء تعديل كبير ليزر (مثل النقل من مختبر واحد إلى آخر).
   3. إدراج ضوء الألياف التسليم في ظرف الألياف أو جهاز ما يعادلها ويضعوا تشاك لmicropositioner المناسبة. من المهم أن تكون قادرا على تحديد دقيق لزاوية θ أن الألياف البصرية يجعل مع ساترة. هذا ANGLويمكن قياس ه عن طريق أخذ صورة فوتوغرافية للترتيب التجريبية واستخدام برامج معالجة الصور (مثل يماغيج) للحصول على زاوية. زاوية θ (أو مجموعة من الزوايا الممكنة) مقيدة في المقام الأول عن طريق القيود المكانية للترتيب التجريبية - ولا سيما المجهر. القيم النموذجية من θ في تجاربنا (على أساس المجهر تستقيم) هي حوالي 36 درجة مئوية، إلا أن أفضل زاوية قد تختلف اختلافا كبيرا عن الاجهزة البديلة (مثل تلك التي تستخدم مجهر مقلوب).
   4. إجراء اتصالات بين الليزر ونظام الحصول على البيانات المشبك التصحيح (على سبيل المثال Digidata 1440A، الأجهزة الجزيئية) كما هو مبين في الشكل 2. يجب أن تكون متصلا الإخراج الرقمي من المشبك نظام الحصول على البيانات التصحيح إلى ليزر عن طريق مولد وظيفة خارجية، مما يجعل من الممكن تحديد معلمات نبضة ليزر مستقلة عن نظام الحصول على البيانات. وبدلا من هذا الناتج يمكن ان تكون مرتبطة مباشرة إلىالسائق الليزر (التي تتطلب طول النبض ومعدل التكرار سيتم تعيينه من قبل البرنامج الحصول على البيانات). في كلتا الحالتين، إشارة تستخدم لتحريك الليزر يجب أن تكون متصلا العودة الى مدخلا لنظام الحصول على البيانات للتأكد من أن توقيت وطول نبضات الليزر يمكن تسجيلها بالتزامن مع إشارة الكهربية.

3. تسجيلات المشبك التصحيح لمباحث من INS

1. ملء الحاويات المناسبة لنظام نضح مع حل خارج الخلية وضبط معدل تدفق لتوفير نضح من الحمام بمعدل 1-2 مل / دقيقة. ونحن نستخدم بالجاذبية نظام (زجاجة الشافطة، صمام قرصة، وأنابيب PE) مع سخان في خط لتمكين التسخين السريع من الحل، ومضخة تحوي لإزالة حل قضى عن طريق الشفط.
2. وضع ساترة مع الخلايا المستزرعة في غرفة تسجيل (حمام) من المجهر تستقيم. باستخدام التكبير عالية الهدف الغمر بالمياه (هز. 40X) وعلى النقيض من المرحلة (مثل الفرق المقابل تدخل أو Dodt النقيض التدرج)، حدد موقع بصريا الخلايا العصبية العقدة الحلزونية داخل الثقافة. نموذجي دوامة الخلايا العصبية العقدة هي مرحلة مشرق، جولة، وحوالي 15 ميكرون في القطر مع نواة بارزة، كما هو مبين في الشكل 1A.
3. مرة واحدة وقد يقع على الخلايا العصبية، والتحول إلى هدف التكبير أدنى (مثل 10X) وتحديد موقع الخلايا العصبية المستهدفة في المجال البصري.
4. نقل الألياف البصرية ضوء التسليم في موضعه باستخدام الإجراء التالي (أو ما يعادلها):
   1. استخدام micropositioner لتحريك الألياف الانتاج حتى غيض على مقربة من الخلايا العصبية المستهدفة في كل من الطائرات الأفقية والعمودية. يمكن التحقق من الوضع الرأسي من غيض من الألياف عن طريق تحريك الهدف صعودا وهبوطا (مسح التركيز).
   2. التبديل إلى هدف تضخم عالية ووضع غيض من الألياف البصرية في موقفها المقصود بجانب روقال انه الخلايا العصبية (انظر الشكل 2 الشكل). عند ضبط الوضع الرأسي من الألياف، فمن المهم أن الحافة السفلى من الألياف يوضع على (أي مجرد لمس) ساترة، للحد من عدم اليقين في الموقع من الألياف. سوف محاذاة الأمثل في المستوى الأفقي تعتمد على زاوية θ أن الألياف يجعل مع ساترة ونصف قطر R الألياف. من أجل وضع الألياف بحيث أن مركز الخلايا العصبية المستهدفة تقع على طول محور الألياف، وينبغي أن المسافة الأفقية بين الحافة العلوية من الألياف والخلايا المستهدفة هي
      Δ _الهدف = R (cosec θ - θ 2 الخطيئة)،
      حيث القيم السلبية من شأنه أن يشير إلى أن يتدلى الألياف الضوئية الخلية. عند محاذاة الألياف، وعلى مسافة Δ _الهدف بين الحافة العلوية من الألياف ومركز الخلايا العصبية يمكن أن يتحقق تقريبا عن طريق التفتيش البصري. ومع ذلك تم تصميم Δ _الهدف إلىبمثابة المبدأ التوجيهي الخام فقط. يمكن تحديد المواقع على الألياف مثل أن المسافة الفعلية Δ بين الحافة العلوية من الألياف ومركز الخلايا العصبية يختلف بشكل ملموس من Δ _الهدف (كما في الشكل 1) توفير نظرة ثاقبة على تأثير كل من التشرد شعاعي (أي من وسط شعاع) ومحوري النزوح (أي على طول محور الألياف) من الحزم نسبة إلى الخلايا العصبية المستهدفة. على سبيل المثال، وضع Δ ≈ 0 ومن المتوقع أن زيادة درجة الحرارة المحلية في المنطقة المجاورة للخلية - أي منذ الشخصي شعاع للألياف المتعدد نموذجية ويقترب بشكل جيد من قبل توزيع قبعة ^26، وانخفاض في الطاقة الممتصة محليا (درجة الحرارة) بسبب النزوح من مركز شعاع هو الحد الأدنى بالمقارنة مع الزيادة في الطاقة الممتصة من تحريك الوجه نهاية الألياف أقرب إلى الخلية.
      في حين ينبغي الحرص على وضع الألياف بدقة وrepeatably كما صssible باستخدام الإشارات البصرية، قياس دقيق للموقع الألياف بالنسبة إلى الهدف الخلايا العصبية (مثل Δ) هو أكثر أهمية من تحديد المواقع على مسافة محددة سلفا بعيدا. Δ يمكن تحديد (مع أقصى قدر من عدم اليقين المقدرة ± 3 ميكرون) من خلال تحليل الصور كما هو موضح في الخطوة 3.8.2 من البروتوكول. في بعض التجارب ^5،8، وقد اقترن مصادر الضوء الأبيض من خلال الألياف من أجل استهداف الخلايا المطلوبة. تم العثور على هذا النهج إلى أن تكون غير فعالة في الإعداد المجهر تستقيم، كما كان شدة الضوء المتناثرة من المنطقة المستهدفة منخفضة نسبيا في هذه الزوايا الضحلة (θ).
   3. وبمجرد أن الألياف هو في الموقف، وتحريكه بها كمية المعروف لتمكين تحديد المواقع مباشرة من micropipette. ويمكن بعد ذلك عاد الألياف إلى وضعه الأصلي عندما يتم التوصل إلى تسجيل العصبية.
5. ملء micropipette مع حل داخل الخلايا ويصلح في مكان آمن على رؤوسالمئوية من مكبر للصوت (على سبيل المثال Multiclamp 700B، الأجهزة الجزيئية). باستخدام أنابيب موصولة إلى جانب حامل مسرى مكروي، تنطبق على كمية صغيرة من الضغط الايجابي لمنع انسداد من micropipette.
6. باستخدام مياداة مجهرية، حرك micropipette في موقف فقط فوق الخلايا العصبية المستهدفة.
7. بروتوكول للتسجيلات خلية كاملة:
   1. تطبيق 10 ميللي ثانية، +10 بالسيارات مربع موجة النبض (على سبيل المثال اختبار الختم) في وضع الجهد المشبك من مكبر للصوت وضبط المحتملة micropipette (ماصة الأوفست) للإشارة إلى خط الأساس 0 NA. وينبغي أيضا اختبار ختم استخدامها لتحديد ما إذا كانت المقاومة من مسرى مكروي هو ضمن النطاق المطلوب (على سبيل المثال 2-6 MΩ).
   2. في حين رصد المقاومة، واستخدام التعديلات غرامة من مياداة مجهرية لوضع بلطف micropipette على سطح الخلايا العصبية المستهدفة. عندما micropipette في اتصال مع الخلايا العصبية، وزيادة مقاومة (من قبل ~ 0،5-1 MΩ). أنابعد mmediately زيادة المقاومة، وإزالة ضغط السائل إيجابية وتطبيق الضغط السلبي الصغيرة. مرة واحدة وقد مرت المقاومة 10-20 MΩ، إصلاح غشاء المحتملة إلى مستوى عقد (على سبيل المثال حوالي -60 بالسيارات).
   3. ينبغي أن تستمر المقاومة الكهربائي لزيادة حتى أنه يتجاوز 1 GΩ، مما يدل على أن ختم فعالة (وهو ما يسمى 'gigaseal') وقد تم تشكيل بين غشاء الخلية وmicropipette. في هذه المرحلة، وإزالة كل ضغط السائل من micropipette.
   4. مرة واحدة وقد تم تشكيل gigaseal، استخدم البقول الحالية قصيرة (25-100 μsec؛ +1 V) أو نبضات قصيرة من ضغط السائل السلبية إلى تمزق غشاء الخلية وتحقيق تكوين خلية كاملة.
   5. تسجيل السعة الغشاء، سلسلة المقاومة والمقاومة الإدخال كما هو محدد من منحنى أسي تركيبها على التيار أثناء الاختبار نبض الختم. التقليل من السعة العابرين عن طريق ضبط الضوابط CpFast وCpSlow على مكبر للصوت، ثم switcويلاحظ ح مكبر للصوت في وضع خلية كاملة، وتعويض السعة والمقاومة حتى تيار شقة أثناء الاختبار ختم. تطبيق سلسلة المقاومة التعويض (~ تصحيح 70٪؛ التنبؤ 70٪)، وتعديل الضوابط السعة والمقاومة للحفاظ على اختبار شقة استجابة الختم.
   6. التبديل إلى الوضع الحالي، المشبك في مكبر للصوت. يحيط علما غشاء المحتملة يستريح (في حالة عدم وجود الحقن الحالية). تعيين الحالية عقد لتحقيق الاستقرار في غشاء المحتملة على المستوى المطلوب (على سبيل المثال -60 بالسيارات). تحييد السعة ماصة وضبط توازن جسر لتحقيق التوازن بين انخفاض الجهد.
   7. تحقق من خصائص إطلاق الخلايا العصبية من خلال تحفيز إزالة إستقطاب مع الحالي (10-200 السلطة الفلسطينية في +10 خطوات السلطة الفلسطينية؛ 300 ميللي ثانية مدتها).
8. 1. نقل مرة أخرى الألياف البصرية إلى موقف المقبل إلى الخلايا العصبية. باستخدام برامج التصوير بالإضافة إلى كاميرا CCD، والتقاط الصور للموقف من الألياف فيما يتعلق العصبية المستهدفةن، مع التركيز على الطائرة من الخلايا العصبية في البداية، ومن ثم على الحافة العلوية من الألياف الضوئية (انظر الشكل 1).
   2. من خلال تحليل لاحقة من الصور الناتجة (على سبيل المثال أرقام 1B و 1C) فمن الممكن ان يحدد بدقة Δ (موقف الحافة العلوية من النسبية الألياف البصرية إلى مركز الخلايا العصبية المستهدفة). مرة واحدة ومن المعروف Δ، معلمات مثل المسافة من على وجه نهاية الألياف إلى الخلايا العصبية المستهدفة (على طول محور الألياف) Z وتشريد شعاعي من الخلايا العصبية من مركز شعاع δ R يمكن حسابها باستخدام العلاقات المثلثية بسيطة:
      Z = R + Δ الخطيئة 2θ COS θ
      δ R = ((ص كوس 2θ - Δ θ الخطيئة) ² + δy ^{2) 1/2،}
      حيث δy هي المسافة بين محور الألياف ومركز الخلايا العصبية كما يرى من أعلاه (على سبيل المثال SEه الشكل 1).
      التحليل ينبغي أن تأخذ في الاعتبار الاختلافات الموضعية من خلية إلى أخرى، ما قد يلزم معرفة دقيقة من هذه المعلمات الموقع إلى حل الخلافات المحتملة بين عمليات التحفيز ^25.

4. تجارب INS

1. في حين تم تسجيل البيانات الكهربية في إما المشبك الحالية أو تكوينات المشبك الجهد، وتشغيل الليزر في تحفيز المعلمات المطلوب (على سبيل المثال الطاقة، طول النبض، ومعدل تكرار الخ). مع الليزر لدينا، يتم التحكم في الطاقة الضوئية عن طريق المساهمة المباشرة للسائق ليزر ويتم تحديد يدويا قبل كل تسجيل. يمكن التحكم طول النبض ومعدل تكرار إما عن طريق مولد إشارة خارجية أو البرنامج الحصول على البيانات (كما هو موضح في الخطوة 2.3.4). ضمان أن يتم تسجيل البيانات من كل من قناة المشبك التصحيح وقناة الزناد الليزر.

نبضات الليزر بأطوال تتراوحمن حوالي 500 μsec إلى 15 ميللي ثانية وطاقات ~ ،25-5 ميغا جول في النبضة عادة تسفر الردود الكهربائية قابلة للقياس. تحديد معدل تكرار نبضات الليزر أن يكون 1 هرتز أو أقل قد تكون مفيدة للالتجارب الأولية، لأنه سوف تقليل من آثار هذه المعلمة. يتم عرض النتائج نموذجي يبين التغيير في الإشارات المسجلة في القسم التالي.

النتائج

الخلايا العصبية العقدة الحلزونية الرد على الليزر الإضاءة مع تكرار الطول الموجي في كلا الجهد المشبك وتكوينات تسجيل الجاري المشبك. يبين الشكل 3A تغييرات نموذجية في تدفق التيار عبر غشاء الخلية استجابة ل2.5 ميللي ثانية، 0.8 ميغا جول ليزر النبض (متوسط ​​استجابة من...

Discussion

باستخدام البروتوكولات المذكورة في هذه الورقة أنه من الممكن استخراج والثقافة دوامة الخلايا العصبية العقدية والتحقيق الليزر أثار النشاط الكهربائي قبل تنفيذ كامل الخلية التصحيح التجارب المشبك. عندما تستخدم في المختبر، ويوفر تقنية المشبك التصحيح مستوى من السيطر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips	Lomb Scientific	CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish	VWR International	82050-542
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957
Laminin	Invitrogen	23017-015
Curved forceps	WPI	14101	Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator	ThermoScientific	Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A	Gibco	10888-022
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048
B27 serum-free supplement	Invitrogen	17504-044
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-148
L-Glutamine	Invitrogen	25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Potassium D-gluconate	Sigma-Aldrich	G4500
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
Potassium hydroxide	LabServ	BSPPL738.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	310166
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	383147
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sodium hydroxide	LabServ	BSPSL740.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope	Zeiss	AxioExaminerD1	Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective	Zeiss	W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage	ThorLabs	Burleigh Gibraltar
Recording chamber	Warner Instruments	RC-26G
Vibration isolation table	TMC	Micro-g 63-532
CCD Camera	Diagnostic Instruments	RT1200
Camera software	Diagnostic Instruments	SPOT Basic
In-line solution heater	Warner	SH-27B
Temperature controller	Warner	TC-324B
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Micropipette glass	Sutter Instruments	GBF100-58-15	Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P2000
Recording Software	AxoGraph		Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle	Sigma-Aldrich	CLS12201L	1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing	Harvard	PolyE #340
Masterflex peristaltic pump	Cole-Parmer	HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode	Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC)	AFW Technologies	MM1-FC2-200/220-5-C-0.22	Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC)	Thorlabs	ADAFC2
Optical fiber cleaver	EREM	FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm)	Siemens		For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm)	Siemens		For removing outer coating of patch cord
Signal generator			Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner			Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck	Newport	FPH-DJ
Laser power meter and detector head	Coherent	FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.