بروتوكولات لتقييم الترددات الراديوية التفاعل مع جزيئات الذهب ونظم البيولوجية لغير الغازية ارتفاع الحرارة علاج السرطان

Summary

نحن تصف البروتوكولات المستخدمة للتحقيق في تفاعلات 13.56 ميغاهرتز الترددات الراديوية (RF) الحقول الكهربائية مع الغرويات جسيمات متناهية الصغر من الذهب في كلا النظامين غير البيولوجية والبيولوجية (في المختبر / فيفو). ويجري التحقيق في هذه التفاعلات لتطبيقات في علاج السرطان.

Abstract

علاجات السرطان التي هي أقل سمية والغازية من نظيراتها الموجودة هم مرغوب فيه للغاية. استخدام الترددات اللاسلكية المجالات الكهربائية التي تخترق عميقا في الجسم، مما يسبب الحد الأدنى من السمية، ويجري حاليا دراستها باعتبارها وسيلة ناجعة لعلاج السرطان غير الغازية. ومن المتوقع أن تفاعلات الطاقة RF مع النانوية المنضوية (NPS) يمكن تحرير الحرارة التي يمكن أن تسبب ارتفاع درجة الحرارة ثم (ارتفاع الحرارة) للخلية، وتنتهي في نهاية المطاف في نخر الخلية.

في حالة الأنظمة غير البيولوجية، نقدم بروتوكولات مفصلة تتعلق قياس الحرارة حررها الغرويات NP تتركز بشكل كبير. لالنظم البيولوجية، في حالة من التجارب في المختبر، ونحن تصف التقنيات والشروط التي يجب الالتزام بها من أجل فضح الخلايا السرطانية بشكل فعال للترددات اللاسلكية RF معظم القطع الأثرية دون التدفئة وسائل الاعلام التعتيم بشكل كبير من البيانات. أخيرا، نعطي و منهجية مفصلةأو في نماذج الماوس المجراة مع أورام سرطان الكبد خارج الرحم.

Introduction

امتصاص الطاقة RF بواسطة الأنسجة البيولوجية (بسبب السماحية الكهربائية الكامنة) يؤدي إلى درجات حرارة مرتفعة الأنسجة بوصفها وظيفة من الوقت، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى موت الخلايا عن طريق ارتفاع الحرارة. هو الافتراض بأن ارتفاع الحرارة السرطان يمكن أن يكون الأمثل من خلال استخدام المواد النانوية المستهدفة التي تستوعب داخل الخلايا السرطانية وتكون بمثابة محولات RF-الحرارية، وترك صحية، والخلايا الطبيعية المجاورة سليمة. وقد أظهرت العديد من التقارير بالفعل أن مجموعة متنوعة من مصادر الطاقة النووية يمكن أن تكون مصادر الحرارة RF اعتبارا التي تساعد في نخر السرطان ^1-4.

في هذه التحيات، مصادر الطاقة النووية الذهب (AuNPs) ^3-5، أنابيب الكربون النانوية ^1، ونقاط الكم ^{6، 7} أظهرت خصائص مثيرة عندما تستخدم في كل من في المختبر والتجارب في RF الجسم الحي. على الرغم من أن الطبيعة الدقيقة للآلية تسخين هذه مصادر الطاقة النووية عندما يتعرض له المجال RF ما زال قيد المناقشة، سلسلة منالتجارب الأساسية باستخدام AuNPs قد وضعت أهمية كبيرة على كل من حجم NP والدول التجميع. فقد تبين أن AuNPs فقط بأقطار <10 نانومتر سوف الحرارة عندما تتعرض إلى ^RF-8 الحقل. أيضا، هو الموهن هذه الآلية التدفئة بشكل ملحوظ عندما يتم تجميعها في AuNPs. تم التحقق من صحة هذا الشرط التجميع أيضا داخل في المختبر النماذج التي وضعت على أهمية تحسين AuNP الاستقرار داخل حجرات داخل الخلايا الغروية endolysomal لعلاج فعال RF ^4. ومع ذلك، يمكن للتقنيات ومبادئ التجريبية المستخدمة في جمع وتقييم هذه البيانات تكون إشكالية، لا سيما في حالة التحقق من صحة RF ملامح الحرارة من الغرويات NP.

وقد أظهرت العديد من التقارير التي تفيد بأن التدفئة الجول لتعليق الأيونية الخلفية التي علقت مصادر القدرة النووية في يمكن أن يكون المصدر الرئيسي للإنتاج الحرارة RF وليس مصادر الطاقة النووية أنفسهم ^9-12. على الرغم من ورقتنا الأخيرة ⁸ والتحقق من صحتها رانه استخدام التفاعلات RF في توليد الحرارة من AuNPs من أقطار أقل من 10 نانومتر، ونحن نهدف لوصف هذه البروتوكولات بمزيد من التفصيل خلال هذه المقالة.

نحن أيضا تدليل على البروتوكولات والتقنيات اللازمة لتقييم فعالية AuNPs كعوامل الحرارية في كل حموي في التجارب المختبرية والتجارب المجراة لنماذج سرطان الكبد. على الرغم من أننا نركز في المقام الأول على الغرويات بسيطة من AuNPs المغطاة سيترات، نفس التقنيات يمكن تطبيقها على AuNP الهجينة الأخرى مثل الأجسام المضادة والعلاج الكيميائي المجمعات مترافق. من خلال الالتزام بهذه المبادئ ينبغي أن التجريبي نأمل أن تكون قادرة على تقييم بسرعة إمكانية أي المواد متناهية الصغر ليكون وكيلا حموي الحرارية RF التي يسببها فعالة.

Protocol

ويصور لمحة تجريبية كاملة في الشكل 1.

وصفت مزيد من التفاصيل في الخطوات 1-3 أدناه.

1. تقييم RF التدفئة NP الغروية: AuNPs كمثال

1. بشكل عام، لكل عينة NP يجري التحقيق، وغسل أول العينة عدة مرات خلال مرشح الطرد المركزي مع منزوع الأيونات (DI) بالماء لإزالة أيونات الخلفية والملوثات. وسيكون قد تم إزالة جميع الملوثات من الأيونات وتعليق AuNP عندما السائل يجري جرفت ديه مماثلة معدلات التدفئة RF (ساعة) كما الماء DI. يسمح هذا أيضا عملية تنقية لتركيزات أعلى من مصادر الطاقة النووية التي يمكن الحصول عليها. تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من استخدام AuNPs في هذا المثال، المبادئ الأساسية يمكن تطبيقها على المواد NP الأخرى.
2. كمثال، وتنقية زجاجة 500 مل من AuNPs المتاحة تجاريا من قطر 5 نانومتر ومن ثم إخضاعها لمجال الترددات اللاسلكية 13.56 ميغاهيرتز الكهربائية فايELD قوة 90 كيلو فولت / متر.
   1. اتخاذ ~ 125 مل من محلول المخزون AuNP والانقسام بين ستة 50 كيلو دالتون أنابيب تصفية الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة. لمدة 2 دقيقة 5 ثانية. إزالة تصفيتها العازلة والملء المرشحات مع أكثر محلول المخزون. كرر حتى تم تصفيتها كل مل 500.
   2. استبدال العازلة تصفيتها مع حجم مماثل من الماء DI وتكرار ما يقرب من 8 مرات (أو حتى المخزن المؤقت الحقوقي RF تصفيتها تعادل المياه DI). ملاحظة، ويمكن أيضا أن تستخدم تحليل الأشعة فوق البنفسجية فيز لرصد قمم امتصاص الملوثات. مرة واحدة الملوثات عازلة قد أزيلت تماما، ماصة ما يقرب من 0.5 مل من الماء DI في كل مرشح و resuspend AuNPs من قبل pipetting المتكررة. هذا يجب إزالة تماما AuNPs من مرشح، والسماح لإعادة تعليق كامل. الجمع بين كل ستة معلقات في أنبوب واحد 15 مل إيبندورف.
   3. مرة واحدة تم تنقيته من AuNPs وتتركز، وتحليل عينة باستخدام ICP-OES و / أو ICP-MS، الأشعة فوق البنفسجية في مواجهة وزيتا المحتملة للبيانات على concentratioن والاستقرار NP، على التوالي. ويمكن أيضا أن تستخدم SEM و / أو تحليل TEM للحصول على بيانات المورفولوجية. إعداد نموذج مفصل لهذه التقنيات يمكن العثور عليها في الأدب ^4.
3. باستخدام نظام كانزيوس RF موضح في الدراسات السابقة ^8، أو الاشتقاقات من هذا النظام، ووضع 1.3 مل أسطواني الكوارتز كفيت ذلك أن المجال الكهربائي-RF في الهواء (مع عدم وجود عينة الوقت الحاضر) سيكون ~ 90 كيلو فولت / متر داخل كفيت. لعينة المالحة القياسية (0.9٪ كلوريد الصوديوم) ستنخفض إلى الحقل الكهربائي إلى ~ 1.1 كيلو فولت / متر. هذه هي الشروط تقريبية تستخدم للسماح إجراء مقارنات بين الأنظمة المختلفة.
   1. ماصة 1.3 مل من عينة 1،000 ملغ / لتر من تنقية الغروانية AuNP في كفيت الكوارتز وإدخال هذا في الميدان RF. ويمكن القيام بذلك عن طريق استخدام حامل العينة تفلون مبنية خصيصا. تعرض العينة إلى الميدان RF لمدة 120 ثانية أو حتى عينة تصل إلى 70 درجة مئوية لمنع الانحناء الكهربائية أو السريع الغليان. كاليفورنياpture البيانات التصوير الحراري (وكذلك مناطق السيطرة) باستخدام كاميرا الأشعة تحت الحمراء والبرمجيات المرتبطة بها. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات.
   2. تحديد العينة من خلال مرشح آخر الطرد المركزي 50 كيلو دالتون لاستخراج AuNPs من المخزن المؤقت المياه DI. إعادة فضح المخزن المؤقت إلى حقل الترددات اللاسلكية، ومرة ​​أخرى ثلاث مرات. الفرق في الحقوقي بين الغروانية AuNP والخلفية العازلة المياه DI يحدد HR بسبب AuNPs أنفسهم. نتوقع الحصول على ساعة من ~ 0.3 ° C / ثانية و 0.05 ° C / ثانية لإعطاء HR تعتمد AuNP من 0.25 ~ ° C / ثانية. resuspend وAuNPs المتبقية من مرشح في 1.3 مل من الماء عليها في المختبر التجارب المجراة /.

2. بمساعدة جسيمات متناهية الصغر التي يسببها ارتفاع الحرارة RF: دراسات في المختبر

1. ويمكن تطبيق هذه الدراسات في المختبر إلى أي نوع من السرطان نوع من الخلايا التي تشكل الطبقات الوحيدة 2D. في هذه التجربة استخدام سرطان الكبد حقوق الإنسان مستمد الخلايا Hep3B.
   1. لوحة ~ 50،000 سلليرة سورية في ثلاثة آبار أمام 12 لوحة جيدا مع 1 مل من وسائط النمو. كرر هذا 6 مرات (استخدام ثلاث لوحات للدراسات NP وثلاث لوحات والضوابط). احتضان عند 37.5 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل إدخال مصادر الطاقة النووية. تعقيم مصادر الطاقة النووية الأولى باستخدام السلامة الأحيائية مجلس الوزراء التعرض للأشعة فوق البنفسجية ضوء لمدة 5 دقائق.
   2. في كل إدخال جيدا 0.1 مل من محلول 1،000 ملغ / لتر AuNP ويترك لمدة 24 ساعة أخرى. إضافة 0.1 مل من الماء في كل بئر من لوحات التحكم الخلية الثلاثة وأيضا ترك لمدة 24 ساعة.
   3. بعد مرور 24 ساعة، ونضح وسائل الإعلام خلية ويغسل مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي AuNPs محددة السطح. استبدال وسائل الإعلام الخلية. الخلايا هي الآن على استعداد للتعرض RF.
2. وضع كل حزمة الخلية 12 جيدا داخل الميدان RF. الانتظار حتى فترت الخلايا إلى 31 درجة مئوية. تشغيل المولد RF وفضح ل3.5 دقيقة. فإن درجة الحرارة النهائية من وسائل الإعلام خلية تكون ~ 37 درجة مئوية. إيقاف مجال الترددات اللاسلكية. إزالة الخلايا ووضعها في حاضنة لمدة 24 ساعة قبل التحليل.
   <لى> إزالة الخلايا من الحاضنة وسائل الإعلام خلية نضح. إضافة 1.6 مل من وسائل الإعلام خلية إلى كل بئر وكذلك في 0.4 مل من كاشف الإنتقالي العسكري. احتضان الخلايا لمدة 4 ساعة. وسائل الاعلام نضح واستبدالها مع 2 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). وضع لوحات الخلايا على مقعد الروك ويترك لمدة 10 دقيقة للسماح للDMSO إلى ذوبان الكواشف الإنتقالي العسكري. أخيرا، ماصة 100 ميكرولتر من كل بئر في لوحة 96 جيدا وبصريا قراءة جيدا في 570 نانومتر باستخدام قارئ لوحة مثل لوحة قارئ SPECTROstar نانو.

3. بمساعدة جسيمات متناهية الصغر التي يسببها ارتفاع الحرارة RF: في الجسم الحي دراسات

1. ويمكن تطبيق هذه في الدراسات المجراة على أي نوع من السرطان الذي يشكل الأورام الصلبة في نموذج الفئران مثلي أو خارج الرحم. يستخدم هذه التجربة Hep3B خلايا سرطان الكبد في الورم BALB-C نموذج الفأر عاري خارج الرحم.
2. ملاحظة: يتم تنفيذ جميع التجارب المجراة في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية ذات الصلة واللوائح والوكالات التنظيمية. أيضا، تم تنفيذ بروتوكول شرحها تحت إشراف وموافقة من جامعة تكساس MD اندرسون للسرطان جنة مراكز رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية (IACUC).
   1. ينمو عدد مناسب من الخلايا (~ 100 ك) في قارورة الثقافة الأنسجة مع متوسط ​​النمو المناسبة. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ لمدة خلية ثقافة.
   2. علاج الخلايا مع التربسين (لفصل من القارورة) وتنتج حلا من 2 مليون خلية لكل ميكرولتر 25. إضافة كمية متساوية من Matrigel (على الجليد) وتخلط جيدا لإعداد الحل الحقن النهائي. حقن هذا الحل في الموضع المطلوب على ظهره الماوس، والانتظار لكمية مناسبة من الوقت للأورام لتنمو إلى الحجم المطلوب (2-4 أسابيع لمعظم الخلايا). قبل التعرض RF، ينبغي BALB-C الفئران عارية تحمل الأورام الصلبة خارج الرحم 0.5-1 سم القطر.
3. 1. إعداد الفئران لاستخدامها (في هذه الحالة BALB-C الفئران عارية) من قبل نزلتsthetizing لهم حلا من الكيتامين وزيلازين عن طريق الحقن IP. في حين أن الفئران والنوم، والاحتفاظ بها في غرفة التحكم بدرجة حرارته عند 37 درجة مئوية. وسوف تكون هناك حاجة إلى 20 الفئران في المجموع، كل حجم الأورام مماثلة تحمل. وسوف تستخدم عشرة الفئران بالاشتراك مع وبدون AuNPs (وهذا الأخير هو حقن PBS فقط) في حين سيتم تقسيم 10 الفئران المتبقية بين RF مكشوفة وغير مكشوفة الضوابط RF: كلا الفريقين مع عدم وجود الحقن AuNP.
   2. مرة واحدة مخدرة بشكل صحيح، حقن AuNPs مباشرة داخل الورم باستخدام حقنة سم مكعب 1-27 G مع إبرة. وينبغي أن يكون الحل AuNP بتركيز الاتحاد الافريقي من 200 ملغ / لتر في 0.1 مل من برنامج تلفزيوني. بعد الحقن، واستخدام مسحة الجراحية لامتصاص الدم ومسح موضع الحقن مع الكحول مسح.
   3. ثم تحميل الماوس في أن يعامل على رأسه تلقيه لمولد الترددات اللاسلكية. يجب وضع الماوس بحيث الورم الأقرب إلى رئيس الإرسال. حماية المناطق التي لا يمكن علاجها، وكذلك سينسيTIVE مجالات مثل العينين والأذنين واليدين والقدمين، مع شريط النحاس. تأكد من أن الشريط النحاس والاتصال بشكل مناسب الطائرة التأريض بحيث لا يحدث تراكم تهمة. أيضا، يجب أن يكون مجال التعرض فجوة من 1 سم على الأقل أكبر من حجم موقع العلاج المطلوب.
   4. كاميرا الأشعة تحت الحمراء الحرارية الموقف بحيث الورم والمنطقة المعالجة واضحة. بدوره على الترددات اللاسلكية لمدة 5 دقائق. تسجيل منحنى درجة الحرارة الناتجة عن ذلك. إذا يحقق العلاج درجات حرارة أعلى من 42 درجة مئوية العلاج تتوقف على الفور.
4. 1. بعد التعرض لموجات استرداد الفئران من التخدير في غرفة دافئة حتى تكون واعية.
   2. تكرار التجربة مع نفس الفئران 48 ساعة في وقت لاحق (الخطوات 3.3.1 - 3.4.1).
   3. بعد التجربة، الموت ببطء الفئران وفقا للبروتوكولات وإجراءات مؤسسية. تسجيل وزن الورم. للتحليل النسيجي إصلاح الأورام باستخدام الفورمالين وتضمينها في البارافين. وعادة ما تكون ملطخة أقسام الورم الطرافةح الهيماتوكسيلين ويوزين والأهداف ذات الصلة لقياس الكفاءة العلاجية، مثل كي 67، المشقوق كاسباس 3، الخ.

النتائج

1. تقييم التدفئة RF من NP الغرويات: AuNPs كمثال على ذلك.

بعد اتباع القسم 1.1 - 1.2.3 نتوقع أن يكون مركزا للغاية، حل مستقر، وتنقيته من 5 نانومتر و 10 نانومتر AuNPs القطر. من 500 مل كما هو وشراء محلول المخزون، ونتوقع الحصول على ما لا يقل عن 4 مل من محلول ...

Discussion

هذه البروتوكولات تسمح التجريبي لتحليل كامل لمدى متناهية الصغر (في هذه الحالة AuNPs) يمكن أن تزيد من ارتفاع الحرارة الناجم عن الترددات اللاسلكية لعلاج السرطان. يتناول البروتوكول الأول تحديدا مع تحليل عينات من إنتاج الحرارة العالية تتركز AuNP وتنقيته. على الرغم من أن مجمو?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
500 ml gold nanoparticles (5 nm)	Ted Pella, INC	15702-5
Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa)	Millipore	UFC805024/UFC910096	(4 ml and 15 ml volumes)
MEM X1 Cell Culture Media	Cellgro	10-101-CV	(add extra nutrients as necessary)
Fetal Bovine Serum	Sigma	F4135-500 ml
Copper Tape	Ted Pella	16072
Equipment
Kanzius RF System (13.56 MHZ)	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
IR Camera	FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA)	Contact FLIR
1.3 ml Quartz Cuvette	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
Teflon Sample holder with Rotary Stage	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
SPECTROstar Nano Microplate reader	BGM Labtech
UV-Vis spectrometer	Applied Nanofluorescence, Houston, TX)	NS1 NanoSpectralyzer
ICP-–S	PerkinElmer	Optima 4300 DV
Zetasizer	Malvern	Zen 3600 Zetasizer