JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نهج جديد يجمع بين العين وزرع المجهري متحد البؤر تمكن طولية، غير الغازية في الوقت الحقيقي التصوير مع وحيدة الخلية القرار داخل أنسجة المطعمة في الجسم الحي. نحن لشرح كيفية زرع البنكرياس الجزر في الغرفة الأمامية للعين الماوس.

Abstract

وقد برزت Intravital التصوير كأداة لا غنى عنها في مجال البحوث البيولوجية. في هذه العملية، وقد وضعت العديد من تقنيات التصوير لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة في الحيوانات غير جراحية. ومع ذلك، فإن القيود الرئيسية في التقنية الحالية طرائق التصوير intravital هو عدم القدرة على الجمع بين غير الغازية، والتصوير الطولي مع قدرات القرار وحيدة الخلية. نعرض هنا كيف زرع في الغرفة الأمامية من العين تلتف الحد يعتد توفير منصة تنوعا التجريبية التي تمكن غير الغازية، والتصوير الطولي للقرار الخلوية في الجسم الحي. علينا أن نبرهن الإجراء زرع في الماوس وتقديم نتائج ممثل باستخدام نموذج مع أهمية سريرية، وهي جزيرة البنكرياس الزرع. بالإضافة إلى تمكين التصور المباشر في مجموعة متنوعة من الأنسجة المزروعة في الغرفة الأمامية للعين، فإن هذا النهج يوفر منبرا لحصاةن المخدرات عن طريق أداء على المدى الطويل متابعة والرصد في الأنسجة المستهدفة. بسبب زرع الأنسجة في براعة / خلية، في الغرفة الأمامية للعين علاجات زرع ليس فقط الفوائد، فهي تمتد إلى غيرها من التطبيقات في الجسم الحي لدراسة العمليات الفسيولوجية المرضية في جسم المريض ومثل نقل الإشارة والسرطان أو المناعة الذاتية تطور المرض.

Introduction

وقد كشفت التطورات في المجهر intravital الظواهر الفسيولوجية لا تنبأ بها في الدراسات المختبرية 1. هذا يسلط الضوء على التحدي في ترجمة النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق أساليب التقليدية في المختبر في الحيوانات الحية. في العقد الماضي، تحسنا كبيرا في التصور من أنسجة الحيوانات الحية من التقدم التكنولوجي في طرائق التصوير 2، 3، 4، 5، 6. وقد حفزت هذه في حاجة إلى نهج التصوير المجراة مع التطبيق ممكنا في النماذج الحيوانية التجريبية لتمكين التصور طولية من الأنسجة المستهدفة غير جراحية.

وقد مكنت تقنيات التصوير مثل التصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي بوزيترون الانبعاثات أو تلألؤ بيولوجي غير الغازية تصوير الأعضاء / الأنسجة العميقة داخل الجسم 7-8، 9. ولكن يمكن لهذه التقنيات أن تحقق واحدة الخلية القرار بسبب الإشارات الخلفية عالية ومنخفضة القرار المكانية، على الرغم من استخدام سو المواد التباين العالي أو الأنسجة محددة 4 التلألؤ. وقد وجهت هذا مع ظهور المجهر ثنائي الفوتون مبائر مضان 10. تمكين ثنائي الفوتون المجهري دراسات التصوير intravital لتصور وقياس الأحداث الخلوية مع تفاصيل لم يسبق لها مثيل 11 و 12. وقد أدى هذا إلى توصيف العمليات البيولوجية الأساسية في الصحة والمرض 13 و 14 و 15 و 16. بينما الرائد دراسات التصوير وintravital في المقام الأول "تحاكي" في ظروف فيفو في الأنسجة رفعه (مثل العقد الليمفاوية)، استخدمت دراسات أخرى النهج الغازية إلى الأنسجة المستهدفة تتعرض الصور في الموقع 17، 18، 19، 20، 21. وقد استخدمت دراسات أخرى أيضا "النماذج غرفة نافذة" للتحايل على القيود المرتبطة النهج الغازية ومحدودة في الجسم الحي التصوير القرار 22، 23، 24، 25. في إطار نموذج الدائرة، هو مزروع جراحيا غرفة مع نافذة شفافة في الجلد في diffeإيجار (الجلد الظهرية أو الأذن، وسادة الثدي الدهون والكبد وغيرها) على الحيوان (مثل الجرذان والفئران، والأرانب). في حين أن هذا النهج يمكن بوضوح عالي الدقة في التصوير المجراة، يقتضي وجود جراحة لزرع الدائرة وربما لا تكون قادرة على استيعاب أكثر من الدراسات الطولية التصوير عدة أسابيع أو 22 شهرا.

وقد تجلى مؤخرا أن الجمع بين عالية الدقة المجهر مبائر مع إجراء مينيملي، أي زرع في الغرفة الأمامية للعين (ACE) يوفر "نافذة الجسم الطبيعية" وذلك قوية وتنوعا في الجسم الحي التصوير منصة 26 و 27 وقد استخدم في زرع ACE في العقود القليلة الماضية لدراسة الجوانب البيولوجية من مجموعة متنوعة من الأنسجة 28، 29، 30، والأخيرة مع مزيج عالية الدقة التصوير تمكين دراسة علم وظائف الأعضاء من الجزر البنكرياسية مع خلية واحدة قرار غير وجراحية طوليا <سوب> 26 و 27. وقد استخدم هذا النهج لدراسة الاستجابات الذاتية خلال تطوير داء السكري نوع 1 في النماذج الحيوانية (بيانات غير منشورة). كما كان يستخدم لدراسة التنمية البنكرياس، وكذلك، في الدراسات وظائف الكلى عن طريق زرع البنكرياس في براعم ACE أو الكبيبات الكلوية الفردية، على التوالي (بيانات غير منشورة). A تقرير صدر مؤخرا باستخدام هذا النهج أثبت مزيد من تطبيقه لدراسة الاستجابات المناعية بعد زرع البنكرياس جزيرة 31. الأهم من ذلك، أظهرت هذه الدراسة أن زرع في الغرفة الأمامية من العين يوفر نافذة لأداء الجسم الطبيعية: (1) طولية، غير الغازية تصوير الأنسجة المزروعة في الجسم الحي، (2) في الجسم الحي cytolabeling لتقييم الجدوى والنمط الظاهري الخلوية في الموقع، (3) تتبع في الوقت الحقيقي من التسلل الخلايا المناعية في الأنسجة المستهدفة؛ و (4) المحلية عن طريق التدخل التطبيق الموضعي أو الحقن داخل العين.

هنا، نحن Demonstrate كيفية تنفيذ زرع في الغرفة الأمامية للعين باستخدام الجزر البنكرياسية.

Protocol

يتم تنفيذ الإجراء التالي تحت المجسام في 2 خطوات، الخطوة الأولى تنطوي تحميل الجزر في قنية والخطوة الثانية هي زرع الفعلية في ACE. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي أجريت على الحيوانات عن طريق رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (IACUC) من جامعة ميامي.

1. تحميل الفشوت في قنية لزراعة

  1. مركز الجزر في صحن الثقافة من خلال الدوران في حلقة مفرغة الطبق تضييق.
  2. فصل قنية من "خزان" ووضع قنية وأنابيب يربط على سطح نظيف. ويمكن إجراء الخزان من أصل 300 ميكرولتر المتاح تلميح ماصة بلاستيكية بدون فلتر (الشكل 1A).
  3. طرد فقاعات الهواء من الخزان لضمان تيار مستمر من الجزر عندما الشفط في الخزان. بيغ الخزان ويتم ذلك من قبل القيادة إلى الأمام أيدي خالية الآلية حقنة سائق باستخدام دواسة القدم(1B الشكل، ج). وهذا سيجعل أيضا في الفضاء الحقنة للسماح تطلع الجزر في المكمن (محملة مسبقا مع محلول معقم المالحة مثل وسائل الإعلام، أو الثقافة PBS).
  4. نضح بلطف المبلغ المطلوب من الجزر في المكمن. سوف تميل إلى دوامة الجزر لأنها تدخل الخزان وستبقى معا نحو القاع. ويتم ذلك من قبل القيادة تطلع إلى الوراء والآلية حقنة سائق باستخدام دواسة القدم.
  5. أعد توصيل قنية إلى الخزان عبر أنابيب الاتصال.
  6. وضع قنية تلميح مرة أخرى في طبق الثقافة وتدفق الجزر من الخزان إلى الأنبوب ثم إلى قنية. تأكد من أن الجزر البقاء معا كما كنت مرة أخرى ملء الأنبوب / قنية بواسطة بلطف "عبها" (التنصت) وأنابيب (1D الشكل). وقف إما قبل أو بعد كل فقاعات الهواء قبل الجزر ويخرجوا من قنية. إذا لم تكن متأكدا، كما وقف الجزر أدخل الجزء الخلفي من قنية والهواء المتبقيةيمكن الفقاعات قبل الجزر يساعد على منع ارتجاع (ارتجاعي) من الجزر من ACE. سوف تتبدد بين عشية وضحاها.
  7. في هذه المرحلة، كنت على استعداد لحقن الجزر في ACE (يرجى الاطلاع الخطوات التالية).

2. جزيرة زرع في الغرفة الأمامية للعين

  1. وضع الماوس على وسادة تخدير دافئة تحت المجسام.
  2. وضع خطم من الفأرة إلى "قناع" التخدير متصلة الأكسجين / isoflurane آلة التخدير. يتكون القناع من أصل 1 مل ماصة الحافة البلاستيكية (بدون فلتر) وأنابيب متصلة التخدير حتى نهاية الضيقة (الشكل 2A، ب).
  3. سحب بلطف الجفون للعين أن زرع باستخدام السبابة والإبهام من يدك حرة و"البوب" في العين لأفضل التعرض وسهولة الوصول (الشكل 2C). وهذا يتطلب بعض الممارسة لاتقان دون إعاقة التنفس من الماوس عن طريق الضغط الزائد علىالرقبة أو عرقلة تدفق الدم في الرأس.
  4. باستخدام حقنة الانسولين المتاح (29 - 31G)، ومشرط، اختراق بعناية سوى غيض في القرنية وجعل شق واحد الجانبية. جعل شق في منتصف الفترة الفاصلة بين قمة حوف القرنية والتقليل إلى أدنى حد من الجزر الجزر خلال حقن من ACE (الشكل 2D).
  5. إدراج بعناية قنية (مسبقة مع الجزر) من خلال شق.
  6. إخراج ببطء للخروج من الجزر قنية وإيداعها على رأس القزحية. لتجنب الجزر جزيرة بسبب تراكم الضغط المفرط في ACE، إخراج الجزر في التوجهات وجيزة في وحدة تخزين صغيرة (ق) ممكن في مقابل رباعي إلى شق. ويمكن ضمان هذه الجزر مزيد من ضغط في الأنبوب أثناء تحميل قنية (يرجى راجع الخطوة 1.6).
  7. التراجع ببطء قنية من ACE. هذا هو خطوة حاسمة، وخاصة، إذا تم حقن كمية كبيرة من الجزر والجزر جزيرة بسبب بريهقد تأكد بناء داخل ACE أمرا لا مفر منه. للقضاء على / تقليل الجزر جزيرة، وتناوب بلطف بينما قنية داخل ACE للافراج عن الضغط الزائد من خلال شق حول قنية. تحقق من وجود علامات على الجزر وحاولت التراجع عن قنية، وإذا لزم الأمر، والانتظار حتى تهدأ الضغوط قبل التراجع تماما قنية من ACE.
  8. شطف العين المزروع مع PBS أو محلول ملحي معقم.
  9. حقن البوبرينورفين لتسكين بعد العملية (0،05-0،1 ملغ / كغ، تحت الجلد) لأول 48 ساعة.
  10. تطبيق مرهم الاريثروميسين العيون المضادات الحيوية للعين المزروع مباشرة بعد الزرع.
  11. وضع الحيوانات في قفص مرة أخرى للسماح حرارة التعافي من التخدير.

النتائج

هناك عدد قليل من المعالم التي تحدد "جيد" الزرع. A زرع جيد واحد هو أن العائدات دون نزيف عند إجراء شق كما يتضح في الفيديو. يتم منع النزيف / التقليل من اختراق فقط غيض من مشرط (الإبرة) في ACE (الشكل 3A). وهذا سوف يساعد أيضا في منع الاتصال وثقب القزحية. فإنه سيتم أيضا ...

Discussion

تم عزل الجزر البنكرياسية الفئران باستخدام الهضم كولاجيناز تليها تنقية على تدرجات الكثافة، كما هو موضح سابقا 33. تم زراعة الجزر المعزولة بين عشية وضحاها قبل الزرع. بينما قد لا تكون هناك حاجة هذا، فمن المستحسن أن تسمح الجزر للتعافي من إجراء العزل. هذا أمر بالغ الأ?...

Disclosures

PO.B. هي واحدة من مؤسسي شركة للتكنولوجيا الحيوية Biocrine، والتي سوف تستخدم الغرفة الأمامية للعين كمنصة الخدمات التجارية. AC على حماية براءة الاختراع هذه التكنولوجيا.

Acknowledgements

نعترف الدكاترة. كاميلو Ricordi، Pileggi انتونيلو، R. Molano داماريس، Speier ستيفان ودانيال Nyqvist لإجراء مناقشات مثمرة. نشكر أيضا Eleut هرنانديز ودييجو اسبينوزا-Heidmann للمساعدة التقنية، ومايك فالديز وفورموسو مارجريت للمساعدة في تسجيل الفيديو. سجلت بايرون مالدونادو، تحرير، وإنتاج الفيديو النهائي. وقدم الدعم من قبل مؤسسة البحوث معهد بحوث السكري ( www.DiabetesResearch.org )، والمعاهد الوطنية للصحة / NIDDK / NIAID (F32DK083226 لMHA؛ NIH RO3DK075487 لAC؛ U01DK089538 لPO.B.). وقدم دعم إضافي من خلال البحوث لPO.B الأموال من معهد كارولينسكا، ومجلس البحوث السويدية ومؤسسة مرض السكري السويدية ومؤسسة الأسرة مؤسسة Erling-بيرسون، وكنوت الأسرة وأليس النبرغ، ومؤسسة التأمين سكانديا المحدودة، VIBRANT ( FP7-228933-2)، وبرنامج البحوث الاستراتيجية في مرض السكري في انست كارولينسكاitutet، ومؤسسة نوفو نورديسك، ومؤسسة فون للرصيف Kantzow.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم وصف / تعليقات
IsoTHESIA (Isoflurane) Buttler التموين صحة الحيوان 11695-6775-2 99.9٪ Isoflurane / مل
Ketaset (الكيتامين HCL) فورت دودج الصحة الحيوانية 0856-2013-01 حقن التخدير البديلة
Beprenex (البوبرينورفين HCL) ريكيت بينكيزر الرعاية الصحية (UK) المحدودة 12496-075-7-1 0.3 ملغم / مل
الاريثروميسين مرهم عيني USP، 0.5٪ أكرون 17478-070-35 تطبيق لقائي العين المزروع
0.9٪ كلوريد الصوديوم (المالحة) هوسبيرا شركة 0409-7983-03 رابعا للحقن. معقم
PBS Gibco 10010-023 1X. معقم
CMRL المتوسطة 1066 Cellgro 98-304-CV تستكمل تعديل CIT. وسائل الإعلام المفضلة لجزر

References

  1. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
  2. Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival - a perspective. Acta Physiol. (Oxf). , (2011).
  3. Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE Trans Biomed. Eng. 57 (10), 2576-2578 (2010).
  4. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat. Methods. 7, 603-614 (2010).
  5. Aswathy, R. G., Yoshida, Y., Maekawa, T., Kumar, D. S. Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging. Anal. Bioanal Chem. 397 (4), 1417-1435 (2010).
  6. Ghoroghchian, P. P., Therien, M. J., Hammer, D. A. In vivo fluorescence imaging: a personal perspective. Wiley Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 1 (2), 156-167 (2009).
  7. Prescher, A., Mory, C., Martin, M., Fiedler, M., Uhlmann, D. Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics. Transplant Proc. 42 (10), 3984-3985 (2010).
  8. Leblond, F., Davis, S., Valdés, P., Pogue, B. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J. Photochem. Photobiol. B. 98 (1), 77-94 (2010).
  9. Toso, C., Vallee, J. P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., et al. Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling. Am. J. Transplant. 8 (3), 701-706 (2008).
  10. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  11. Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J. Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
  12. Denk, W., Delaney, K. R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B. W., Tank, D. W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J. Neurosci. Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  13. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
  14. Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro. Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).
  15. Matheu, M. P., Cahalan, M. D., Parker, I. Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top99 (2011).
  16. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat. Med. , (2011).
  17. Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C., Singh, G., Kim, P., et al. In vivo tracking of 'color-coded' effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response. Nat. Med. 16 (6), 718-722 (2010).
  18. Sabek, O., Gaber, M. W., Wilson, C. M., Zawaski, J. A., Fraga, D. W., Gaber, O. Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model. Transplant Proc. 42 (6), 2112-2114 (2010).
  19. Coppieters, K., Martinic, M. M., Kiosses, W. B., Amirian, N., von Herrath, M. A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy. PLoS One. 5 (12), e15732 (2010).
  20. Martinic, M. M., von Herrath, M. G. Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes. Immunol Rev. 221, 200-213 (2008).
  21. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678 (2008).
  22. Palmer, G. M., Fontanella, A. N., Shan, S., Hanna, G., Zhang, G., Fraser, C. L., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent. 6 (9), 1355-1366 (2011).
  23. Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
  24. Taylor, M. The response of capillary endothelium to changes in intravascular pressure, as seen in the rabbit's ear chamber. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 31 (5), 533-543 (1953).
  25. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvasc. Res. 65 (2), 109-117 (2003).
  26. Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R. D., Pileggi, A., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat. Med. 14 (5), 574-578 (2008).
  27. Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat. Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
  28. Falck, B. Site of production of oestrogen in the ovary of the rat. Nature. 184, 1082 (1959).
  29. Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).
  30. Adeghate, E., Donath, T. Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats. Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).
  31. Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
  32. Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. R. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse. J. Immunol. 165 (6), 3284-3292 (2000).
  33. Pileggi, A., Molano, R. D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation. Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

73

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved