يعيش التصوير خلية من الأحداث الالتهام الذاتي المبكر: Omegasomes وما بعدها

Summary

الوقت الفاصل بين المجهري من علامات الالتهام الذاتي fluorescently المسمى يسمح رصد استجابة الالتهام الذاتي ديناميكية مع القرار الزماني عالية. باستخدام الالتهام الذاتي محددة وعلامات عضية في مزيج من 3 ألوان مختلفة، ونحن يمكن أن يتبع مساهمة بروتين لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي في سياق المكاني والزماني قوية.

Abstract

الالتهام الذاتي هو استجابة الخلوية الناجمة عن نقص المواد الغذائية، وخاصة لعدم وجود الأحماض الأمينية. يتم تعريف الالتهام الذاتي من قبل تشكيل هياكل غشاء مزدوج، ودعا autophagosomes، أن تنحية السيتوبلازم والبروتينات طويلة الأمد والمجاميع البروتين، العضيات معيب، وحتى الفيروسات أو البكتيريا. Autophagosomes تلتحم في نهاية المطاف مع الجسيمات الحالة مما يؤدي إلى تدهور الجزء الأكبر من محتواها، مع المواد الغذائية المنتجة التي يجري إعادة تدويرها مرة أخرى إلى السيتوبلازم. ولذلك، الالتهام الذاتي هو أمر حاسم لتوازن الخلية، والتقلبات من الالتهام الذاتي يمكن أن يؤدي إلى المرض، وأبرزها تنكس عصبي والشيخوخة والسرطان.

تشكيل جسيم بلعمي ذاتي هو عملية معقدة جدا، لالخلايا التي خصصت مجموعة معينة من البروتينات، ودعا الآلية الأساسية الالتهام الذاتي. الآلية الأساسية الالتهام الذاتي ويكمل وظيفيا من البروتينات إضافية تشارك في العمليات الخلوية المتنوعة، على سبيل المثال في MEMBRANالاتجار ه، في علم الأحياء الميتوكوندريا والليزوزومية. التنسيق بين هذه البروتينات لتشكيل وتدهور autophagosomes يشكل استجابة ديناميكية للغاية ومتطورة من الالتهام الذاتي. تصوير الخلايا الحية يسمح احد لمتابعة مساهمة الجزيئي للبروتين كل المتصلة الالتهام الذاتي وصولا الى مستوى حدثا تشكيل جسيم بلعمي ذاتي واحد وفي الوقت الحقيقي، وبالتالي هذه التقنية توفر دقة الزمانية والمكانية العالية.

هنا نستخدم خط خلية معربا عن GFP-DFCP1 ثابت، لتأسيس السياق المكاني والزماني لتحليلنا. DFCP1 علامات omegasomes، التي هي هياكل السلائف تؤدي إلى تشكيل autophagosomes. يمكن أن تكون علامة A البروتين من الفائدة (POI) مع إما أحمر أو أزرق سماوي علامة فلوري. العضيات المختلفة، مثل ER، الميتوكوندريا والجسيمات الحالة، وتشارك في جميع الخطوات المختلفة من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي، ويمكن أن تكون علامة باستخدام صبغة تعقب محددة. الوقت الفاصل بين المجهري من AUTOPهاجي في هذه المجموعة التجريبية أعلى، يسمح للمعلومات ليكون استخراجه عن البعد الرابع، أي وقت. ومن هنا يمكننا أن اتباع مساهمة POI إلى الالتهام الذاتي في المكان والزمان.

Introduction

الالتهام الذاتي هو عملية ديناميكية للغاية، الأمر الذي يتطلب التنسيق لعدد كبير من البروتينات لالنتيجة النهائية لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي ^1-3. المجهري هو على الارجح تقنية تطبيقها الأكثر شيوعا لدراسة الالتهام الذاتي ^4. توطين معظم البروتينات الالتهام الذاتي وقد درس على نطاق واسع في الخلايا الثابتة، سواء من جانب المناعية تلطيخ البروتينات الذاتية والتعبير عن الموسومة fluorescently البروتين الخارجية. وبالإضافة إلى ذلك، وقد وصفت المجهر الإلكتروني (EM)، وحده، وبالاشتراك مع وضع العلامات المناعية الذهب، التفاصيل الدقيقة لهذه الهياكل ^5،6. على الرغم من حقيقة أن وضعت هذه التقنيات فهمنا لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي في الأبعاد 3 من الفضاء، إلا أنهم فشلوا في توفير كمية كافية من المعلومات حول البعد ^ال 4 - الوقت. تصوير الخلايا الحية يتغلب على هذا الحاجز كما أنه يسمح في أعقاب تشكيل جسيم بلعمي ذاتي أقرب ما possiبلي لفي الوقت الحقيقي ^7. كان يعمل هذا الأسلوب الأول لدراسة الالتهام الذاتي من قبل Yoshimori وزملاؤه ^8، واستخدمت على نحو متزايد من الآن فصاعدا.

الوقت الفاصل بين المجهري يلتقط توطين POI في الخلايا الحية وعلى مدى فترة من الزمن. من خلال مقارنة هذه المعلومات مع الالتهام الذاتي جيدا اتسم و / أو علامة عضية، يمكن تحليل التصوير الخلية الحية وضع POI في سياق المكاني والزماني أكبر من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي. ويستند تحليل التصوير الخلية الحية على اسر المتكررة من توطين POI على طول جميع الخطوات من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي، في حين يستند التصوير من الخلايا الثابتة على التقاط واحدة. لذلك، يمكن تصوير الخلايا الحية تثبت مساهمة POI في خطوات محددة من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي، في حين التصوير من الخلايا الثابتة إلا أن نفترض دور POI، على أساس متوسط ​​التوطين في العديد من autophagosomes القبض في وقت واحد في مراحل مختلفة من lifecy بهمكلي.

على الرغم من أن التصوير الخلية الحية هي طريقة لقوة تحليلية عالية، لديها بعض القيود المتأصلة، التي ينبغي أن تؤخذ بعين الاعتبار. بادئ ذي بدء، تصوير الخلايا الحية يتطلب التعبير عن واحد أو أكثر من البروتينات الخارجية fluorescently المسمى. به نيون تميل إلى أن تكون كبيرة في حجمها وأنها يمكن أن يغير في بعض الأحيان سلوك من البروتين وذلك لأسباب الفراغية. ويتفاقم هذا الوضع بالنسبة للبروتينات الغشاء، لأنها تحتاج لتعمل في مساحة محدودة من أبعاد 2 من الأغشية. من المذكرة، autophagosomes هي هياكل غشائي، وفقا لتكوينها يتطلب عددا كبيرا من البروتينات المرتبطة الغشاء.

يتم توصيل مجموعة أخرى من المشاكل إلى مستويات التعبير من POI. من حيث المبدأ، ينبغي التعبير عن بروتين الخارجية عند مستويات مماثلة لبروتين الذاتية. وهذا يضمن أن المنظمين هامة للتوطين في شبه الخلوية لن تكون مشبعة، وعشرةوتحليل ه تكون ذات صلة من الناحية البيولوجية. وعلاوة على ذلك، ينبغي تجنب overexpression من البروتينات الالتهام الذاتي، كما هو الحال عندما يتم التعبير عنها فوق المستويات المحلية، فإنها تميل إلى تثبيط استجابة الالتهام الذاتي ^9. وعلى العكس، منذ مستويات التعبير عن POI ينبغي أن تكون عالية بما يكفي للسماح بعد الأقلمة الذي تضطلع به لفترة جيدة من الوقت بدون صورة تبيض، حلا وسطا لابد من التوصل إليها. تحقيق مستويات التعبير الأمثل من البروتين في الخلايا الخارجية mammalians يتطلب الكثير من ضبط، ولكن كان من الممكن من خلال إنشاء وفحص خطوط الخلايا معربا عن ستابلي مستويات مختلفة من POI.

القرار المكانية التي لا يمكن أن يتحقق مع المجهري مضان هو معيار عامل آخر يحد. قد يكون القرار محدودة لعدد من الأسباب، ولكن في أحسن الأحوال، سوف يكون القرار الجانبي حوالي 250 نانومتر. وهذا يعني أن أي أجسام مفصولة مسافة أصغر من هذا سوف تظهر متصلة (أو كوحدة واحدةكائن) وكائنات أصغر من 250 نانومتر سوف تكون ممثلة في الصورة أكبر مما هي عليه في الواقع. ولذلك ينبغي دائما أن تفسر الصور مع هذا في الاعتبار، وسوف تكون هناك حاجة تقنيات تكميلية مثل EM لحل التفاصيل فائقة الهيكلية غرامة.

وأخيرا، تصوير الخلايا الحية يتطلب بطبيعته تعريض الخلايا للضوء، ويحتمل أن تكون لفترة طويلة من الزمن. وهذا قد يغير من الاستجابات الفسيولوجية للخلية، وهي ظاهرة تعرف باسم صورة سمية.

لقد استخدمت بنجاح التصوير الخلية الحية من البروتين PI3P ملزم DFCP1 لوصف للمرة الأولى التي تنشأ من autophagosomes الغنية PI3P مثل خاتم الهياكل omegasomes يطلق عليه، والتي هي في ارتباط وثيق مع فروع ER ^10،11. لقد أظهرنا بوضوح أن هياكل إيجابية LC3 بدء تشكيل في ارتباط وثيق مع omegasomes. نقترح هنا أن توظيف خط خلية معربا عن GFP ثابت-DFCP1 للخلية الحيةالتصوير من البروتين من الفائدة، ويضع الإطار المكاني والزماني قوي لتوصيف دورها في تشكيل جسيم بلعمي ذاتي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد الخلية

1. البذور منخفضة عدد مرور الخلايا HEK-293T معربا عن ستابلي GFP-DFCP1 في 22 coverslips على جولة مم؛ خلايا الثقافة بين عشية وضحاها في متوسطة Dulbecco التعديل النسور في (DMEM)، إلى confluency من 30-40٪ (الهدف لconfluency من 80٪ بعد 2 أيام - يوم من التصوير الخلية الحية).

2. ترنسفكأيشن الخلية

1. تحضير مزيج ترنسفكأيشن المعقدة لكل لوحة، والتي تحتوي على 100 ميكرولتر OptiMEM أنا خفضت المتوسطة المصل، 3 ميكرولتر X-tremeGENE 9 الحمض النووي الكاشف ترنسفكأيشن، و 0.5 ميكروغرام من pECFP-LC3 DNA البلازميد. المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا واحتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. [ملاحظة: لقد وجدنا مرارا وتكرارا أن الكواشف ترنسفكأيشن أخرى، مثل Lipofectamine عام 2000، لديهم الكثير من سمية، وبالإضافة إلى ذلك، فإنها تنتج جزيئات الفلورسنت من تلقاء نفسها التي تتداخل مع العديد من تقنيات الفحص المجهري.]
2. نضح المتوسطة من لوحات وإضافة جديدة DMEM قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية.
3. إضافة ترانsfection المعقدة للخلايا قبل pipetting؛ الخلايا احتضان لمدة 24 ساعة.

3. الحضانة الخلية مع ماركر العضيم (اختياري)

1. إضافة mitotracker / lysotracker إلى DMEM في تركيز النهائي من 75 نانومتر، والحفاظ على الجليد، في أنبوب فالكون مغطاة رقائق الألومنيوم، وعلى طول يوم كامل التجريبية، لتجنب التعرض للضوء وتجميد متكررة ودورات الذوبان.
2. إزالة قسامة من 2 مل من mitotracker / lysotracker المحتوية المتوسطة والاحماء عند 37 درجة مئوية؛ نضح المتوسطة من الخلايا transfected واستبدالها مع mitotracker / lysotracker التي تحتوي على الخلايا المتوسطة واحتضان لمدة 30 - 60 دقيقة.

4. إعداد غرفة الحضانة ليعيش التصوير خلية (الشكل 1)

1. نظيفة المعدن والبلاستيك O-حلقات مع 75٪ من الإيثانول وتطبيق الشحوم السيليكون على حافة من المعدن يا الدائري.
2. باستخدام ملقط إزالة ساترة من لوحة وتجفيف الفائض من المتوسط ​​من الجانب السفلي من ساترة،لتجنب الخلط كثيرا المتوسطة مع الشحوم، حيث سيؤدي ذلك إلى زيادة احتمال تسرب.
3. ترك ساترة للراحة على الحافة من البلاستيك يا الدائري وتناسب المعدن O-حلقة على الجزء العلوي من البلاستيك يا الدائري، مع ساترة تقع في بين، من أجل إنشاء غرفة مغلقة.
4. أعلى حتى مع غرفة متوسطة من لوحة، من هذه النقطة، وعلى، وتجنب الحضانة لفترات طويلة من الخلايا في DMEM المتوسطة دون وكيل التخزين المؤقت، لمنع التغييرات في الرقم الهيدروجيني إلى أن يحدث، حيث ان النظام العازلة بيكربونات DMEM يتطلب الاصطناعي تركيز CO ₂ من 5-10٪ وتركيز CO ₂ من الهواء المحيط هو أقل من ذلك بكثير.

5. تجويع الخلايا

1. وضع غرفة الحضانة على المسرح المجهر.
2. نضح المتوسطة كاملة ويغسل مع 2 مل من المتوسط ​​المجاعة 3 مرات، لضمان عدم وجود الأحماض الأمينية ظلت من DMEM، والتي سوف تمنع في نهاية المطاف استجابة الالتهام الذاتي؛ تعيينتوقيت ON.

6. المجهر

1. وسوف تكون هناك حاجة إلى نظام التصوير المناسبة لتكوين الخلية الحية واسعة المجال برنامج التحصين الموسع ومضان. هذا وسوف تتألف عادة من الدرجة البحوث إطار مجهر مقلوب، مكثفة واسعة الطيف مصدر الضوء، والمرايا والفلاتر محددة لبروتين فلوري (ق) / صبغ (ق) من الفائدة، عدسة الهدف جودة عالية، وCCD الحساسة / sCMOS كاميرا وغرفة الحضانة. جميع الشركات المصنعة الكبرى المجهر نقدم أنظمة واسعة المجال الكامل المناسبة لتصوير الخلايا الحية، ولكن من الممكن أيضا أن المنزل بناء نظام باستخدام مكونات من مجموعة متنوعة من الشركات المصنعة والسيطرة عليه باستخدام البرمجيات مفتوحة المصدر مثل الصغرى، مدير ( HTTP: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki / ). الجانب الأكثر أهمية في رأينا هو استخدام نظام من حساسية عالية جدا، بحيث يمكن أن تظل مستويات التعبير للصحفيين الفلورسنت إلى أدنى حد ممكن.
2. SELecting الخلايا المناسبة لصورة.
   1. حدد الخلايا الكبيرة والمسطحة التي تسمح الأحداث تشكيل أكثر جسيم بلعمي ذاتي ليتم القبض. أيضا، اختيار الخلايا التي قد بدأت بالفعل إنتاج عدد أكبر من omegasomes.
   2. بدء تسجيل الفيديو بعد 30 دقيقة أو جيدا في الاستجابة الالتهام الذاتي، من أجل الاستيلاء على نسبة أكبر من الأحداث تشكيل جسيم بلعمي ذاتي في الفيديو.
3. التصوير.
   1. استخدام عدسة التكبير عالية (100X 1.4 NA).
   2. ضبط كثافة الضوء الإثارة إلى 10-20٪ من الحد الأقصى لمنع الصور تبيض.
   3. ضبط الكاميرا (هاماماتسو ORCA ER، حجم بكسل 6.45 ميكرون) إلى 100-500 ميللي ثانية التعرض، binning 2X2 و 100 مكسب.
   4. تعيين معدل الحصول على الصور ل1 الإطار كل 10 ثانية.

7. خلق التنسيقات من الأحداث تشكيل جسيم بلعمي ذاتي مع يماغيج

ويمكن أن يتم [هذا بطريقة غير منهجية ببساطة عن طريق مسح الفيديو المدمجة للبريدالمخارج من الفائدة، ولكنه يمكن أيضا أن يكون المقنن كما هو مبين أدناه.]

1. مداخن صورة مفتوحة لل3 (أو 2) القبض على القنوات في ImageJ / فيجي.
2. تطبيق طرفية الأخضر والأحمر والأزرق (جداول البحث) إلى القناة المقابلة؛ دمج 3 ألوان وانقاذ.
3. من علامة التبويب تحليل، حدد أدوات> ROI مدير ... > تحديد، ثم حدد منطقة عشوائية من حجم محدد في الصورة الأولى من المكدس.
4. من علامة التبويب صورة، حدد تكرار، بما يضاعف من المساحة المحددة من المكدس.
5. من علامة التبويب صورة، حدد الأكوام> جعل المونتاج ... لإنشاء المونتاج مؤقتة تحتوي على القبض على جميع الإطارات. مسح جميع الأطر في المونتاج لاستكمال تشكيل حدث جسيم بلعمي ذاتي؛ حفاظ على الملاحظات من الإطار الأول والأخير من الحدث.
6. من علامة التبويب تحليل، حدد أدوات> ROI مدير ... حدد نفس المنطقة في الصورة الأولى من المكدس لأخرى 2 الألوان وكذلك للألوان الصورة المدمجة وتكرارا المداخن.
7. من tانه علامة التبويب ملف، اختر جديد> صورة، وتعيين لعرض وفقا لعدد من وحدات البكسل اختيارها في البداية باستخدام مدير ROI، تعيين لارتفاع 4 أضعاف ارتفاع تعيينها في إدارة العائد على الاستثمار بالإضافة إلى 3 بكسل للفضاء في فترة ما بين 3 ألوان ولل اندمجت، وتعيين شرائح وعدد الإطارات في كل ستاك.
8. من علامة التبويب صورة، حدد الأكوام> أدوات> إدراج ...، ثم تضاف كل واحد شبه كومة على رأس آخر، وترك مساحة من 1 بكسل في بين.
9. من علامة التبويب صورة، حدد الأكوام> جعل المونتاج ... لإنشاء المونتاج البدء والانتهاء مع الإطار الأول والأخير من الحدث تشكيل جسيم بلعمي ذاتي القبض عليه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في وصف البروتوكول، ونحن قد استخدمت الوقت الفاصل بين المجهري لمتابعة توطين CFP الموسومة LC3 في خط خلية معربا عن ستابلي GFP الموسومة DFCP1، في ظل ظروف حمل الالتهام الذاتي. نتائج هذه التجربة هو القبض على 2 سلسلة أو رزمة من الصور، واحدة من الأخضر واحد من القناة الزرقاء، الموافق G...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يسمح التصور من توطين بروتين خلال تشكيل جسيم بلعمي ذاتي. لقد حاولت وسائل مختلفة من تصور وصف الأحداث بما في ذلك نقطة مسح متحد البؤر، الغزل القرص مبائر وتوتال الإسفار التأمل الداخلي (TIRF) المجهري. لقد وجدنا أن لأغراض عامة القياسية واسعة...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	41965
OptiMEM I	Invitrogen	31985-062
MitoTracker Red FM	Invitrogen	M22425
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Applied Science	6365787001
22 mm coverslips	VWR	631-0159
35 mm plates	Fisher NUNC	153066
Silicon grease	RS Components Ltd.	RS 494-124
O-rings			Custom made
Attofluor Cell Chamber	Invitrogen	A-7816	Suggested alternative to custom-made O-rings
Microscope	Olympus	IX81	Inverted microscope
Objective	Olympus	UPLSAPO 100XO	N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5
Camera	Hamamatsu	ORCA-R2 C10600 10B	Progressive scan interline CCD
Illuminator	TILL Photonics	Polychrome V	Ultrafast monochromator
Incubation chamber	Solent Scientific	Cell^R IX81
Software	Olympus	SIS xcellence