قياس الافراج عن التوتر أثناء المستحثة بالليزر اكسون الآفات لتقييم التصاق محور عصبي إلى الركيزة في Piconewton والقرار ملي

Summary

قمنا بقياس الافراج عن التوتر في محور عصبي التي تم lesioned جزئيا مع مشرح ليزر من قبل في وقت واحد القياس الطيفي قوة أجريت على اجراء تحقيق بصريا-المحاصرين انضمت إلى غشاء من محور عصبي. بروتوكول التجريبية المتقدمة بتقييم التصاق محوار إلى الركيزة الثقافة.

Abstract

ويتأثر تشكيل اتصالات وظيفية في شبكة الخلايا العصبية النامية من خلال اشارات خارجية. هو نمو محوار من الخلايا العصبية النامية عرضة للإشارات الكيميائية والميكانيكية، والآليات التي الحواس ويستجيب لإشارات الميكانيكية غير مفهومة جيدا. سوف توضيح دور القوات في نضوج الخلية تمكين تصميم السقالات التي يمكن أن تعزز التصاق الخلايا واقتران هيكل الخلية إلى الركيزة، وبالتالي تحسين قدرة من أنواع الخلايا العصبية المختلفة لتجديد بعد الاصابة.

هنا، نحن تصف طريقة لتطبيق في وقت واحد قياسات التحليل الطيفي خلال قوة الليزر التي يسببها الآفة الخلية. نقيس الافراج عن التوتر في محور عصبي lesioned جزئيا من خلال تتبع التداخل في وقت واحد من اجراء تحقيق المحاصرين بصريا انضمت إلى غشاء من محور عصبي. لدينا بروتوكول تجريبي بالكشف عن الافراج عن التوتر مع piconewton حساسية، والديناميكية لإطلاق سراح التوتر فيالقرار وقت ميلي ثانية واحدة. ولذلك، فإنه يوفر وسيلة عالية الدقة لدراسة كيفية اقتران الميكانيكية بين الخلايا وركائز يمكن أن يكون عن طريق التضمين العلاج الدوائي و / أو عن طريق الخواص الميكانيكية متميزة من الركيزة.

Introduction

المجهر الضوئي هو واحد من نظام التصوير أقل الغازية المتاحة لمراقبة الخلايا الحية. مع استغلال تأثيرات مثل ضغط الإشعاع (كما في ملاقط بصرية ^1)، أو ذات الطاقة العالية تدفق الفوتون (كما هو الحال في الليزر مشرح ^2)، تم تمديد هذه التكنولوجيا لنانو التلاعب. نظام التصوير الضوئي وتقدم لمراقبة دقيقة لتصور والتلاعب أهداف الخلوية الفرعية ^3. في الوقت نفسه، وذلك بفضل لمعايرة دقيقة من قوة الليزر تسليمها، أدوات بصرية إنجاز إما لينة أو الغازية التلاعب عينة مع استنساخ لم يسبق لها مثيل.

عدة مختبرات متكاملة، في نفس الإعداد التجريبية، ملاقط بصرية ومشرح الليزر ليجتذ العضيات ^4، لتلتحم مع بعضها خلايا مختلفة ^5، أو لتحفيز الخلايا عن طريق مدفوعة بصريا الشحنات ^6،7. بينما ملاقط بصرية، بعد معايرة لصلابة البصرية، تسمح للسيطرة القوة المطبقة على الخلية على نطاق piconewton، ويمكن لنظم تشريح الليزر تعدل التلاعب البصرية، والتي تتراوح من غشاء الصور poration إلى الاجتثاث من العضيات واحد أو تشريح هياكل شبه الخلوية. ومع ذلك، يعتمد الليزر معايرة تشريح على التقييم النوعي للكيان من التلاعب البصرية فيما يتعلق الطاقة تسليمها إلى عينة، تقوم أساسا على تحليل الصور التي توضح التغيرات المورفولوجية التي لحقت عينة ^8. في الطريقة المعروضة، ونحن لشرح كيفية تنفيذ القياس الطيفي قوة أثناء تشريح محور عصبي الليزر من الخلايا العصبية النامية، على القياس، وعلى نطاق وpiconewton، القوة التي ينتجها التوازن تغير في بنية الهيكل الخلوي من حجرة شبه الخلوية ^9. الخلايا العصبية مثقف التمسك الركيزة، واستقطاب خلال التنمية. وتحدث هذه المرحلة الاستقطاب خلال الأيام الخمسة الأولى في المختبر. في المرحلة الثانية من الاستقطاب، واحدة من extrudneurites التي جي يصبح أطول، وأنها سوف تفرق أن تصبح محور عصبي ^10. استطالة محور عصبي ردا على قوة سحب في مخروط النمو قد صيغت من قبل نموذج Dennerl في ^11. في الآونة الأخيرة، وقد تم تمديد هذا النموذج ليشمل ¹² دور التصاق محوار إلى ركائز المصفوفة خارج الخلية. وأظهر هذا النموذج الفيزيائية الحيوية، اقترح بعد الملاحظات التجريبية ^13، أن سحب القوات على مخروط النمو، نشر على طول محوار، هي عن طريق التضمين الالتصاقات البؤرية إلى الركيزة. وبالمثل، آفة محور عصبي ينتج الافراج المحلية من التوتر نشر نحو خلايا الجسم. وبالتالي، اقترحنا أن قياس مثل التوتر الذي صدر في مكان على طول محور عصبي بين الآفة وسوما الخلية توفر إمكانية لتقييم نتائج الملطف من الالتصاقات البؤرية تتأثر.

نحن معايرة اللازمة طاقة الفوتون-الجريان للمشرح ليزر للتحكم في مدى ل damag محور عصبي ألحقته، من عانى من قطع كامل للآفة جزئية. بعد المعايرة، كررنا آفة جزئية إلى محاور عصبية من الخلايا العصبية عدة التفريق وضعت بروتوكول لقياس الافراج عن التوتر، وبالتالي الحصول على معلمة الكمي لتقدير التصاق من محور عصبي إلى الركيزة ^14.

في العمل الحالي، ونحن تصف بالتفصيل بروتوكول المتقدمة، وهو ما يمثل الإجراء التجريبي دقيقة لتقييم ومقارنة مع piconewton حساسية الالتصاق محور عصبي إلى الركيزة في ظروف تجريبية مختلفة مثل المعالجة الكيميائية ^14، أو أنواع مختلفة من الدعم ثقافة الخلية.

Protocol

1. الإعداد البصرية

وقد وصفت النظام البصري بأكمله في وقت سابق ^15. لفترة وجيزة، ويستند نظام ملاقط بصرية على موجة مستمرة ايتربيوم (CW) ألياف الليزر التشغيل في 1064 نانومتر (IPG الليزر شركة محدودة). A المكانية المغير ضوء (حركة تحرير السودان) (LCOS-حركة تحرير السودان، نموذج X10468-07 - هاماماتسو) يختلف المرحلة من شعاع الليزر تحت الحمراء واردة للسيطرة على الموقف من بقعة محاصرة التركيز على طبق الثقافة عن طريق الصور المجسمة ولدت الكمبيوتر. الأزرق ملاقط البرنامج (رابط على طاولة معدات الويب) الصور المجسمة ولدت متاحة بحرية المتوقعة على المغير ضوء المكاني. واستند تداخل لقياس الطيفي قوة على الثنائي الضوئي أربعة رباعي (QPD، S5980 مع C5460SPL 6041 BOARD - هاماماتسو) والثنائي الضوئي (PD، PDA100A-EC - Thorlabs).

وكان مصدر تشريح ليزر نبضية-النانوسيكند الفرعية للأشعة فوق البنفسجية الثانية: YAG الليزر في 355 نانومتر (PNV-001525-040، PowerChip نانو ليزر الأشعة فوق البنفسجية نبض - تيم الضوئيات). وصوتيةالبصرية المغير (MQ110-A3 للأشعة فوق البنفسجية، 355 نانومتر تنصهر السيليكا-AA-علم البصريات الالكترونية) سيطر على قوة الليزر الأشعة فوق البنفسجية تسليمها إلى عينة.

أدمجت ملاقط بصرية ثلاثية الأبعاد والليزر الجزئي مشرح على المجهر تستقيم تعديل (BX51 - أوليمبوس) مجهزة 60X، 0.9 NA المياه غمس يتكون objective.The مرحلة من مراحل المجهر من 3 محاور خطي DC السيارات الصغيرة لتحديد المواقع نظام (M-126.CG1، الفيزياء، الصكوك) يحمل 3 محاور كهرضغطية المرحلة نانو تحديد المواقع منفصلة (P-733.3DD، الفيزياء، الصكوك) إلى الجمع بين حركة الخشنة من العينة مع قرار نانومتر الفرعية للبيزو المرحلة. وقد تم تجهيز نظام المسرح المجهر مع اثنين من التحكم في حلقات العمل بالتآزر للحفاظ على التركيز بقعة محاصرة في موقف الحق، وهذا يتوقف على طريقة العمل المحدد (موقف أو المشبك قوة، ثابتة أو دينامية) ^16. على وجه الخصوص، حلقة ردود الفعل الداخلية يعمل على مرحلة كهرضغطية، للحفاظ على حبة في تحديدإد المسافة من مركز الفخ. حلقة خارجية أخرى تسيطر على الموقف من مرحلة الآلية لاستغلال المنطقة التي تغطيها بيزو المحرك على مساحة أكبر من المتوفرة لديها السكتة الدماغية ^17. عندما المرحلة بيزو تصل إلى الحد من السكتة الدماغية المتوفرة في اتجاه واحد، وحلقة خارجية يتحرك المرحلة الدقيقة في الاتجاه المعاكس، وبالتالي فإن بيزو يسترد نحو موقعها المركزي لأنها تتبع المحاصرين حبة انضمت إلى عينة. عندما تصل إلى مرحلة بيزو المركز الأساسي للمجموعة ومسارها، توقف المرحلة الدقيقة. يتم الإبلاغ عن مزيد من التفاصيل عن النظام في Guiggiani آخرون ^16،17.

جهاز بلتيير (QE1 التدفئة مقاوم مع TC-344B تحكم سخان قناة مزدوجة - وارنر صكوك) يتحكم في درجة حرارة زراعة الخلايا تحت المجهر (37 ° C). في الثقافة، والحفاظ على درجة الحموضة والرطوبة في الظروف الفسيولوجية التي كتبها تهوية وpolydimethyl مصمم خصيصاsiloxane (PDMS) كم (دمج الهدف المجهر) مع كربوجين ترطيب (95٪ O _2، 5٪ CO _2).

2. إعداد خلية ثقافة

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل وزارة الصحة الإيطالية. تم الحصول على الثقافات الأولية من الحصين من الفئران (C57BL6J، تشارلز ريفر) في يوم الجنينية 18 (E18).

1. كانت مطلية الخلايا العصبية عند تركيز من 25،000 خلية / مل على أطباق بتري الزجاجية القاع (P35G-0-14-C - شركة ماتيك). هناك حاجة إلى تركيز منخفض من الخلايا المستزرعة لتجنب تكوين شبكة كثيفة بالفعل في الأيام الأولى في المختبر. في تركيز الخلية المذكورة، واحتمال العثور على خلايا معزولة مع محوار يعد غير متصل إلى خلايا أخرى أعلى من ذلك بكثير.

3. طلاء حبة

1. وقد تم طلاء البوليمر المجهرية (O 4 ميكرون، معامل COOH بصفر-الانفجارات، ورمز المنتج PC05N/6700) مع بولي-D-يسين باتباع الإجراء هو موضح في polyLink بروتين كيت اقتران (Polysciences، رمز المنتج 19539). والمغلفة الخرز مع نفس الجزيء تستخدم لتغطية دعم الثقافة وصالح الخلايا التصاق.

4. اختيار الخلية العصبية معزولة. فصل حبة من الثقافة الركيزة، فخ وتحريكه بجانب الخلية العصبية

1. وضع طبق بتري الثقافة على المسرح المجهر. بعد تعيين التركيز على عينة من قبل الحركة المرحلة، تصحيح موقف مكثف الهدف إلقاء الضوء على مجموعة كولر في الإضاءة. محاذاة البصريات الإضاءة لضبط حالة Kolher في الإضاءة أمر ضروري لتحسين جودة التصوير مشرق الميدان. باستخدام مثل هذه الظروف المحاذاة، بل هو أيضا ضروري لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة جمع ليزر الأشعة تحت الحمراء (من خلال المكثف الهدف)، من نثر التحقيق المحاصرين، لأداء تتبع لها التداخل من قبل QPD وPD.
2. ماصة ميكرولتر من عدد قليل من المغلفة المكروية محلول المخزون فيإلى الطبق الثقافة. وسوف تودع المجهرية والتمسك الركيزة الثقافة. عدد ميكرولتر حقنها في صحن الثقافة يعتمد على تركيز المكروية من محلول المخزون. الشرط المثالي هو أن يكون بين واحد واثنين المجهرية في مجال التصوير للعرض. عندما تتم إضافة عدد كبير جدا من المجهرية إلى الطبق والثقافة، وأنها يمكن أن نعلق بالفعل عشوائيا إلى الخلايا العصبية مثقف.
3. التحرك في الطبق الثقافة، والبحث للحصول على الخلايا العصبية معزولة مع أطول محوار (محور عصبي)، وانقاذ الموقف من المسرح المجهر.
4. التحرك والبحث عن حبة انضمت إلى دعم الثقافة.
5. بدوره على الليزر محاصرة الأشعة تحت الحمراء. في هذه المرحلة، ومن المتوقع أن لا الهولوغرام على حركة تحرير السودان، والموقف من الأشعة تحت الحمراء بقعة الليزر يتزامن مع الأشعة فوق البنفسجية موقف بقعة الليزر. تعيين موضع المحوري للبقعة IR 2-3 ميكرومتر فوق السطح لدعم الثقافة، من خلال المجهر مرحلة الحركة.
6. تعيين قوة الليزر الأشعة فوق البنفسجية تسليمها إلى عينة إلى أقل من 1 μW. الوقد الأشعة فوق البنفسجية الليزر مشرح سابقا معايرة ^14:
   5-6 μW وذاب الدعم الزجاج
   4 μW يتم تشريح اتصال الخلايا العصبية تماما
   2.5 μW يتم lesioned لمحوار جزئيا
   <1 μW يتم إنتاج موجة صدمة في صحن الثقافة. موجة الصدمة البصرية قوي بما فيه الكفاية لفصل حبة من الدعم الزجاج.
7. بدوره على الليزر الأشعة فوق البنفسجية، في حين ترك ليزر الأشعة تحت الحمراء على، ونقل بقعة الأشعة فوق البنفسجية فوق انضمت حبة بواسطة المجهر مرحلة الحركة. ويفصل حبة من على سطح الأرض، وأنه هو المحاصرين من قبل ليزر الأشعة تحت الحمراء. ثم قم بإيقاف تشغيل الليزر الأشعة فوق البنفسجية.
8. نقل مفخخة حبة عدة ميكرومتر فوق مستوى الدعم الزجاج (20-30 ميكرون). ورفع حبة لهذا المنصب منعه من الاتصال خلايا أخرى بينما يتم نقله نحو الخلايا العصبية المختار سابقا. جلب حبة لموقف المرحلة المحفوظة مسبقا. تعيين سرعة المرحلة إلى قيمة منخفضة (10 ميكرون / ثانية) وبالتالي فإن قوة السحب السائل لا يتجاوز فخ البصريةقوة بينغ.

5. تحريك موضع فخ فيما يتعلق بقعة مشرح ليزر واكسون الموقع بواسطة الحاسوب صورة ثلاثية الأبعاد المولدة، ومعايرة الملقط تصلب بصري

1. حرك حبة نحو دعم الزجاج لتصور محور عصبي. يقام حبة فوق الخلية لتجنب الاتصال معها (حوالي 5 ميكرون فوق مستوى الدعم الزجاج).
2. تحريك خشبة المسرح المجهر لنقل التركيز بقعة الأشعة فوق البنفسجية على مركز عرض محور عصبي. انقاذ الموقف المرحلة الحالية.
3. تحريك موضع نقطة التركيز IR بواسطة الهولوغرام الحاسوب ولدت. في هذه الخطوة، يتم وقف المرحلة في موقف المختار في الخطوة السابقة. عندما يتوقع أن الهولوغرام الحاسوب ولدت في حركة تحرير السودان، يتم نقل حبة المحاصرين فيما يتعلق محور عصبي. نحن نتحرك على الفور ليزر الأشعة تحت الحمراء لديها حبة المحاصرين محاذاة على وسط محوار، مع بقعة الليزر الأشعة فوق البنفسجية تركزت على نفس محوار جدا. يتم وضع بقعة الأشعة تحت الحمراء وبالتالي حبة المحاصرين على طول محوار5-10 ميكرون بعيدا عن بقعة الأشعة فوق البنفسجية. نحن نتحرك موقف الأشعة تحت الحمراء فيما يتعلق بقعة الأشعة فوق البنفسجية اعتمادا على هندسة محوار. في حال لم يتم تجهيز ملاقط بصرية مع نظام حركة تحرير السودان، والموقف يمكن أن تختلف حسب المرايا إمالة، أو انحراف البصرية الصوتية، على مسار بصري IR. بقعة الليزر IR قد يكون وضع 5-10 ميكرون بعيدا عن بقعة الأشعة فوق البنفسجية لتجنب التفاعل البصري للشعاع تشريح مع التحقيق المحاصرين، التي يمكن أن تؤثر تلقاء البراونية وتغيير آثار الطيفي قوة.
4. بعد تحديد الموضع الجديد بقعة الأشعة تحت الحمراء فيما يتعلق بقعة الأشعة فوق البنفسجية وموقف اكسون، حرك مرحلة لوضع المحاصرين حبة بعيدا عن محور عصبي وتجنب الاصطدام معها. تحريك الموقف المحوري للمحاصرين حبة إلى حوالي 2 ميكرومتر فوق الغطاء الزجاجي.
5. محاذاة QPD إلى مركز هامش تدخل عليه: x و y QPD الإشارات التفاضلية هي الأصفار عندما يتم توسيط QPD. الحصول على 5 ثانية من الحركة البراونية من المحاصرين حبة من interferoمتر، عند 50 كيلوهرتز معدل أخذ العينات. الحصول على صلابة (PN / نانومتر) والحساسية (V / نانومتر) من فخ البصرية من خلال طريقة طيف الطاقة ^18.

6. نعلق الخرزة لاكسون. أداء قياس قوة Axotomy ومتزامنة

1. رفع موقف حبة مفخخة حوالي 4 ميكرون فوق الغطاء الزجاجي، ونقله إلى موقف المرحلة التي تم حفظها سابقا (انظر الخطوة 3.2).
2. نقل إلى أسفل حبة المحاصرين نحو محور عصبي حتى إنها تجري اتصالات مع محوار. ويتم رصد الاصطدام بين حبة المحاصرين ومحور عصبي من قبل Z QPD إشارة الكشف عن تشريد المحاصرين حبة في الاتجاه المحوري.
3. انتظر 10 ثانية مع حبة المحاصرين دفعت ضد محور عصبي لصالح انضمامها إلى الغشاء محوار.
4. نقل المرحلة الدقيقة لتهجير المحاصرين حبة من محور عصبي، وبالتالي تحقق الالتصاق به لغشاء الخلية. إذا كانت حبة الالتزام، فإنه يهرب من فخ البصرية.
5. نقل مرة أخرى في فخ الليزر على حبة الالتزاموالتبديل على الحلقة قوة المشبك مع حالة قوة مساوية للصفر. في مثل هذه الطريقة، وتتأهب بيزو مرحلة حبة، تعلق على الخلية، على مركز فخ البصرية. إذا لم يكن لديك نظام لمراقبة رد الفعل، والموقف فخ يزر يمكن أن تكون انتقلت من مرحلة المجهر لمركز تقنية المعلومات على تحقيق الالتزام. يتم الوصول إلى مركز من فخ عند الإشارات QPD هي نفسها كما هو الحال عندما يتم المحاصرين حبة وليس انضمت إلى خلية (x و y QPD إشارات تساوي الصفر، وإشارة Z QPD يعطي مجموع الجهد نفسه من الأرباع الأربعة كما هو الحال عندما يتم المحاصرين حبة بعيدا عن أي سطح).
6. تعيين حالة قوة المشبك على محور Z، وتحديد المواقع الليزر محاصرة ما يزيد قليلا عن وسط حبة (حوالي 100 نانومتر)، لتوليد ادعاء على الالتزام التحقيق المحاصرين. في حالة عدم تجهيز نظام مع جهاز تحكم عن القوة، المشبك، موقف فخ البصرية يمكن أن تثار حتى في الخطوات من 25 نانومتر بواسطة المسرح المجهر. وQPD إشارة Z يسمح الرصد. ولذلك، استخدم ثيS الإشارة لضبط الموقف من فخ الليزر فيما يتعلق مسبار الالتزام. ثمة حاجة إلى مثل التوتر قبل لاستشعار الضغط على الغشاء بعد الآفة محور عصبي، وما يترتب عليه من انخفاض الحركة البراونية لجنة التحقيق الالتزام. وقد اقترح اتباع نهج مماثل لقياس الافراج عن التوتر في حبل الغشاء عن طريق الفيديو التصوير ^19.
7. التحول من ردود الفعل قوة المشبك لقياس القوة على تحقيق الالتزام في حالة وضع المشبك (يتم حظر المرحلة بيزو).
8. بدء التسجيل في وقت واحد من المواقف التحقيق المحاصرين من خلال تداخل (20 تردد أخذ العينات كيلو هرتز)، والخلية خلال الليزر axotomy الوقت الفاصل بين التصوير مشرق الميدان (20 هرتز معدل الإطار).
9. بدوره على الليزر الأشعة فوق البنفسجية لتسليم نبضات الليزر حتى يصبح آفة مرئية على صورة من محور عصبي (وعادة ما يحتاج 200-400 نبضات ضوئية الطاقة لكل والنبض: 25 NJ)، ثم إيقاف تشغيل الليزر الأشعة فوق البنفسجية.
10. يستمر التسجيل عن طريق تداخل لمدة 3 ميلن، حتى X و Y و Z آثار QPD التوصل إلى الهضبة.

7. قياس مجموع الافراج عن التوتر

1. تحويل آثار QPD المسجلة (في فولت) من قبل حساسية معايرة من فخ البصرية، للحصول على آثار منها في نانومتر.
2. تحديد X، Y، Z وآثار التهجير من قبل مرشح تمرير عال مع قطع في 10 هرتز.
3. حساب التباين الكلي من آثار تصفيتها تمثل الحركة البراونية من حبة المحاصرين. حساب التباين في 25 خطوات ميللي ثانية للتداخل النوافذ وقت 500 ميللي ثانية (10،000 نقاط البيانات) ^20. لتمريرة عالية تصفية آثار يستثني التغيرات في الحركة البراونية بسبب تذبذب غشاء أو حركة الأكتين القشرية. يتم تقليل الحركة البراونية من حبة من قبل قوات البصرية وقوات التصاق على غشاء الخلية. عند توتر الغشاء بسبب الإفراج عن التوتر هو زيادة اللزوجة، وبالتالي فإن الحركة البراونية للحبة، الكشف عن immediالمبتلة تماما بعد axotomy، ويبدأ في الانخفاض.
4. تحديد T0: بداية انخفاض التباين الحركة البراونية، بعد تسليم الطاقة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. وT0 فورية الوقت يدل على بداية سلالة الغشاء.
5. تعريف T1: نهاية انخفاضا من التباين الحركة البراونية (عندما تصل إلى الهضبة). وT1 فورية الوقت يشير إلى نهاية سلالة الغشاء.
6. أداء تتبع الفيديو من الحطام أو خدش على دعم الغطاء الزجاجي، لقياس أي انحراف في العينة خلال قياس قوة. لتتبع الجسيمات على دعم الزجاج، ونحن أول تطبيق عتبات الي صور زاهية الميدان، للحصول على كومة من صور ثنائية مع الجسيمات باللون الأبيض على خلفية سوداء. ثم، ونحن تتبع مركز الجسيمات الكتلة مع دقة الفرعي بكسل (باستخدام برنامج ImageJ مجانية).
7. طرح الانجراف تقاس من آثار QPD النزوح. مضاعفة آثار QPD مصحح الانجراف من قبل صلابة البصرية معايرة منها (ك _س، ك Y، _Z K) للحصول على العملات الأجنبية، السنة المالية، آثار FZ في piconewtons.
8. حساب تتبع القوة الكلية كما F _TOT = √ (FX ² + ² + السنة المالية FZ ^2).
9. حساب الإفراج مجموع القوة بين T0 و T1 كما _صدر F = F _TOT (T1) - F _TOT (T0). القوة تقاس في T0 لابد من طرح لأنه يرجع إلى النزوح من لجنة التحقيق من وسط فخ، عندما تلتزم حبة إلى محوار.
10. حساب مساحة الاتصال محوار بين حبة المحاصرين والأشعة فوق البنفسجية موقف بقعة الليزر: على مقياس صورة مشرقة الحقل طويل (L) وقصيرة محاور (D) من محوار بين حبة المحاصرين والأشعة فوق البنفسجية موقف بقعة الليزر. منطقة الاتصال محوار هو _{محور عصبي} = L X D.
11. تطبيع مجموع F القوة صدر _صدر عن منطقة الاتصال محوار _{محور عصبي.}

النتائج

الخلية يولد قوات الجر على الركيزة التي كتبها الالتصاقات البؤرية لها. القوة المتولدة من قبل عناصر هيكل الخلية هي في حالة توازن مع القوة مواجهة الركيزة الثقافة. بعد الليزر التي يسببها آفة من محوار، تتعطل بعض من الكابلات الهيكل الخلوي المتوترة ويتم تحريرها التوتر على م...

Discussion

نفيدكم في هذا العمل أسلوب كمي لمقارنة التصاق محوار إلى الركيزة ثقافة، في وقت واحد عن طريق إجراء القياس الطيفي قوة الليزر خلال الناجم عن آفة الخلية. ويرتبط الإفراج قياس التوتر لدرجة التصاق الخلية إلى الركيزة: يجب أن الخلايا تحتوي على عدد أكبر من الالتصاقات البؤرية ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated	Bangs laboratories	PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit	Polyscience	19539
EQUIPMENT
IR laser	IPG Laser GmbH	YLM-5-SC-LP	ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator	Hamamatsu	LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software	Optics group, University of Glasgow	Free downloadable software	http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ	Hamamatsu	Free downloadable software	http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD	Thorlabs	S5980 with C5460SPL 6041 board	Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD	Teem Photonics	PDA100A-EC	Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser	AA-optoelctronics	PNV-001525-040	Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator	Olympus	MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope	Andor	BX51	Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD	Warner Instruments	V887ECSUVB EMCCD
Peltier device	Physic Instruments	QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage	National Instruments	Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq		NI PCI-6229	Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine			Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop