JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، علينا أن نظهر كيف الخلوي صورة يمكن استخدامها لتقدير حجم الفطريات المسببة للأمراض بالاشتراك مع الخلايا المضيفة في الثقافة. هذه التقنية يمكن استخدامها كبديل للتعداد كفو.

Abstract

دراسات الآليات المرضية الخلوية من الخمائر المسببة للأمراض مثل المبيضات البيض، المغمدة المغمدة، والمستخفية المورمة عادة توظف إصابة الجنود الثدييات أو الخلايا المضيفة (أي الضامة) تليها الكمي باستخدام الخميرة مستعمرة تشكيل وحدة التحليل أو التدفق الخلوي. في حين كانت مستعمرة تشكيل وحدة التعداد الأسلوب الأكثر استخداما في هذا المجال، هذا الأسلوب له عيوب وأوجه القصور، بما في ذلك النمو البطيء لبعض الأنواع الفطرية على وسائل الاعلام الصلبة والكفاءة الطلاء منخفض و / أو المتغير، والذي هو مصدر قلق خاص عند مقارنة النمو من السلالات البرية من نوع ومتحولة. يمكن التدفق الخلوي توفير معلومات كمية سريع بشأن جدوى الخميرة، ومع ذلك، اعتماد تدفق cytometric الكشف عن الخمائر المسببة للأمراض كان محدودا لعدد من الأسباب العملية بما في ذلك تكاليف عالية واعتبارات السلامة الأحيائية. هنا، علينا أن نبرهن على الصورة القائمة علىمنهجية cytometric باستخدام الرؤية Cellometer (Nexcelom العلوم البيولوجية، LLC) لتقدير حجم الخمائر المسببة للأمراض قابلة للحياة في الثقافة المشتركة مع الضامة. تركز دراساتنا على الكشف عن مسببات الأمراض الفطرية اثنين الإنسان: المغمدة النوسجة والمبيضات البيض H.. المغمدة يستعمر الضامة السنخية بواسطة تكرار داخل يبلوع بلعم، وهنا، ونحن كميا تقييم نمو H. الخمائر المغمدة في RAW 264.7 الضامة باستخدام أكريدين البرتقال / propidium تلطيخ يوديد في تركيبة مع صورة الخلوي. لدينا وسيلة بأمانة اتجاهات النمو يلخص مقاسا مستعمرة التقليدية تشكيل وحدة التعداد، ولكن مع زيادة كبيرة حساسية. بالإضافة إلى ذلك، نقوم بتقييم مباشرة إصابة الضامة العيش مع سلالة GFP، معربا عن من C. البيض. يقدم منهجية لدينا وسيلة سريعة ودقيقة، واقتصادية للكشف والقياس الكمي لمسببات الأمراض الفطرية الهامة الإنسان في جمعية الطرافةالخلايا المضيفة ح.

Introduction

وغالبا ما تتطلب دراسات من الفطريات المسببة للأمراض بالاشتراك مع مضيفيهم و / أو الخلايا المضيفة الكمي للخلايا قابلة للحياة الفطرية على دوام أو في ظل ظروف العدوى المختلفة. تعداد الوحدات تشكيل مستعمرة (كفو) هو الأسلوب المعيار الذي تم قياسه عدد الخلايا الفطرية قابلة للحياة، ولكن هذا الأسلوب له عيوب عدة والقيود. الأولى، العديد من الأنواع الفطرية هي بطيئة النمو. نمو المستعمرات مرئية على وسائل الاعلام الصلبة يمكن أن تأخذ 1-2 أسابيع، وتباطؤ ملحوظ وتيرة البحوث. الثانية، والتلاعب في عينات خلال كفو الطلاء هو عملية شاقة، حيث يجب أن يتم مطلي عدة التخفيفات لضمان وجود عدد معدود من المستعمرات. الثالث، وعدد من كفو أقل عادة من عدد من الكائنات قابلة للحياة مطلي لأن كفاءة الطلاء هو أقل بكثير من 100٪. على سبيل المثال، يمكن أن الكفاءة تصفيح لديمبرافيك الفطرية المغمدة النوسجة الممرض يكون مرتفعا كما 90٪، ولكن بشكل روتيني منخفضة مثل30٪ و هي أقل من (10٪) للذات صلة الفطرية dimorph نظيرة الكروانية البرازيلية 1، 2. كفاءة الطلاء عن المبيضات البيض هي أيضا عرضة للتقلب 3. وأخيرا، يمثل تحليل كفو للخلايا الحية فقط وتقسيم بنشاط قادرة على إنشاء النمو على وسائل الاعلام الصلبة، في حين، سيكون من المفيد في كثير من الحالات لتحديد وجود وتركيز من الخلايا الميتة غير نشط و / أو عملية الأيض.

سابقا، وقد وصفت وسائل تدفق cytometric لتقدير من العديد من الأنواع الفطرية المسببة 4-6. ولكن نظرا لاحتواء قضايا السلامة الأحيائية المشاركة مع استخدام مستوى السلامة الأحيائية 2 (BSL2) أو مسببات الأمراض على مستوى BSL3 على أجهزة قياس التدفق الخلوي المشتركة، واعتماد هذا الأسلوب كانت محدودة. مثل التدفق الخلوي، الخلوي الصورة هي طريقة حساسة وسريعة الكمي الخلية. ومع ذلك، الخلوي صورة لا يمكن أن يؤديها في جزء صغير من التكلفة مع نتائج مماثلة 7 -11. هنا، نحن تصف الأساليب لأداء الخلوي صورة من الفطريات المسببة للأمراض بالاشتراك مع الخلايا المضيفة. علينا أن نظهر طرقنا باستخدام اثنين من مسببات الأمراض الفطرية الإنسان: المغمدة النوسجة والمبيضات البيض H.. المغمدة هو الممرض الفطرية ديمبرافيك التي تسبب أمراض الجهاز التنفسي؛ في البشر، وأنها تنمو الخميرة في مهدها كما ويعيد داخل الضامة السنخية المبيضات البيض هي الأنواع المتعايشة الإنسان التي تسبب أحيانا المبيضات. وتبين لنا أن صورة الخلوي يسمح الكمي السريع لهذه الخمائر، جنبا إلى جنب مع القدرة على التصور.

Protocol

1. إصابة الضامة مع H. المغمدة، C. البيض

  1. 16 ساعة قبل العدوى، الضامة البذور في الكثافة المطلوبة في 24 لوحات جيدة. في هذا البروتوكول، تم استخدام كثافة من 3.0 × 10 5 خلايا / جيد.
  2. إضافة الخلايا الفطرية في النمو مراحل سجل في تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية). يمكن هذا البروتوكول استيعاب مجموعة من وزارة الداخلية (0،2-5،0). لإصابة RAW264.7 الضامة مع H. المغمدة، استخدمنا وزارة الداخلية من 0.2.
  3. بعد 1.5 ساعة للسماح للالبلعمة، وغسل الضامة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة الفطريات خارج الخلية.
  4. احتضان لمدة العدد المطلوب من ساعة قبل تحليل العينة. في وزارة الداخلية منخفضة (0.2 في تجربتنا)، تبقى خلايا البلاعم المصابة قابلة للحياة لعدة أيام، ويمكن تحليل عينات تقريبا كل 12-24 ساعة.

2. تحلل بلعم

  1. لتحرير الفطريات من خلايا البلاعم، وإزالة وسائل الإعلام، ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 0.5 مل ماء معقم. في ظل هذه الظروف، وسوف الضامة ليز وستبقى الخلايا الفطرية سليمة.
  2. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. نقل المحللة إلى أنبوب العقيمة، والحفاظ على الجليد.
  4. نقل 20 ميكرولتر المحللة إلى أنبوب منفصل، ثم إضافة 20 ميكرولتر AO / حل PI. الانتقال مباشرة إلى الخطوة 5: "إعداد نموذج لصورة التحليل Cytometric"

3. كفو تصفيح

  1. أداء تخفيف عشرة أضعاف من لست] (من الخطوة 2.3) في وسائل الإعلام.
  2. لوحة 100 ميكرولتر من كل تخفيف من نسختين، على لوحات HMM-الاغاروز. احتضان لوحات في غرفة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2 لمدة 7-8 أيام.
  3. العد يدويا المستعمرات على لوحات عرض ما لا يقل عن 100 وبحد أقصى 1،000 المستعمرات متميزة.

4. التصور للفطريات داخل الضامة لايف

  1. لجمع الضامة الحية، وغسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 0.5 مل PBS واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  2. لإزالة الضامة من الآبار وزراعة الأنسجة، ماصة بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات. نقل السائل إلى أنبوب العقيمة، والحفاظ على الجليد.
  3. نقل 20 ميكرولتر عينة إلى أنبوب منفصل، ثم إضافة 20 ميكرولتر AO / حل PI. الانتقال مباشرة إلى الخطوة 5: "إعداد نموذج لصورة التحليل Cytometric".

5. إعداد العينات للتحليل صورة Cytometric

  1. ماصة العينة المستهدفة بدقة ومن ثم نقل 20 ميكرولتر من العينة إلى الخلية القابل للتصرف غرفة الفرز.
  2. تسمح للخلايا ليستقر في غرفة لمدة 30 ثانية.
  3. إدراج عد غرفة في عداد الكريات الصورة.

6. إعداد الصك Cellometer

  1. إدراج بصريات الإسفار الوحدات: VB-535-402 وVB-660-502 في النظام والتأكد من انهم محبوسون في المكان.
    1. VB-535-402 (الإثارة في 475 نانومتر، والانبعاثات عند 535 نانومتر) يستخدم لأكريدين البرتقال وكشف GFP.
    2. VB-660-502 (excitatiعلى 540 نانومتر في، يتم استخدام الانبعاثات في 660 نانومتر) لكشف يوديد propidium.
  2. بدوره على عداد الكريات الصورة وفتح البرنامج المرافق.

7. إعداد البرامج Cellometer

  1. حدد مسبقا "نوع الفحص" و "نوع من الخلايا" في القائمة المنسدلة الفحص.
    1. للبقاء، هو الأمثل لفحص للأكريدين البرتقال وكشف يوديد propidium.
    2. للكشف عن عدوى المبيضات البيض، هو الأمثل لفحص للكشف عن GFP.
  2. حدد "خيارات" في أعلى وانقر على "خذ صورة الخلفية"، والسماح للعملية لإكمال.
  3. انقر على "معاينة الصورة مشرق الميدان".

8. صورة اكتساب الداخلي

  1. إدراج حجرة العينة المعدة في عداد الكريات الصورة.
  2. استخدام مقبض التركيز وضبط التركيز.
  3. مرة واحدة في التركيز، انقر على "الكونت"، والسماح للعملية الحصول على الصور لإكمال.
  4. ريموهاء الدائرة العد القابل للتصرف والتصرف بشكل مناسب.

9. صورة تحليل البيانات

  1. تركيز وقياس الجدوى
    1. بمجرد الانتهاء من عملية فرز، يتم عرض التركيز وقابلية الخلايا المستهدفة في صفحة نتائج.
    2. انقر على "تصدير" لتصدير البيانات إلى FCS اكسبرس 4 لتحليل السكان خلية من خلايا GFP في التجربة عدوى المبيضات البيض.
  2. FCS تحليل سريع من المبيضات البيض الخلايا المصابة
    1. استيراد ". NXDAT" الملف إلى FCS اكسبرس 4 ومؤامرة النتائج في الرسم البياني مضان.
    2. تطبيق بوابة سكان الخلية إلى الرسم البياني لتحديد نسب السكان من المبيضات البيض الخلايا المصابة.

النتائج

استخدمنا صورة الرؤية Cellometer عداد الكريات لمراقبة نمو H. المغمدة في خلايا البلاعم. أصيب الخلايا 264.7 RAW مع H. خلايا الخميرة المغمدة وعند نقاط زمنية مختلفة، وتعرض العينات لAO / PI تلطيخ تليها تحليل cytometric المستندة إلى الصورة. في موازاة ذلك، تم تحليل عينات من قبل ?...

Discussion

صورة الخلوي يسمح للمستخدم التقاط صور ذات جودة عالية و، وذلك باستخدام البرمجيات المتخصصة، نفذ الكمي السريع للخلايا. واحد تحديا محتملا لاعتماد الخلوي صورة في مجال الجراثيم المرضية هو أن الميكروبات لفرزها موجودة في يسكنها خليط من الخلايا، بما في ذلك الخلايا المضيفة ا?...

Disclosures

الكتاب ليو لى يينغ شان وبارادي بنيامين هم موظفون من Nexcelom العلوم البيولوجية LLC.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
DMEMLife Technologies11965-084
Fetal Bovine SerumLife Technologies16000044
AO/PI SolutionNexcelom BioscienceCSK-0102
Disposable Counting ChamberNexcelom BioscienceCHT4-SD100
EQUIPMENT
Cellometer VisionNexcelom Bioscience
Cellometer Vision SoftwareNexcelom Bioscience

References

  1. Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
  2. Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
  3. Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
  4. Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
  5. Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
  6. Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
  7. Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
  8. Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
  9. Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
  10. Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
  11. Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
  12. Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
  13. Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
  14. Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
  15. Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

76 propidium Cellometer

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved