JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقل الجينات الفيروسة الغدانية إلى الخلايا التائية CD4 السذاجة مع التعبير المعدلة وراثيا من مستقبلات اتش كوكساكي يتيح للتحليل الجزيئي للالتنظيمية تمايز الخلايا T في المختبر.

Abstract

الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) ضرورية لتوفير التسامح المناعي في تقرير المصير، وكذلك لبعض المستضدات الخارجية. يمكن أن تتولد Tregs من السذاجة خلايا CD4 T في المختبر مع TCR وشارك في التحفيز في وجود TGFβ وIL-2. هذا يحمل إمكانات هائلة لعلاجات المستقبل، ومع ذلك، فإن الجزيئات ومسارات الإشارات التي تمايز التحكم غير معروفة إلى حد كبير.

يمكن التلاعب بها الخلايا التائية الأولية من خلال التعبير الجيني خارج الرحم، ولكن تفشل الطرق الشائعة لاستهداف الدولة السذاجة أهم من الخلية T قبل الاعتراف مستضد الأولية. هنا، ونحن نقدم بروتوكول للتعبير عن الجينات خارج الرحم في السذاجة خلايا CD4 T في المختبر قبل إحداث تمايز Treg. وهو ينطبق تنبيغ مع اتش النسخ المتماثل التي تعاني من نقص ويشرح جيل والإنتاج. واتش يمكن أن يستغرق إدراج كبيرة (تصل إلى 7 كيلو بايت) ويمكن أن تكون مجهزة مع المروجين لتحقيق overexp عالية وعابرةression في الخلايا التائية. فإنه transduces فعال السذاجة خلايا T الماوس إذا كانت تعبر عن المعدلة وراثيا كوكساكي مستقبلات الفيروس الغدي (CAR). الأهم من ذلك، بعد الإصابة تبقى الخلايا التائية السذاجة (CD44 المنخفضة، وارتفاع CD62L) ويستريح (CD25 -، CD69 -) ويمكن تفعيلها ومتباينة في Tregs مماثلة لخلايا غير المصابة. وبالتالي، تمكن هذه الطريقة من التلاعب CD4 T تمايز الخلايا من بدايتها. أنه يضمن التعبير الجيني خارج الرحم هو بالفعل في المكان عندما الأحداث يشير في وقت مبكر من التحفيز TCR الأولي يدفع التغيرات الخلوية التي تؤدي في نهاية المطاف إلى Treg التمايز.

Introduction

Tregs حاسمة للحفاظ على التسامح المناعي وكبح الاستجابات المناعية المبالغة. Tregs قمع المارة تنشيط الخلايا T. ونتيجة لذلك، الاجتثاث من Tregs يؤدي إلى المناعة الذاتية القاتلة والتدمير الذاتي مدفوعا تنشيط خلايا T 1. Tregs تطوير في الغدة الصعترية خلال اختيار السلبية للCD4 السلائف إيجابية واحدة، ولكنها يمكن أيضا التفريق في محيط من السذاجة الخلايا CD4 T على جرعة منخفضة من التحفيز مستضد مع الأمثل 1،2 المشترك التحفيز. الغدة الصعترية Tregs يبدو لقمع المناعة الذاتية أنسجة ضد المستضدات عن النفس، في حين قد تورطت الطرفية Tregs في توفير التسامح في القناة الهضمية أو سرطان الرئة. هذه يسببها Tregs منع أكثر قدرة تنشيط الخلايا T بعد الاعتراف مستضدات الخارجية في الغشاء المخاطي، بما في ذلك مستضدات البيئية من الغذاء والهواء والبكتيريا المتعايشة، والمواد المسببة للحساسية 3،4. وبالإضافة إلى ذلك، Tregs حاسمة لإقامة التسامح الأمهات إلى الببتيدات الجنين 5 وإلى ما قبلتنفيس مرض الطعم ضد المضيف 6. في نفس الوقت، Tregs أيضا توسط آثار غير مرغوب فيها من قبل المخففة المراقبة المناعة من الخلايا السرطانية 7،8. ميزة السمة المميزة للTregs هو تعبير عن مجموعة فرعية-تحديد النسخ عامل Foxp3، وهو عامل شوكة الرأس النسخ المحتوية على نطاق ما هو ضروري وكاف لمنح وظيفة Treg 9،10. ومن المعروف أن بعض مسارات الإشارات التي يمكن أن تحفز التعبير Foxp3. ومع ذلك، فإن العمليات الجزيئية التي تتحكم، وتنظيم، أو تعدل Treg التمايز ردا على مستقبلات الخلايا T اثار مفهومة بشكل أقل.

يمكن على نحو فعال للغاية أن يتسبب Tregs في المختبر من خلال تحفيز السذاجة الخلايا التائية CD4 مع الأجسام المضادة لمكافحة CD3 ومكافحة CD28 في حضور TGFβ وIL-2 11. كما Tregs الناشئة وظيفية في الجسم الحي، والتلاعب من الجزيئات التي تعزز تمايز Treg يحمل إمكانات هائلة لمستقبل therapiوفاق، على سبيل المثال، علاج الربو، مرض الاحساس، وزرع 11،12. على العكس، قد التشكيل العلاجية من الجزيئات لمنع التمايز Treg تقدم فائدة في توجهاته المستقبلية من الجمع بين العلاج من مرضى الأورام.

في فحوصات المختبر تمايز كان لها دور أساسي لوصف التغيرات الجزيئية التي ترتبط مع الخلايا التائية التمايز فرعية. في هذه اللحظة، ومحاولات تجريبية للبحث أو شاشة للمنتجات الجينات التي تتحكم في تمايز الخلايا T يصطدمون بحقيقة أن الأساليب الأكثر شيوعا لحمل خارج الرحم التعبير الجيني في الخلايا T تفشل السذاجة. على سبيل المثال، electroporation وتنبيغ فيروسات الرجعية لا تكون فعالة إلا في تنشيط خلايا تي. وعلى النقيض من التوقعات الأولية، تنبيغ lentiviral، وهو فعال عادة في خلايا يستريح، يتطلب قبل تنشيط خلايا T السذاجة بواسطة السيتوكينات 13. وعلاوة على ذلك، ونقل [كدنا] أو مرنا خلال electroporationينطوي على إزالة الاستقطاب لغشاء البلازما، التي تمنح نفسها ملامح تنشيط الخلايا T وربما حتى تعبئة كا 2 + إشارات وتنشيط بروتينات NFAT (المراقبة غير منشورة والمرجع 14). وبالمثل، لتنبيغ فيروسات الرجعية، وخلايا T السذاجة أن يتم تفعيلها ل18 - 40 ساعة. خلال هذا الوقت، وانهيار الغشاء النووي في سياق انقسام الخلية يحدث ويسمح لإدماج الجيني لاحقة من ناقلات فيروسات الرجعية 15. ولذلك فإن هذه الأساليب ليست قادرة على معالجة تنظيم الجزيئية في وقت مبكر من اللقاء الأولي مع مستضد الخلايا التائية، وهي مرحلة حاسمة من المساعد T تمايز الخلايا.

ومن المعروف تنبيغ الفيروسة الغدانية للتشاور عابرة خارج الرحم التعبير الجيني في عدد من أنواع الخلايا البشرية التي تعبر عن الإنسان كوكساكي مستقبلات الفيروس الغدي (CAR). وتشرع دون الحاجة إلى تنشيط الخلايا أو تقدم دورة الخلية. التعبير سطح CAR أمر ضروري لكفاءة مرفق فيروس واستيعاب، والتعبير المعدلة وراثيا من النسخة اقتطاع CARΔ1 تحت المروج خلية محددة T وجد لتقديم thymocytes الماوس والخلايا T عرضة للإصابة الغدانية 16. الأهم من ذلك أن التحوير لا يغير تطوير خلية توتية أو التمايز في المختبر من خلايا CD4 السذاجة الخلايا التائية إلى مجموعات فرعية مختلفة (لا تظهر البيانات؛ المرجع 17). تنبيغ اتش بوساطة الخلايا T كانت تستخدم سابقا لمن overexpression 17،18 واضعا إلى أسفل النهج 19،20. يمكن تنقية الخلايا T المعدلة وراثيا من المتاحة تجاريا DO11.10 TG؛ CARΔ1 TG (تاكونيك، وشركة والمرجع 17). الأهم من ذلك، تنبيغ الفيروسة الغدانية يسمح التعبير عالية من الجين من الفائدة في الخلايا التائية السذاجة دون التسبب علامات واضحة على التنشيط. تبقى الخلايا التائية السذاجة (CD44 المنخفضة، وارتفاع CD62L) ويستريح (CD25 -، CD69 -) بعد infectiفي ويمكن تفعيلها ومتباينة في Treg مماثلة لخلايا غير المصابة.

ويمكن تحقيق إنتاج الفيروسات الغدية المؤتلف بعد ترنسفكأيشن من الخلايا HEK293A مع البلازميدات الغدانية (الشكل 1). تحتوي هذه البلازميدات عادة نوع الإنسان 5 الجينوم اتش مع الجينات وE1 E3 حذف لتقديم الفيروسات الغدية المؤتلف النسخ المتماثل غير كفء 21. الخلايا HEK293A تكمل نقص النسخ المتماثل كما تم خلدت أنها من خلال التكامل مستقرة من اتش المنفصمة 22. منذ ناقلات الفيروسة الغدانية كبيرة (~ 40 KB) وبالتالي لا مناسبة تماما لقيود التقليدية استنساخ انزيم بوساطة، قمنا بتوظيف النظام عبارة. يتم استنساخ الجينات في المصالح البداية إلى ناقلات دخول أصغر، من التي يمكن نقلها بسهولة إلى ناقلات الوجهة الغدانية عبر امدا رد فعل إعادة التركيب (LR) 23. اقمنا في pCAGAdDu ناقلاتمن خلال الجمع بين المروج CAG (الدجاج المروج الأكتين وCMV محسن) مع كاسيت التعبير التي تحتوي على مواقع LR المرافقة اختيار ccdB بدائي النواة علامة 24. وتنصهر هذه كاسيت التعبير إلى موقع الريبوسوم دخول الداخلي (IRES) العنصر الذي يسمح coexpression للعدوى علامة تعزيز الخضراء بروتين فلوري حقيقية النواة (EGFP)، والتي تنصهر لتسلسل يحتوي على هرمون النمو البقري بولي (A) إشارة. اخترنا تسلسل رابطة الدول المستقلة التنظيم CAG، منذ تم العثور على CMV المروج prototypic أن تكون غاية التي تعتمد على تفعيل وبالتالي غير المواتية للتعبير الجينات في الخلايا التائية السذاجة.

هنا، ونحن نقدم بروتوكول للكفاءة في المختبر Treg التمايز وطريقة لتنبيغ CD4 خلايا تي ساذجة دون تفعيل (الشكل 2). طريقة تمكن خارج الرحم التعبير الجيني أو نهدم CD4 T السابقة تمايز الخلايا في حالة السذاجة. لأنها تتيح اختبار تأثير من overexpresseد الجينات في المصالح أثناء الأحداث يشير في وقت مبكر على التحفيز TCR الأولية حتى T التزام فرعية الخلية. كما توفر التجارب التحقق من صحة لدينا أساس لإنشاء تطبيق اتش مماثلة في التفريق بين مجموعات فرعية أخرى T خلية مثل TH1، TH2، Th9، TH17، Th22، أو خلايا TFH.

Protocol

1. استنساخ الجين من الاهتمام إلى متجه الدخول

  1. استنساخ الجين من الاهتمام إلى متجه دخول. PCR التضخيم من الجينات تليها ربط حادة في نهاية إلى ناقلات topoisomerase يقترن (على سبيل المثال pENTR / D-TOPO) أو تقييد انزيم بوساطة الاستنساخ يمكن استخدامها لهذا الإجراء.

2. نقل الجينات في المصالح في pCAGAdDu الوجهة المتجهات

  1. نقل الجينات في المصالح من ناقلات دخول ناقلات الوجهة التي كتبها LR إعادة التركيب (على سبيل المثال عبارة LR Clonase الثاني إنزيم ميكس). هذا سيخلق متجه التعبير الغدانية (الشكل 1).
  2. خطي 10 ميكروغرام من ناقلات التعبير الغدانية في باتشي تقييد هضم، ترسيب الحمض النووي و resuspend في الماء بتركيز قدره 3 ميكروغرام لكل 100 ميكرولتر. الخطية يحرر يكرر مقلوب الفيروسي (ITR)، وهي مطلوبة من أجل النسخ المتماثل وencapsidation من الخامسالحمض النووي iral الى جزيئات الفيروس.

3. جيل من الفيروسات المحللة الابتدائية

  1. البذور 1 × 10 5 خلايا HEK293A في 2 سائل الإعلام والثقافة الخلية مل (DMEM، و 10٪ FBS، 5٪ PenStrep) في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا واحتضان الخلايا لمدة 6-14 ساعة عند 37 درجة مئوية في 10٪ CO 2 حاضنة للسماح لهم الانضمام. خلايا ينبغي أن يكون ثم إلى حوالي 50٪ confluency.
  2. Lipofection: نقل 6 ميكرولتر من كاشف jetPEI في 94 ميكرولتر من 50 ميكرومتر كلوريد الصوديوم، لفترة وجيزة الدوامة. إضافة الحل المختلط إلى 100 ميكرولتر خطي ناقلات اتش بينما vortexing لواحتضان هذا المزيج ترنسفكأيشن لمدة 15 - 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

تنفيذ كافة الخطوات التالية وفقا للشروط السلامة الأحيائية المناسبة لعدوى اتش!

  1. الاستغناء الحل نقطه نقطه على الخلية التي تحتوي على HEK293A جيدا واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 10٪ CO 2. عند استخدام علامة مضان، وتقييم حوالةكفاءة كشن بصريا بعد 12-36 ساعة باستخدام المجهر مضان مقلوب. إضافة 0.5 مل من المتوسط ​​الطازج كل 3 أيام.
  2. تحقق كل 2-3 أيام مع المجهر ضوء أو مضان للآثار الاعتلال الخلوي (CPE)، والتي هي مناطق ذات الخلايا الموسع وتقريبه أن تبدأ في فصل. هذا يدل على جيل فيروس فعالة. عند حدوث مناطق أوسع من CPE (الشكل 3)، وسوف يستغرق 24-72 ساعة قبل أن يتم إصابة جميع الخلايا.
  3. عندما يظهر كل الخلايا علامات CPE، ولكن قبل حدوث انفصال الكلي للخلايا، فصل الخلايا طيف من قبل pipetting ونقل الخلايا مع طاف (SN، 3-5 مل) إلى أنبوب البوليسترين 15 مل.
  4. تجميد الخلايا في SN على الجليد الجاف لمدة 15 - 20 دقيقة، وذوبان الجليد منها بسرعة عند 37 درجة مئوية بعد ذلك إلى تمزق الخلايا. كرر هذا التجميد والذوبان دورة (F / TC) مرتين أخريين. إبقاء المحللة فيروس الأولية على الجليد للاستخدام في غضون يوم أو تجميده عند -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. أي F إضافية/ TC سوف يقلل من عيار الفيروس بنسبة 30 - 50٪.

4. التضخيم فيروس

  1. البذور وتنمو الخلايا HEK293A إلى 90٪ التقاء على طبق سم زراعة الأنسجة 14.
  2. تصيب الخلايا مع نصف المحللة فيروس الابتدائي (1،5-2،5 مل)، واحتضان الخلايا لمدة 36 ساعة على الأقل. تقريبا يجب أن يصاب كل الخلايا ثم، والذي يمكن تحديده عن طريق الفحص المجهري مضان. لإعادة التضخيم من الأسهم تضخيم بالفعل (أي أكثر تركيزا) الفيروس، تصيب HEK293A في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 50 (انظر 6.3).
  3. وينبغي أن تحصد الخلايا عند كل منهم تظهر CPE ولكن قبل مفرزة. مع إنتاج فيروس فعال يتم التوصل إلى هذه الدولة في غضون 48 ساعة بعد الإصابة. (وإذا كان يستغرق فترة تصل إلى أسبوع واحد، والنظر في جولة أخرى من التضخيم عن طريق زيادة كمية من الأوراق المالية اتش تستخدم لإصابة وصفها في 4.2.)
  4. فصل الخلايا طيف من قبل pipetting ونقل الخلايا وSN إلى أنبوب البوليسترين 50 مل. تدور أسفل الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  5. إزالة SN و resuspend بيليه في حجم مناسب من المتوسط ​​أو SN (حوالي 1 مل).
  6. تنفيذ 3 F / TC إلى تعطيل الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. خلع SN الذي يحتوي على جزيئات الفيروس (أي المحللة فيروس مركزة)، وقسامة المحللة فيروس لتخزينه في -80 درجة مئوية.

5. فيروس عيار تقدير

  1. البذور 10 5 خلايا لكل بئر A549 إلى 5 آبار من لوحة 12 أيضا في 1 مل المتوسطة والسماح خلايا الالتزام لمدة 6 ساعة.
  2. استخدم 1 ميكرولتر من اتش المركزة (إذابة على الجليد) لتنفيذ التخفيف المتسلسل في المتوسطة (1:5،000، 1:10،000، 1:50،000، 1:100،000) وإضافة 10 ميكرولتر لكل بئر. ترك واحد غير مصاب جيدا لضبط النابضة في التدفق الخلوي.
  3. بعد 36 ساعة، خلع SN، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وفصل (مثلا عن طريق trypsinization). لاحتياطات بيولوجية، فمن المستحسن لإصلاح جells في 100 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وغسل مع PBS وقت واحد.
  4. إجراء تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية من عدوى التعبير علامة. مؤامرة 'ميكرولتر المحللة الفيروسية تطبيق' ضد العدد المطلق للخلايا المصابة (الشكل 4). تحديد مجموعة خطية من العدوى وحساب عيار لكل مل من فيروس مخفف من المنحنى القياسي على نطاق الخطية باستخدام X = 1،000 ميكرولتر.

6. T عدوى الخليوي

  1. عزل ساذج / يستريح CD4 خلايا تي من DO11.10 TG؛ الفئران TG CARΔ1 تستخدم أجهزة ماكينتوش (CD4 + T ساذج زنزانة انفرادية كيت II) أو نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز (CD4 + CD25 + CD44-CD62L-).
  2. للتجارب على نطاق صغير، ماصة حجم مناسب من المحللة الفيروسية لتحقيق وزارة الداخلية من 50 إلى بئر واحدة من لوحة أسفل لمدة 96 جولة جيدا.
  3. تضيف ما يصل إلى 4 × 10 5 خلايا T في حجم الإصابة النهائي من 50 ميكرولتر في T المتوسطة الخلية (RPMI1640، و 10٪ FBS، PenStrep 5٪، 5٪ NaPyruvate، 1X NEAA، 1X MEM الأساسيةفيتامين، 1X L-الجلوتامين، 1:250،000 المركابتويثانول، 10 HEPES ملم).
    على سبيل المثال:
    وزارة الداخلية من 50 يجب أن تستخدم للتصيب 3 × 10 5 خلايا T؛ عيار الفيروسي هو 3 × 10 9 مل -1
    حجم الفيروس وزارة الداخلية = س T عدد الخلايا / عيار الفيروسية = 50 × (3 × 10 5) / (3 × 10 9 مل -1) = 0.005 مل

ملاحظة: بالنسبة للإصابة أعداد أكبر خلية، حتى باستخدام نطاق وزارة الداخلية من 50 في حجم إصابة 165 ميكرولتر لكل 10 6 خلايا T السذاجة في أنبوب البوليسترين مع كوب فضفاض (ما يصل TP 3 مل لكل أنبوب).

  1. احتضان الخلايا لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
  2. تدور باستمرار الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وخلع SN، في resuspend 200 ميكرولتر PBS. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وخلع SN.

(اختياري: الخلايا قد يتم غسلها مرة أخرى لإزالة الفيروس بشكل أكثر كفاءة)

  1. Resuspend الخلايافي 200 ميكرولتر المتوسطة الخلايا التائية دون تحفيز الأجسام المضادة ودون IL-2 أو السيتوكينات الأخرى والراحة لهم لمدة 40 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة للسماح التعبير عن الجينات في المصالح قبل التنشيط.

7. T تنشيط الخلايا والاستقطاب

  1. ماصة وبلغ حجم التداول مكافحة CD3 والخرز مكافحة CD28 يقترن التي يساوي عدد الخلايا (على سبيل المثال 4 × 10 5) في كوب صغير كاشف، إضافة حجم 10 أضعاف من برنامج تلفزيوني ووضعها على مغناطيس لمدة 2 دقيقة . خلع طاف و resuspend حبات في 200 ميكرولتر المتوسطة الاستقطاب (لTregs: T المتوسطة خلية + 1 نانوغرام / مل TGFβ، 100 U / مل IL-2).

ملاحظة: يمكن أيضا تنشيط خلايا باستخدام أطباق زراعة الأنسجة المغلفة مع المضادة للCD28 ومكافحة CD3 الأجسام المضادة، أو بطريقة DO11.10 T الخلية مستقبلات محددة باستخدام المشع splenocytes BALB / ج نابض مع ألبومين البيض 323-339 مستضد الببتيد.

  1. Centrifugه واستراح الخلايا كما كان من قبل، خلع SN والخلايا resuspend في 200 ميكرولتر المتوسطة الاستقطاب التي تحتوي على مكافحة CD3 ومكافحة CD28 الضد يقترن الخرز. احتضان لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة دون تغيير المتوسطة.

8. T تثبيت الخلية وتلطيخ للالتدفق الخلوي

  1. غسل الخلايا: تدور باستمرار الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وخلع SN، في resuspend 200 ميكرولتر PBS. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وخلع SN. تنفيذ كافة الخطوات التالية غسل فقا لذلك.
  2. resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر قابل للتثبيت الخلية الميتة حل تلطيخ واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  3. غسل الخلايا، في resuspend 100 ميكرولتر PBS، إضافة 100 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني، واحتضان 15 دقيقة في RT.
  4. غسل الخلايا، resuspend لهم في 200 ميكرولتر الجليد الباردة الميثانول 70٪ في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.

ملاحظة: يمكن علاج الخلايا من الآن فصاعدا دون الاحتياطات بيولوجية!

  1. إعداد 60 ميكرولتر ماجستير مزيج من 60 ميكرولتر PBS + 10 ميكروغرام / مل FC-كتلة (المضادة للFCR3 لمنع ملزم غير محددة). غسل الخلايا، resuspend لهم في 40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + المضادة للFCR3 واحتضان 15 دقيقة في RT.
  2. إضافة 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + المضادة للFCR3 تحتوي على 1 ميكروغرام PE-إلى جانب الأجسام المضادة لمكافحة Foxp3، تخلط جيدا واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
  3. غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني وتحليل الخلايا على تدفق عداد الكريات.

النتائج

إنتاج فيروس

لجيل من التتر فيروس عالية، توقيت الحصاد خلية HEK293A في إنتاج فيروس الأولية أو التضخيم فيروس أمر بالغ الأهمية. يتم عرض ممثل الفلورسنت والمرحلة على النقيض من الصور مع علامات مرئية من إنتاج الفيروس في الشكل 3. وقد لو...

Discussion

الجيل الفيروسات والمعايرة

من أجل تحقيق النتائج المثلى ترنسفكأيشن، ونوعية وكمية خطي ناقلات يبدو الأكثر أهمية. نحن لم تراع الآثار السلبية على الإنتاج المحللة الأولية من فرط الأولي للثقافة منذ عدوى ستمضي قدما بسرعة بمجرد أن يحدث إن?...

Disclosures

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر Lirui دو للبناء ناقلات pCAGAdDU وأوليفر جوركا لأحكام البروتوكول التثبيت.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
pENTR/D-TOPO Cloning KitInvitrogenK240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mixInvitrogen11791020
PacINew England BiolabsR057S
jetPEIPolyplus-transfection101-10N
HEK293A Cell LineInvitrogenR705-07
A549ATCCCCL-185
6-well platesBD Falcon353046
14 cm tissue culture dishNunc168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1JdgrTaconic FarmsModel Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit IIMiltenyi Biotech130-094-131
DMEMInvitrogen41966-052
FBSPAN Biotech1502-P110704
PenStrepInvitrogen15140-122
RPMI 1640LonzaBE12-167F
NaPyruvateLonzaBE13-115E
NEAA 100xLonzaBE13-114E
L-GlutamineInvitrogen25030
HEPES Buffer Solution (1 M)Invitrogen15630-056
β-MercaptoethanolSigma-AldrichM-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)Lonza13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and ActivationInvitrogen114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1R&D Systems240B
Proleukin S (18 x 106IE)Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain KitInvitrogenL-23105
Mouse BD Fc BlockTBD Pharmingen553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PEeBioscience12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA AssayRoche Applied Biosystems4427975
LightCycler 480 Probes MasterRoche Applied Biosystems04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription KitRoche Applied Biosystems4366596

References

  1. Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
  2. Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
  3. Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
  4. Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
  5. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  6. Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
  7. Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
  8. Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
  9. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  10. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  11. Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
  12. Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
  13. Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
  14. Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
  15. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
  16. Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
  17. Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
  18. Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
  19. Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
  20. Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
  21. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
  22. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
  23. Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
  24. Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
  25. Thai, T. -. H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
  26. Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
  27. Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
  28. Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

78 CD4 MicroRNAs overexpression CD4 T T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved