Permeabilization من خلايا منضمون باستخدام غاز خامل جت

Summary

يصف هذا البروتوكول وسيلة لpermeabilization مؤقتة من الخلايا الملتصقة باستخدام طائرة غاز خامل. هذه التقنية تسهل نقل المادة الوراثية والجزيئات الحيوية في خلايا الثدييات ملتصقة بها استخدام القوات الميكانيكية لتعطيل غشاء البلازما.

Abstract

توجد تقنيات مختلفة ترنسفكأيشن الخلية وهذه يمكن تقسيمها إلى ثلاث فئات عريضة: الفيروسية والكيميائية والميكانيكية. يصف هذا البروتوكول وسيلة ميكانيكية لpermeabilize زمنيا الخلايا الملتصقة باستخدام طائرة غاز خامل التي يمكن أن تسهل نقل الجزيئات عادة غير قابلة للاختراق في الخلايا. ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب يعمل عن طريق نقل قوى القص على غشاء البلازما من الخلايا الملتصقة، مما أدى إلى تشكيل مؤقت لmicropores. مرة واحدة يتم إنشاء هذه المسام، والخلايا هي قابلة للاختراق ثم إلى المادة الوراثية والجزيئات الحيوية الأخرى. القوات الميكانيكية المعنية لا تتعرض لخطر الخلايا الضارة بشكل دائم أو فصل من الركيزة الخاصة بهم. هناك، بالتالي، على نطاق ضيق من ديناميات غاز خامل حيث الأسلوب هو فعالة. وقد ثبت طائرة غاز خامل كفاءة في permeabilizing مختلف خطوط الخلايا الملتصقة بما في ذلك هيلا، HEK293 والخلايا البطانية الأبهر البطني الإنسان. هذا البروتوكول هو مناسبة لعermeabilization من الخلايا الملتصقة على حد سواء في المختبر، وكما أثبتنا، في الجسم الحي، والتي تبين أنها يمكن أن تستخدم لأغراض البحث ويحتمل أن تكون في التطبيقات السريرية في المستقبل. كما أن لديها ميزة permeabilizing الخلايا بطريقة تقييدية مكانيا، والتي يمكن أن تكون أداة بحث قيمة.

Introduction

مع تطور الطب الحيوي وفهم الميكانيكا الخلية، وأصبح تسليم الجزيئات الحيوية في الخلايا الحيوية لكثير من مجالات البحث والعلاجات الطبية. وقد تم تطوير تقنيات مختلفة لإدخال جزيئات الأجنبية من خلال غشاء البلازما والخلايا في العصارة الخلوية. هذه يمكن أن تصنف عموما إما: تقنيات الفيروسية أو الكيميائية أو الميكانيكية. يمكن أن تقنيات الفيروسية بالنقل المواد الجينية مثل الحمض النووي الريبي والحمض النووي باستخدام ناقلات فيروسية ^1. تقنيات الفيروسية تميل إلى أن تكون الكفاءة عالية في خطوط الخلايا معينة، ولكن لديهم القدرة على التفاعلات المناعية والتهابات ^2. وتشمل أساليب ترنسفكأيشن الكيميائية المشترك مع هطول فوسفات الكالسيوم ^{3، 4} والسموم الناتجة عن بعض بكتيريا lipofection ^5. وقد أثبتت هذه التقنيات لتكون فعالة، ومع ذلك، تنشأ مشاكل معينة مثل السمية الخلوية وغير النوعية. علاوة على ذلك، تقنيات مثل الفوسفاط الكالسيومتم العثور على البريد هطول أن يكون الكفاءة ترنسفكأيشن تصل إلى 70٪ ولكن فقط في خطوط الخلايا معينة، ونادرا ما في الخلايا الأولية ^6. هذا هو من المذكرة كما يتم وضع زيادة الجهود البحثية في الخلايا الأولية، وخاصة في حالة تصميم العلاجات المختلفة للاستخدام السريري ودراسة سير الحمض النووي.

تعطل الزمني للغشاء الخلية من خلال المحفزات الميكانيكية هو بديل لإدخال جزيئات الأجنبية إلى الخلايا. وتشمل التقنيات: Microinjection من جزيئات ^7، التثقيب الكهربائي باستخدام مجال كهربائي لتعطيل الغشاء ^8،9، باستخدام الموجات فوق الصوتية sonoporation لتعطيل غشاء الخلية ^10-12، الجسيمات القصف كما يدل على ذلك "مدفع الجينات"، الذي يطلق النار على جزيئات ملزمة مع الجينات في الخلية ^13، ومؤخرا، وتطبيق إجهاد القص السوائل التي قد تظهر لpermeabilize زمنيا خلايا الثدييات ^14،15. على الرغم من ميكانيكيطرق آل تجنب بعض القضايا المذكورة آنفا، وعادة ما تصاحبها الكفاءة أقل والاجهزة المعقدة جدا والمتخصصة. وقد وضعت الشعلة توهج التفريغ الضغط الجوي (APGD تي) في ماكغيل مع الهدف الأولي من functionalizing الأسطح وفصل الخلايا الملتصقة في المختبر ^16. مصادفة، تم اكتشاف أن وصمة العيش / قتيلا تستخدم على نحو ما كان يجري اتخاذها في الخلايا من دون وكيل permeabilizing إضافتها. وعلاوة على ذلك، وهذا يبدو أنه لم يحدث إلا في مناطق محدودة من الآبار التي حدثت لمتابعة المباراة مع مسار الشعلة. واصلت التحقيق في قدرات permeabilization من APGD-t و في دراسات المراقبة، تبين أن الطائرة غاز خامل الناقل من البلازما دون الإثارة كانت أيضا قادرة على permeabilize الخلايا. هذا يتناقض مع الفرضية الأولية أن رد الفعل الأنواع التي أوجدتها البلازما النفاثة ضعف وظيفة الغشاء مؤقتا واقترح ببساطة المطاط ووكانت قوات كال كافية للتسبب permeabilization الخلية. من هنا، واصلت الدراسات في المختبر في محاولة لتحديد وتوصيف كفاءة permeabilization من طائرة غاز خامل وكذلك نظرة على قدرات ترنسفكأيشن في ^16.

من خلال هذه الدراسات، فقد وجد أن micropores القيام به في شكل الواقع في غشاء البلازما، وهذه المسام تميل إلى ختم غضون ما يقرب من 5 ثانية ^15. لقد أثبتنا فائدة هذه التقنية في المختبر والمجراة في غشاء مشيمائي من جنين الفرخ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تطوير برنامج ابفيف

1. وترد تحكم تدفق الشامل (MKS M100B قداس فلو المراقب المالي) إلى خط غاز الهيليوم لضمان معدل تدفق الغاز دقيقة. يتم التحكم من قبل هذه الوحدة مدخلا الجهد، والتي تتراوح بين 0 و 5 V. حلقة التحكم في البرنامج ابفيف يحدد الجهد المطلوب في أي وقت من الأوقات. التواصل بين الكمبيوتر ويتم تنفيذ وحدة تحكم تدفق الشامل من قبل الجهاز الحصول على البيانات (USB-NI 6009)، ويوفر 12 فولت التيار الكهربائي السلطة للتحكم تدفق الشامل.
2. وتستخدم شريحتين المواقع الخطية للسيطرة على الحركة من لوحة 6 جيدا، واحدة لكل اتجاه. ويتكون كل مجلس من MA15 سلسلة Velmex الجمعية Unislide إلى جانب وجود محرك خطوة، ويتم التحكم في كل من المجالس التي كتبها واحد Velmex VXM يخطو المراقب للسيارات. وحدة تحكم يسمح للركض من كل دليل أو محرك يقبل سلسلة من الأوامر المسلسل الخارجية، ومزيج من التي تسمح لحركة معينة عatterns. عدة أنماط يمكن برمجتها في برنامج ابفيف، مما يتطلب من المستخدم سوى تقديم سرعة الشعلة المطلوب فضلا عن أبعاد المسار.

2. إعداد معدات

1. فتح كل من اسطوانة الهليوم ومنظم.
2. تشغيل وحدة تحكم المحرك.
3. فتح البرنامج ابفيف والتحقق من جميع الشروط.
4. تأكد يتركز المنصة. للتحقق، والنظر في كل مرحلة الحركية والتحقق من أن كل حرف ليس بالقرب إما نهاية المرحلة. إما لديها مركز البرامج العربات أو ضبط باستخدام عناصر التحكم الركض على الجزء الأمامي من وحدة تحكم المحرك يدويا.
5. إذا كانت هذه هي الجولة الأولى من النهار، فمن المستحسن لتشغيل البرنامج مرة واحدة دون الخلايا، لضمان يعمل الإعداد بشكل صحيح.

3. إعداد جيت الغاز شعرية فوهة الارتفاع

1. إزالة الشعرية من صاحب الصفر والاتصال الهاتفي الارتفاع.
2. وضع 6 جيدا لوحة سن المنصة.
3. استبدال وتخفيض الشعرية طائرة الغاز إلى قاع البئر حتى يضرب انزلاق الغطاء. تأمين الشعرية في حامل.
4. باستخدام الاتصال الهاتفي الارتفاع، رفع شعري 3 مم. بمناسبة هذا الارتفاع على قاعدة الشعرية.
5. رفع الشعرية إلى ارتفاع آمنة ثم قم بإزالة لوحة 6 جيدا.

4. خلية بروتوكول Permeabilization

1. ثقافة خط الخلية تمسكا نقطة التقاء على غطاء زجاجي ينزلق في لوحة 6 جيدا باستخدام تقنيات زراعة القياسية. لخلايا هيلا، البذور 6 لوحات جيدة مع 2 × 10 ⁵ خلايا لكل بئر واحتضان لمدة 48 ساعة قبل العلاج.
2. إعداد حجم مناسب من محلول يحتوي على ناقلات المطلوب. لhrGFPII-1، تركيز 50 نانوغرام / ميكرولتر في برنامج تلفزيوني 1X توفر إشارة قوية الفلورسنت في خلايا هيلا 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. للدراسات ديكستران، فمن المستحسن 80 ميكروغرام / مل من 10 كيلو دالتون ديكستران الفلورية الخضراء. من الآن فصاعدا، سوف يحال هذا الحل لو "حل ناقلات".
3. إزالة الخلايا سائل الإعلام والثقافة من بئر وشطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
4. ماصة ميكرولتر من الحل 1،370 ناقلات أعدت في الخطوة 4.2 في أيضا. هذا ينبغي أن يؤدي إلى عمق السائل من حوالي 1.3 ملم.
5. وضع البئر تحتوي على حل ناقلات في وسط المنصة. خفض فوهة طائرة الغاز إلى مستوى ملحوظ من قبل مما يدل على ارتفاع فوهة 3 مم فوق الشريحة.
6. ضبط معدل تدفق الهليوم في برنامج ابفيف وتحديد نمط الحركة المطلوبة لاستخدامها. حدد "تشغيل" عندما تصبح جاهزة لبدء بروتوكول permeabilization. وسوف تكون هناك فترة تأخر الأولية خلالها تحكم تدفق الشامل تستعد لتوفير معدل تدفق اللازمة. مرة واحدة تم الوصول إلى معدل التدفق المناسبة، سيقوم البرنامج ابفيف تفعيل المحركات السائر لتحريك جيدا في نمط permeabilization المطلوب. بمجرد أن توقفت منصة، انتظر حوالي 30 ثانية وإزالة الحل النواقل.ملاحظة: يحدث permeabilization الأمثل قرب الضغط الديناميكي من 100 إلى 200 باسكال عند مخرج الفوهة، وهذا يتوقف على قطر الشعيرات الدموية.
7. يغسل جيدا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
8. ملء بشكل جيد مع وسائل الإعلام ثقافة جديدة.
9. كرر الخطوات من 4،3-4،6 عن العدد المرغوب فيه من التجارب. ملاحظة: تأكد من تضمين عينات السيطرة التي تتكون من الآبار التي يجري شغلها مع الحل ناقلات الغاز دون طائرة يتم تشغيلها عليها. ترك الحل في آبار المراقبة لحوالي 1 دقيقة ثم الشروع في خطوات 4.5 و 4.6.
10. إذا تشغيل تجربة ترنسفكأيشن hrGFP، والعودة لوحة 6 جيدا إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة للسماح للمواد transfected أن كتب من قبل الخلايا. إذا تشغيل التجربة permeabilization ديكستران، والعودة لوحة 6 جيدا إلى الحاضنة لمدة 15 دقيقة.

5. خلية التصوير

1. إذا رغبت في ذلك، وعلى الفور قبل التصوير، ومباين مع وصمة عار العيش / قتيلا المناسبة لتقييم موت الخلايا.
2. الخلايا صورة مع appropالمجهر riate للتحقيق فعالية ترنسفكأيشن / permeabilization.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويرد Permeabilization من خلايا هيلا مع 10 كيلو دالتون ديكستران الفلورية الخضراء باستخدام طائرة غاز الهيليوم مع 0.86 مم القطر الداخلي الشعرية في الشكل 1. تم counterstained الخلايا مباشرة بعد permeabilization مع 2 ميكرولتر / مل EthD-1 الحل (لايف / الميت الجدوى / السمسة كيت) لتصور موت الخلية. ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

خاملة permeabilization طائرة الغاز هو تقنية مفيدة لترنسفكأيشن الخلية ملتصقة. لأنها توفر القدرة على نقل الجزيئات الحيوية في الخلايا مع استخدام القوات الميكانيكية، مما يلغي الحاجة إلى المواد الكيميائية الضارة المحتملة أو ناقلات فيروسية. تقنية يحتمل أن تعطي الباحثين والأطبا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vitality hrGFPII-1	Agilent Technologies Canada	240143-57	Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells
Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable	Life Technologies Inc.	D22910	dextran for permeabilization experiments
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Life Technologies Inc.	L3224	for counterstaining of mammalian cells
Prolong Gold Antifade Reagent	Invitrogen	P36930	for mounting slides when imaging
Ultra High Purity Helium	Praxair Canada Inc.	HE 5.0UH-T
Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml	Thermo Scientific	SH30022.01	for HeLa cells
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	26140079	For DMEM media
Penicillin-Streptomycin, liquid	Invitrogen	15140-122	For DMEM media
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x			Produced in lab
			Table 1. List of required reagents
6-Well Clear TC-Treated Microplates	Corning	3506
#1 22 x 22 Coverslips	Fisher	12-542B
Glass Capillaries	World Precision Instruments		WPI Sizing Information
ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100
Mass-Flo Controller	MKS	M100B01314CS1BV	Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply
USB-6009 DAQ Device	National Instruments	779026-01
UniSlide Assembly with stepping motor and controller	Velmex		Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller
			Table 2. List of required equipment