JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

أجهزة الاستشعار مضان هي أدوات قوية في علوم الحياة. نحن هنا وصف منهجية لتجميع واستخدام أجهزة الاستشعار الفلورسنت القائم لقياس درجة الحموضة dendrimer في الخلايا الحية والحية. السقالة شجيري يعزز خصائص الأصباغ الفلورية مترافق مما يؤدي إلى تحسين خصائص الاستشعار عن بعد.

Abstract

وضع مؤشرات الفلورسنت يمثل ثورة لعلوم الحياة. المرمزة وراثيا وfluorophores الاصطناعية مع قدرات الاستشعار يسمح التصور من الأنواع ذات الصلة من الناحية البيولوجية مع القرار المكانية والزمانية عالية. الأصباغ الاصطناعية هي من سيما بفضل اهتمام tunability عالية ومجموعة واسعة من analytes قابلة للقياس. ومع ذلك، هذه الجزيئات تعاني العديد من القيود المتعلقة السلوك جزيء صغير (الفقراء الذوبان، صعوبات في الاستهداف، في كثير من الأحيان لا يسمح التصوير ratiometric). في هذا العمل ونحن نقدم تطوير أجهزة الاستشعار القائم على dendrimer وتقديم إجراء لقياس درجة الحموضة في المختبر، في الخلايا الحية والحية. نختار dendrimers كمنصة مثالية لأجهزة الاستشعار لدينا لخصائصها العديد من المرغوب فيه (monodispersity، خصائص الانضباطي، multivalency) التي جعلتهم سقالة تستخدم على نطاق واسع لعدة أجهزة الطبية الحيوية. والاقتران من درجة الحموضة الفلورسنتقاد مؤشرات لالسقالة dendrimer إلى تعزيز أداء الاستشعار الخاصة بهم. على وجه الخصوص dendrimers المعرض تقليل تسرب الخلايا، وتحسين استهداف الخلايا وتسمح قياسات ratiometric. تم توظيف هذه المجسات رواية بنجاح لقياس درجة الحموضة في الخلايا الحية في الجسم الحي وهيلا في مخ الفأر.

Introduction

استخدام جزيئات الفلورسنت لتسمية جزيئات محددة بيولوجيا ذات الصلة قد تغير تماما طريقة ندرس النظم البيولوجية. Widefield ومتحد البؤر المجهري يسمح لفي الوقت الحقيقي عالية الدقة التصور من العمليات البيولوجية وهذه الأيام هي من بين التقنيات الأكثر شعبية لدراسة الأحداث البيولوجية في المختبر، في الخلايا في الجسم الحي و. ومثلت 1 تحسن ذات الصلة من خلال تطوير مؤشرات مضان ، أي الأصباغ التي مضان يعتمد على تركيز كيان الجزيئي محددة. وكان الرقم الهيدروجيني المؤشرات والكالسيوم على وجه الخصوص لها تأثير كبير على دراسة علم وظائف الأعضاء الخلية نظرا لأهمية هائلة من H + وأيونات الكالسيوم 2 + في علم الأحياء. 2،3

ومع ذلك، فإن معظم الأصباغ الاستشعار الحالية العديد من القيود الجوهرية المتعلقة سلوكهم صغيرة جزيء مثل: ط) صعوبات في targeti التحت خلويةنانوغرام؛ ب) القابلية للذوبان الفقراء في مجال المياه وبالتالي سوء توافق مع الحياة؛ والثالث) تسرب الخلايا وبالتالي عدم وجود طويل الوقت الفاصل بين قدرة التصوير 4 وعلاوة على ذلك، في إشارة للعديد من تحقيقات لا يمكن تصحيحها عن الاعتماد على تركيز صبغة (غير التصوير ratiometric)، وبالتالي، على قياس المطلق في الخلايا في الجسم الحي أو غير ممكن.

وصفنا مؤخرا منهجية بسيطة وفعالة للتغلب على هذه القيود، على أساس اقتران من الأصباغ الاستشعار على السقالة dendrimer. 5 Dendrimers والبوليمرات hyperbranched monodisperse مع خصائص جذابة جدا للتطبيقات البيولوجية. 6 على وجه الخصوص وقد وضعت عدة أبنية شجيري واستخدامها لمكافحة المخدرات و7 وتوصيل الجينات. 8 فقط بدأت العديد من المجموعات قريب جدا لاستكشاف إمكانات هذه الجزيئات كما سقالة لأجهزة الاستشعار عن بعد. 9،10،11

نحن سابقاوصف طريقا سهلا نحو الاصطناعية functionalization من polyamidoamine مختلفة (PAMAM) السقالات على أساس استرات NHS تفعيلها. يمكن الحصول على 12 يصرف في خطوة واحدة عن طريق غسيل الكلى كما تنقية فقط. ومن المثير للاهتمام هذا النهج يمكن بسهولة أن تطبق على مجموعة متنوعة من السقالات شجيري أو البوليمر. 13،14

لتحقيق dendrimers التصوير ratiometric كانت المزدوج المسمى مع مجموعتين من الأصباغ: ط) مؤشر الرقم الهيدروجيني (أي فلوريسئين) والثاني) شاردة الفلورسنت درجة الحموضة مستقلة (أي رودامين). يسمح هذا لنا لأداء دقيقة التصوير ودرجة الحموضة والنسبة بين فلوريسئين ورودامين يعتمد فقط على درجة الحموضة وليس أكثر على تركيز التحقيق. ويمثل نهج أخرى مثيرة للاهتمام لهذه المشكلة عن طريق استخدام المجسات القائمة على عمر 15. وعمر لا يعتمد على تركيز التحقيق هذه القياسات لا تحتاج إلى تصحيح ratiometric. ومع ذلك، ليفقياسات etime تتطلب الإعداد فعال أكثر تعقيدا وحلها الزمني هو دون المستوى الأمثل للعمليات الفسيولوجية السريعة، مما يحد من تطبيقاتها المحتملة.

من أجل أداء التصوير داخل الخلايا، يحتاج التحقيق ليتم تسليمها عبر غشاء البلازما في العصارة الخلوية. كما dendrimers لا نفاذية غشاء نظرا لحجمها وhydrophilicity، يمكن أن يتحقق من خلال التسليم داخل الخلايا التثقيب الكهربائي. عن طريق هذا الأسلوب، وتستخدم على نطاق واسع في علم الأحياء لترنسفكأيشن، وصفت الجزيئات يمكن تسليمها على نحو فعال في الخلايا لأداء التصوير عالية الجودة. علاوة على ذلك، مع التثقيب الكهربائي المضاعفات المتصلة dendrimer الإلتقام يمكن تجنبها كما يتم تسليم الجزيئات مباشرة إلى السيتوبلازم. ومن المثير للاهتمام بعد التثقيب الكهربائي dendrimers مختلفة يبين تعريب متميزة داخل الخلايا حتى في غياب أي تسلسل استهداف محددة. 5 هذا passivه الاستهداف، فقط بسبب الخصائص الفيزيائية والكيميائية للdendrimer، يمكن استغلالها لتحقيق عضية محددة التصوير الحموضة.

التصوير Ratiometric يمكن تنفيذها باستخدام متحد البؤر المجهري. فلوريسئين ورودامين، مترافق تساهميا إلى السقالة شجيري، تم تصويرها بشكل منفصل وأنشئت بكسل حسب بكسل نسبة الخريطة. تم الإبلاغ عن عدة إجراءات للسيطرة على الخلايا ودرجة الحموضة في الخلايا الحية عن طريق ionophores. Ionophores هي عبارة عن جزيئات صغيرة مسعور قادرة على نقل أيونات عبر غشاء البلازما؛ ionophores لH + أيون، مثل nigericin، تتوفر، ويمكن استخدامها لمعايرة أجهزة الاستشعار القائم على dendrimer كشفت هذه القياسات 16 استجابة خطية لدرجة الحموضة على غرار ما لوحظ. في المختبر. على أساس درجة الحموضة المعايرة داخل الخلايا يمكن قياسها بدقة. أظهرت هذه القياسات أن أجهزة الاستشعار القائم على dendrimer يمكن أن يكون أداة قيمة في دراسة H + homeostأسيس في الخلايا الحية والعمليات المرضية التي تنطوي على درجة الحموضة الأعطال التنظيم.

أثبتنا مؤخرا أن أجهزة الاستشعار درجة الحموضة القائم على dendrimer يمكن أن تطبق أيضا في الجسم الحي، وأداء التصوير الحموضة في دماغ الفئران تخدير 17 نظرا لبيئة معقدة من الأنسجة الحية ذات جودة عالية في الجسم الحي الاستشعار يمثل تحديا تقنيا. نحن هنا تظهر وصف مفصل للإجراءات التجريبية لدرجة الحموضة في الجسم الحي التصوير مع التركيز في القضايا المصيرية التي ينبغي معالجتها لإجراء التصوير الحموضة دقيقة في الدماغ. واستخدمت اثنين من الفوتون المجهري لسببين رئيسيين: ط) استخدام ضوء الأشعة تحت الحمراء يسمح للتغلب على النقص في اختراق الأنسجة من معيار متحد البؤر المجهري؛ ب) على نطاق واسع امتصاص اثنين من الفوتون من فلوريسئين ورودامين تسمح الإثارة في نفس الوقت تجنب المضاعفات المتصلة باستخدام اثنين من موجات الإثارة ل. كانت قياسات درجة الحموضة في مخ الفأرنفذت بنجاح؛ أجهزة الاستشعار تستجيب بسهولة لنقص الأكسجة لحث على تغيير درجة الحموضة في الفضاء خارج الخلية في الدماغ. تثبت هذه القياسات أن المؤشرات القائمة على dendrimer يمكن استخدامها بنجاح لتسليط الضوء على التغيير الفسيولوجية والمرضية من درجة الحموضة في الجسم الحي في نموذج حيواني.

Protocol

1. تجميع للمجسات

  1. في المقطع التالي نقدم الداخلي للاقتران من مؤشرات الرقم الهيدروجيني إلى dendrimers PAMAM. البروتوكول نفسه يمكن تطبيقه مع الحد الأدنى من التعديل لdendrimers أمين الحاملة البديلة. 5،17،13،14 dendrimers والأصباغ المتاحة تجاريا يمكن استخدامها دون مزيد من التنقيات.
  2. حل dendrimer في DMSO اللامائية (50 ميكرومتر تركيز النهائي). إعداد الحلول الأسهم 10MM من فلوريسئين-NHS وميثيل-رودامين-NHS (TMR) في DMSO اللامائية.
  3. إضافة إلى حل dendrimer المبلغ المطلوب من فلوريسئين وTMR. فإن نسبة المولي في الخليط تعكس كمية من الأصباغ تحميلها على dendrimer. عادة 1 مل من G4 PAMAM حل dendrimer في أنبوب microcentrifuge يتفاعل مع 8 مكافئ (40 ميكرولتر) من فلوريسئين و 8 مكافئ (40 ميكرولتر) من TMR. تحريك الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة.
  4. تمييع 01:10 بالماء منزوع الأيونات وتحميل رد فعلالخليط في كيس غسيل الكلى (MWCO = 10 كيلو دالتون). Dialyze لمدة 24 ساعة ضد الماء منزوع الأيونات استبدال كثير من الأحيان الماء في الخزان.
  5. نقل الحل إلى قارورة وتجميد الجافة لمدة 24 ساعة. وينبغي الحصول على مسحوق الأرجواني. وزن الحصول الصلبة وتذوب في الماء milliQ في تركيز النهائي من 10 ميكرومتر. قسامة الحل وتخزينها في -20 درجة مئوية.

2. في المختبر درجة الحموضة القياسات

  1. لفي المختبر المعايرة إعداد 500nM حل dendrimer في برنامج تلفزيوني (2 ملي الفوسفات) في كفيت الكوارتز. فمن المستحسن استخدام تمييع جدا PBS العازلة (2 ملم) لتجنب التغيرات المفاجئة لدرجة الحموضة خلال المعايرة.
  2. قياس أطياف انبعاث فلوريسئين (غير شامل 488 نانومتر) وTMR (غير شامل 550 نانومتر) وتحسين إعدادات البصري للمقياس التألق لتحقيق نسبة جيدة إشارة إلى الضوضاء.
  3. إجراء المعايرة درجة الحموضة بإضافة كميات صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 N وحمض الهيدروكلوريك 0.1 N. بعد كل إضافة يهز كفيتلخلط، انتظر 1 دقيقة للموازنة وقياس درجة الحموضة عن طريق مسرى مكروي درجة الحموضة. يجب تسجيل الانبعاثات أطياف فلوريسئين وTMR لكل خطوة من دون أي تغيير في إعدادات البصرية.
  4. رسم كثافة مضان مقابل الرقم الهيدروجيني للمعايرة. ينبغي أن تتأثر إشارة رودامين بواسطة الرقم الهيدروجيني (<10٪). وينبغي أن يكون إشارة فلوريسئين منحنى السيني ويجب أن تكون مزودة نموذج واحد ملزم مع PK = 6.4.

3. الثقافة الخلية و Electroporation

  1. زراعة خلايا هيلا في Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 100 U / مل البنسلين، و 100 ملغ / مل الستربتوميسين (إينفيتروجن). تبقي زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
  2. لdendrimer التثقيب الكهربائي، وعندما يتم متموجة الخلايا، وإزالة وسائل الإعلام وغسل الخلايا باستخدام DPBS (Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة). إزالة DPBS وإضافة التربسين EDTA-. تحييد تريبالخطيئة من خلال إضافة مصل ولكن ليس المضادات الحيوية. أجهزة الطرد المركزي في 900-1،200 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة وسائل الإعلام وشطف الكريات باستخدام DPBS.
  3. عد الخلايا ويستغرق 4 * 10 6 خلايا. أجهزة الطرد المركزي في 1،200-1،500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. resuspend الكرية الخلية في 200 ميكرولتر من العازلة microporation (توفرها الشركة المصنعة microporator) ونقل الخلايا إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
  5. إضافة محلول مائي dendrimer إلى خلايا معلق. كمية dendrimer المطلوبة لكل عينة يعتمد على نوع PAMAM (عادة 250 نانومتر لالموجبة و2 ميكرومتر لdendrimers محايدة).
  6. إضافة العازلة التثقيب الكهربائي (توفرها الشركة المصنعة microporator) في أنبوب microporation. ماصة الخلايا وdendrimers مخاليط مع التثقيب الكهربائي غيض من 100 ميكرولتر حجم الحجم. إدراج ماصة microporator في محطة ماصة. تعيين حالة النبض لmicroporation: نبض الجهد = 1،005 V؛ دور المرأة في التنمية النبضال = 35 مللي ثانية؛ نبض عدد = 2.
  7. بعد نقل خلايا النبض إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 1،200 دورة في الدقيقة لإزالة الزائدة من dendrimer في المتوسط. لوحة 10 ميكرولتر من الخلايا electroporated على أطباق الزجاج السفلي 35 مم (WillCo طبق GWSt-3522) مع المتوسطة الطازجة ث / س المضادات الحيوية.

4. استشعار درجة الحموضة في الخلايا الحية هيلا

  1. الخلايا صورة مع متحد البؤر المجهر 12 ساعة بعد التثقيب الكهربائي.
  2. مجموعة التصفية القياسية لفلوريسئين ورودامين يمكن استخدامها. إذا المرشحات الانضباطي هي مجموعة متاحة قناة الأخضر 500-550 نانومتر وقناة الحمراء من 580 نانومتر إلى 650 نانومتر. الإثارة في 488nm هو الأمثل لفلوريسئين بينما يمكن تصويرها رودامين إما مع 543nm أو خط ليزر 561.
  3. التركيز على عينة وضبط الليزر للكشف عن السلطة وكسب لتعظيم نسبة الإشارة إلى الضوضاء. إذا كان التثقيب الكهربائي خلايا الناجح يجب أن يكون الفلورسنت الزاهية في كل القنوات. التوطين يعتمد على حجم والمسؤول عن dendrimer المستخدمة. في كثير من الأحيان بعض توطين الليزوزومية (حويصلات محيط بالنواة الصغيرة) موجود بسبب الإلتقام أو التقسيم. يجب التخلص من إذا توطين الليزوزومية هو السائد، أي أكثر من مضان المترجمة داخل الحويصلات ويلاحظ الفقراء إشارة في العصارة الخلوية، وهذا يدل على سمية والقياس. الحصول على القناتين بشكل متتالي، إذا لزم الأمر اكتساب العديد من الصور ومتوسط ​​صور لتحسين جودة الصورة.
  4. للمعايرة المشبك خلية الرقم الهيدروجيني باستخدام مخازن مع ionophores في درجة الحموضة المختلفة والحصول على ما لا يقل عن 20 خلايا لكل درجة الحموضة كما هو موضح أعلاه. للحصول على وصف مفصل للإجراءات وتكوين مخازن يرجى الرجوع إلى بتساري وزملاء العمل. 16 نقترح لقياس لا يقل عن 5 نقاط من درجة الحموضة = 5.5 إلى 7.5 درجة الحموضة =. الرقم الهيدروجيني أقل من 6 سامة للخلايا ولكن السكوت لفترة قصيرة من الوقت، فإننا نقترح على اكتساب الصور في أسرع وقت ممكن. إذا الخلاياتظهر علامات موت الخلايا المبرمج، وتجاهل الخلايا وإعادة تشغيل.
  5. استخدام يماغيج أو برامج مماثلة لتحليل البيانات. استيراد الصور من قناة خضراء وحمراء، طرح الخلفية وخلق بكسل بكسل نسبة التصوير مع أداة "صورة آلة حاسبة".
  6. رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) تحديد الخلية المطلوبة وقياس نسبة الأخضر إلى الأحمر داخل الخلايا. تحليل جميع الصور المكتسبة ومن ثم رسم مقابل نسبة الرقم الهيدروجيني. في نطاق 5،5-7،5 يجب أن يكون الاتجاه الخطي. سوف تناسب خطية من النقاط التي تم الحصول عليها إعطاء منحنى المعايرة التي سيتم استخدامها لتحويل نسبة الأخضر إلى الأحمر لدرجة الحموضة.
  7. كما مزيد من السيطرة اكتساب العديد من الخلايا غير المعالجة (أي ionophores) ومحاولة لحساب الرقم الهيدروجيني مع منحنى المعايرة التي تم الحصول عليها. وينبغي الحصول على قيمة بين 7.2 و 7.4.

5. في فيفو إعداد نموذج

  1. وقد أجريت تجارب على C57BL/6J (ذكور وإناث) بين د بعد الولادةالمنعم يوسف 28 و 70. تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من يوريسين (أي إيثيل كاربامات) (20٪ ث / ت في المياه المالحة الفسيولوجية، 20 ملغ / كلغ يوريثان). تم التضحية الحيوانات بعد التجربة مع جرعة زائدة من يوريتان تليها حقنة داخل القلب من نفس المخدر.
  2. إجراء الحقن العضلي من الفوسفات ديكساميثازون صوديوم (2 ملغم / كغم من وزن الجسم) للحد من الاجهاد استجابة القشرية وذمة دماغية خلال الجراحة.
  3. يحلق رأس الحيوان وتطبيق هلام يدوكائين 2.5٪ إلى فروة الرأس.
  4. استخدام مقص لقطع رفرف من الجلد تغطي الجمجمة من نصفي الكرة الأرضية
  5. غسل العظام يتعرض مع المياه المالحة وبلطف إزالة السمحاق باستخدام ملقط. هذا وسوف توفر قاعدة أفضل للالغراء والاسمنت الأسنان على الالتزام بها.
  6. تطبيق الرأس الصلب آخر حسب الطلب مع غرفة التصوير المركزية والغراء مع فورية الغراء في طائرة موازية تقريبا مع الجمجمة على المنطقة القشرية من طnterest وإصلاحه في مكان مع الاسمنت الأسنان البيضاء (Paladur).
  7. إصلاح رأس الماوس من أجل إجراء حج القحف من 2-3 مم في القطر حفر على المنطقة من الفائدة.
  8. في محاولة للحد من القشرة التدفئة أثناء الجراحة، والدموع الجافية، أو النزيف.
  9. الحفاظ على القشرة superfused مع ACSF العقيمة (126 ملي مول كلوريد الصوديوم، 3 ملي بوكل، 1.2 ملي KH 2 PO 4، 1.3 ملي MgSO 4، 26 مم 3 NaHCO، 2.4 مم CaCl 2، 15 ملي الجلوكوز، 1.2 ملي HEPES في المقطر H 2 O ، ودرجة الحموضة = 7.4).

6. التصوير الحموضة في الدماغ ماوس

  1. أثناء التنفس الحيوان المساعدات التجربة توفير O 2 الهواء المخصب. غير المخصب الأكسجين تصل إلى 80٪. يتم ضبط O 2 الضغط الجزئي وتدفق كثير من الأحيان للحصول على مساعدات التنفس السليم. الحفاظ على الجسم درجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية مع ردود فعل تسيطر التدفئة بطانية.
  2. إصلاح الحيوان من خلال هذا المنصب الصلب في إطار الهدف من على بعد الصورة اثنينالإعداد ن التصوير.
  3. من أجل حقن أجهزة الاستشعار في القشرة الدماغية تحميل ماصة الزجاج الذي يحتوي على القطب أجكل (قطر غيض 4 ملم) مع الحل dendrimer (1 ميكرومتر). سوف القطب تسمح لتسجيل امكانات الحقل خارج الخلية.
  4. مع الإعداد حقن مكروي إدراج ماصة في القشرة في حوالي 150 عمق ميكرومتر. حقن لمدة 1-2 دقيقة عند ضغط 0.5 رطل.
  5. تحسين الإعداد للتصوير الضوئي. ينبغي تعديل قوة الليزر لتقليل photobleaching من وphotodamage. عادة قوة الليزر المستخدمة هي حوالي 20 ميغاواط وكان يحتفظ PMT مكاسب ثابتة عند 667 V منذ المعايرة السابقة أظهرت أن هذا الجهد يعطي أفضل نسبة S / N.
  6. للتصوير تثير الاستشعار في 820 نانومتر، وكشف في وقت واحد فلوريسئين ورودامين مضان من خلال مرشحات FITC وTRITC القياسية.
  7. للمرة القياسات حل اكتساب الوقت الفاصل بين سلسلة في 2 هرتز.
  8. لتصحيح الخلفية الحصول على الإطار الظلام مع عالج بالليزرإغلاق مصراع r لقياس الضوضاء الحرارية متوسط ​​الناشئة في هذه الفرق ورمى أضاف عادة من قبل الالكترونيات.
  9. لتحليل البيانات اتبع نفس الإجراء ورد في القسم 4.

النتائج

ويبين الشكل 1 تمثيل تخطيطي للاقتران من الأصباغ الاستشعار لالسقالات شجيري مختلفة. يمكن الحصول على مؤشرات الناتج في الخطوة الاصطناعية سهلة واحد من المنتجات المتاحة تجاريا. وكان رد فعل dendrimers تحمل أمين مع الأصباغ NHS تفعيلها في DMSO وتنقيته بواسطة غسيل الكلى. وقد ت...

Discussion

الخطوات الحاسمة لنجاح التصوير الحموضة مع أجهزة الاستشعار القائم على dendrimer هي: ط) اختيار السقالة شجيري الصحيح وعدد من المؤشرات مترافق إليها وب) الاستفادة المثلى من بروتوكول تسليم الاستشعار في الخلايا أو في الجسم الحي.

الإجرا?...

Disclosures

الافتراضي: المؤلف ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

واعترف مناقشات مفيدة مع Isja دي Feijter ومات بيكر بامتنان.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PAMAM G4Sigma-Aldrich412449
Carboxyfluorescein NHS esterLife technologiesC-1311
TMR NHS esterLife technologiesC-1171
DMSOSigma-AldrichD8418
Dyalsis bagsSpectrum Labs132117
WillCo DishesWillCo WellsGWSt-3512
UrethaneSigma-AldrichU2500

References

  1. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
  2. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of biological chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  3. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
  4. Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution. Pflügers Archiv: European journal of physiology. 420 (5-6), 595-602 (1992).
  5. Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18158-18167 (2010).
  6. Lee, C. C., MacKay, J. A., Fréchet, J. M. J., Szoka, F. C. Designing dendrimers for biological applications. Nature Biotechnology. 23 (12), 1517-1526 (2005).
  7. Lee, C. C., Gillies, E. R., et al. A single dose of doxorubicin-functionalized bow-tie dendrimer cures mice bearing C-26 colon carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16649-16654 (2006).
  8. Caminade, A. -. M., Turrin, C. -. O., Majoral, J. -. P. Dendrimers and DNA: combinations of two special topologies for nanomaterials and biology. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 14 (25), 7422-7432 (2008).
  9. Rakow, N. A., Suslick, K. S. A colorimetric sensor array for odour visualization. Nature. 406 (6797), 710-713 (2000).
  10. Armada, M. P. G., Losada, J., Zamora, M., Alonso, B., Cuadrado, I., Casado, C. M. Electrocatalytical properties of polymethylferrocenyl dendrimers and their applications in biosensing. Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands). 69 (1), 65-73 (2006).
  11. Finikova, O., Galkin, A., Rozhkov, V., Cordero, M., Hägerhäll, C., Vinogradov, S. Porphyrin and tetrabenzoporphyrin dendrimers: tunable membrane-impermeable fluorescent pH nanosensors. Journal of the American Chemical Society. 125 (16), 4882-4893 (2003).
  12. Albertazzi, L., Serresi, M., Albanese, A., Beltram, F. Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells. Molecular pharmaceutics. 7 (3), 680-688 (2010).
  13. Albertazzi, L., Mickler, F. M., et al. Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores. Biomacromolecules. , (2012).
  14. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells. Bioconjugate chemistry. , (2012).
  15. Sakadzić, S., Roussakis, E., et al. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nature. 7 (9), 755-759 (2010).
  16. Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies. Biophysical journal. 90 (9), 3300-3314 (2006).
  17. Albertazzi, L., Brondi, M., et al. Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications. PloS one. 6 (12), e28450 (2011).
  18. Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents. Angewandte Chemie International Edition. 50 (15), 3425-3429 (2011).
  19. Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nature methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  20. Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation. Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96 (2012).
  21. Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a. Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).
  22. . . Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

79 dendrimer

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved