نماذج وأساليب لتقييم نقل المخدرات نظم التسليم عبر الحواجز الخلوية

Summary

تتطلب العديد من التطبيقات العلاجية النقل الآمن والفعال للناقلات المخدرات وحمولتها عبر الحواجز الخلوية في الجسم. توضح هذه المقالة على تكييف أساليب أنشئت لتقييم معدل وآلية نقل nanocarriers المخدرات (NCS) عبر الحواجز الخلوية، مثل الجهاز الهضمي (GI) ظهارة.

Abstract

ناقلات ميكرومتر الفرعية (nanocarriers؛ نكس) تعزيز فعالية الأدوية من خلال تحسين القابلية للذوبان والاستقرار، زمن الدوران، والاستهداف، والافراج عنهم. بالإضافة إلى ذلك، يجتاز الحواجز الخلوية في الجسم أمر حاسم لكلا التسليم عن طريق الفم من البلاغات الوطنية العلاجية إلى الدورة الدموية والنقل من الدم إلى الأنسجة، حيث هناك حاجة إلى التدخل. ويتحقق النقل NC عبر الحواجز الخلوية من (ط) الطريق paracellular، عبر تعطيل عابرة من التقاطعات التي التعشيق الخلايا المجاورة، أو (ب) الطريق العابر للخلايا، حيث يتم المنضوية المواد عن طريق الإلتقام، ونقلها عبر خلايا الجسم، ويفرز في المقابل سطح الخلية (transyctosis). تسليم عبر الحواجز الخلوية يمكن أن تيسره اقتران المداواة أو ناقليها مع استهداف وكلاء التي تربط خصيصا لعلامات سطح الخلية المعنية في مجال النقل. هنا، ونحن نقدم أساليب لقياس مدى وآلية النقل NC عبر حاجز خلية النموذج، مبادرة الخوذ البيضاءيتكون الفصل من أحادي الطبقة من الجهاز الهضمي (GI) الخلايا الظهارية نمت على غشاء مسامي تقع في إدراج transwell. ويؤكد تشكيل حاجز نفاذية عن طريق قياس المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (طير)، والنقل بطريق الظهارة من مادة السيطرة، والمناعية من منعطفات ضيقة. على سبيل المثال، تستخدم ~ 200 نانومتر البوليمر البلاغات الوطنية، التي تحمل بضائع والعلاجية والمغلفة مع الأجسام المضادة التي تستهدف محددا سطح الخلية. هو المسمى الأجسام المضادة أو البضائع العلاجية مع ¹²⁵ أنا النظائر المشعة للبحث عن المفقودين وتضاف نكس المسمى إلى مجلس الشيوخ خلال أحادي الطبقة خلية لفترات متفاوتة من الزمن. ويمكن الكشف عن البلاغات الوطنية المرتبطة الخلايا و / أو نقلها إلى غرفة الأساسي. قياس مجانية ¹²⁵ I يسمح الطرح الكسر المتدهورة. ويتم تقييم مسار paracellular عن طريق تحديد التغييرات المحتملة الناجمة عن النقل NC لمعلمات حاجز المذكورة أعلاه. ط النقل العابر للخلاياتقدر تحددها معالجة تأثير تحوير الإلتقام وtranscytosis مسارات.

Introduction

الحواجز الخلوية في فعل الجسم كبوابة بين البيئة الخارجية والداخلية المقصورات. هذا هو الحال بالنسبة للبطانة الظهارية التي تفصل بين السطح المعرض من الخارج من الجهاز الهضمي (GI) المسالك ومجرى الدم ^1-3. كما تمثل الحواجز الخلوية واجهة بين مجرى الدم وحمة والمكونات الخلوية من الأنسجة والأعضاء. هذا هو الحال بالنسبة للبطانة الداخلية البطانية في الأوعية الدموية، مثل حاجز الدم في الرئة، حاجز الدم في الدماغ، الخ. ¹ القدرة على اجتياز هذه الحواجز الخلوية في الجسم أمر حاسم للتسليم كفاءة العوامل العلاجية والتشخيصية إلى الدورة الدموية والأنسجة / الأجهزة التي تحتاج إلى التدخل.

لتحسين تقديم وكلاء علاجية أو تشخيصية، هذه المركبات يمكن تحميلها في nanocarriers ميكرومتر الفرعية (NCS). هذه المركبات لتقديم الأدوية يمكن أن تصاغ مع مجموعة متنوعة منكيمياء والهياكل لتحسين القابلية للذوبان في المخدرات، والحماية، والدوائية، وإطلاق سراح، والتمثيل الغذائي ^4،5. البلاغات الوطنية يمكن أيضا أن تكون بين functionalized مع تقارب أو استهداف الأنصاف (مثل الأجسام المضادة، الببتيدات السكريات، الأبتامرات، الخ) لتسهيل الانضمام إلى مناطق الجسم التي تتطلب العمل العلاجي ^2،6. يمكن استهداف البلاغات الوطنية لمحددات أعرب على سطح الحواجز الخلوية زيادة تسهيل النقل إلى و / أو عبر هذه بطانات ^2،6.

دور نقل المواد بشكل انتقائي بين بيئتين يتطلب بعض ميزات فريدة من نوعها بين طبقات الخلية. واحدة من هذه الميزة قطبية الخلية، حيث الغشاء القمي التي تواجه التجويف تجاويف يختلف من غشاء basolateral موجهة نحو الخلالي الأنسجة، وفيما يتعلق التشكل الغشاء وتكوين الدهون، والنقل، ومستقبلات ^2. يتضمن ميزة أخرى junctio بين الخلايانانوثانية التي تربط الخلايا المجاورة. تنظيم البروتينات التي تشكل منعطفات ضيقة، جزيئات الالتصاق صلي على وجه الخصوص (المربيات)، occludins، وclaudins، تعدل وظيفة حاجز للسماح بشكل انتقائي أو لا نقل المواد بين الخلايا، والمعروفة باسم النقل paracellular، مما يسمح بمرور المواد من التجويف ل مساحة basolateral ^3. يمكن الربط من العديد من العناصر الطبيعية والاصطناعية (الكريات البيض، والجزيئات، والجسيمات، ونظم لتقديم الأدوية) إلى الحواجز الخلوية في الجسم تحفز الخلايا افتتاح تقاطع، والتي قد تكون عابرة وغير مؤذية نسبيا أو أكثر لفترة طويلة، وبالتالي غير آمنة مع وصول المواد غير المرغوب فيها عبر حاجز ^2،5،7-9. بالتالي، هذا المسار يمكن تقييمها من خلال قياس المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (طير) والسلبي نشر paracellular من الجزيئات (وتسمى هنا تسرب paracellular)، حيث انخفضت مقاومة التيار الكهربائي أو زيادة تسرب paracellular من المعهد الوطني للإحصاءمجمع غ في الفضاء basolateral تشير افتتاح تقاطعات الخلية، على التوالي ^5،10،11. لتكمل هذه الأساليب، أي من البروتينات مفرق ضيق المذكورة أعلاه يمكن أن تكون ملطخة لتقييم سلامتها، حيث يجب أن يظهر تلطيخ تتركز على الحدود خلية خلية في جميع أنحاء محيط الخلية ^5،10،12.

بدلا من ذلك، نظم لتقديم الأدوية التي تستهدف المحددات سطح خلية معينة، مثل تلك المرتبطة حفر المغلفة بالكلاذرين أو invaginations الغشاء على شكل قارورة دعا caveolae، قد يؤدي امتصاص حويصلي في الخلايا عن طريق الإلتقام، وتوفير وسيلة لتوصيل الدواء إلى الخلايا مقصورات ^{5، 13.} بالإضافة إلى ذلك، قد تؤدي إلى الاتجار الإلتقام من الحويصلات عبر خلايا الجسم لاطلاق سراح في الجانب basolateral، وهي ظاهرة تعرف باسم transyctosis، أو النقل العابر للخلايا ^14. وبالتالي، معرفة حركية وآلية الإلتقام يمكن أن تستخدم لاستغلال الخلايا والثانية تسليم المخدرات العابر للخلايا، والذي يقدم طريقة آمنة نسبيا والتي تسيطر التسليم مقابل الطريق paracellular. (الإلتقام مثل حالة جزيء التصاق الخلية (CAM) بوساطة) آلية الإلتقام يمكن تقييم مع جهري من الممرات الكلاسيكية (بالكلاذرين وبوساطة caveolin الإلتقام، وmacropinocytosis) أو المسارات غير الكلاسيكية ^5،13،15 .

في حين غالبا ما درس الاتجار داخل الخلايا في الآبار القياسية أو coverslips، وعدم وجود حجرة basolateral يمنع الاستقطاب الخلية والقدرة على دراسة النقل عبر طبقات الخلية. للتغلب على هذه العقبة، والنقل عبر الطبقات الوحيدة الخلية تمت دراسة طويلة باستخدام transwell إدراج ^{10،11،16،17،} والتي تتكون من العلوي (القمي) غرفة، غشاء نفاذية مسامية حيث تعلق الخلايا وتشكيل أحادي الطبقة ضيقة، وأقل (basolateral) غرفة (الشكل 1). في هذا التكوين، يمكن قياس النقل فيقمي، لbasolateral الاتجاه من خلال إدارة العلاج في الغرفة العليا، وبعد النقل من خلال أحادي الطبقة الخلية وغشاء مسامي الكامنة، وجمع أخيرا المتوسطة في مجلس النواب لتقدير حجم المواد المنقولة. ويمكن أيضا نقل في الاتجاه basolateral-لقمية تقاس الإدارة الأولية إلى انخفاض الغرفة وجمع لاحقة من مجلس الشيوخ ^{5،10،12،16.} توجد تقنيات مختلفة للتحقق من تشكيل حاجز نفاذية على transwells، بما في ذلك طير والمقايسات النقل paracellular، كما هو موضح أعلاه. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إزالة عامل التصفية منفذة على الخلايا التي يتم تربيتها لتحليل التصوير (مثل مضان، مبائر، المجهر الإلكتروني)، وكذلك المصادقة على نموذج أحادي الطبقة المحمولة، فضلا عن آلية النقل. اختيار نوع الغشاء، والذي يتوفر في أحجام مختلفة المسام، والمواد، والمناطق السطحية، ويعتمد على مختلف الواقعالتمرير مثل حجم المواد أو الأشياء المراد نقلها، نوع من الخلايا، وطريقة التصوير ^16،18-20. Transwell إدراج أيضا تسهيل التحكم ودقيقة الكمي النقل بالمقارنة مع أنظمة الثدييات المعقدة، كما هي معروفة أحجام الغرف ومساحة سطح الخلية الثوابت. في حين يتم التخلص من العديد من العوامل التي تدخل في الجسم الحي في التسليم، بما في ذلك وجود مخاط الأمعاء، إجهاد القص، والإنزيمات الهضمية، الخلايا المناعية وغيرها، هذا على نطاق صغير في النموذج المختبر يوفر معلومات أولية مفيدة بشأن النقل.

كمثال لتوضيح تكييف هذه الأساليب لدراسة النقل NC عبر الحواجز الخلوية ^{10،11،16،17،} ونحن هنا وصف الحالة التي كان على غرار القدرة على الانتقال NC عبر ظهارة GI عن طريق تقييم مرور تسليم المخدرات نموذج النظام من خلال أحادي الطبقة من الإنسان غدية القولون الظهارية (كاتشو-2) الخلايا. لهذا الغرض، جوكانت أذرع مثقف في إدراج transwell، على 0.8 ميكرومتر المسام البولي ايثيلين تيريفثاليت (PET) تصفية (6.4 مم)، وهو شفاف، ويمكن استخدامها للتصوير المجهري. يتم التحقق من صحة وضع حاجز نفاذية عن طريق قياس طير والنقل القمي، لbasolateral من مادة السيطرة، والزلال، والتصور مضان المجهري عنصر من منعطفات ضيقة، والبروتين occludin. ويستخدم نموذج من البوليمر استهدفت NC، ويتألف من 100 نانومتر، الجسيمات النانوية البوليسترين nonbiodegradable. والمغلفة البلاغات الوطنية عن طريق الامتزاز السطح مع الأجسام المضادة التي تستهدف وحدها أو مزيج من الأجسام المضادة التي تستهدف والبضائع العلاجية، حيث يمكن أن توصف إما المكون مع ¹²⁵ أنا النظائر المشعة للبحث عن المفقودين. في المثال المحدد، يعترف الضد التصاق بين الخلايا جزيء-1 (ICAM-1)، أعرب البروتين على سطح GI الظهارية (وغيرها) الخلايا، وهو ما ثبت لتسهيل داخل الخلايا والعابر للخلايا س النقل ناقلات المخدرات و وحمولتها ^21. البضائع هو ألفا غالاكتوزيداز (α غال)، انزيم العلاجية المستخدمة لعلاج مرض فابري، وهو اضطراب التخزين الليزوزومية الوراثية ^22.

الخدمة المدنية القومية المغلفة، من حوالي 200 نانومتر في الحجم، وتضاف إلى غرفة قمي أكثر من أحادي الطبقة الخلية وحضنت في 37 درجة مئوية لفترات متفاوتة من الزمن، وبعد ذلك يمكن أن يتم الكشف عن ¹²⁵ وأنا على البلاغات الوطنية المرتبطة أحادي الطبقة الخلية و / أو نقل إلى غرفة basolateral أدناه الخلايا. تقرير إضافية مجانية ¹²⁵ I يسمح الطرح الكسر المتدهورة وتقدير النقل NC المغلفة. ويتم تقييم آلية النقل من خلال دراسة مزيد من التغييرات في نفاذية حاجز المتعلقة الطريق paracellular، من خلال المعلمات المذكورة أعلاه، في حين يتم تحديد النقل العابر للخلايا من خلال دراسة التغيرات في مجال النقل عند تحوير مسارات الإلتقام وtranscytosis.

ontent "> هذه الأساليب توفير معلومات قيمة حول نماذج حاجز الخلوية، مدى ومعدل نقل نظام تسليم المخدرات، وآلية مثل النقل، والسماح تماما تقييم إمكانات لتسليم المخدرات عبر الحواجز الخلوية.

Protocol

1. زراعة أحادي الطبقة خلية في Transwell إدراجات

1. في العقيمة، ومستوى السلامة الأحيائية 2 خلية غطاء الثقافة، ضع 0.8 ملم المسام transwell PET إدراج في 24 لوحة جيدا (4 آبار في الشرط، لدلالة إحصائية) بالملقط. ويجب تعقيم جميع المواد التي تدخل هود مع الايثانول.

ملاحظة: حجم المسام من مرشح يجب أن يكون المحدد في اتفاق لحجم متوسط ​​من NC المستخدمة، للسماح النقل عبر الغشاء. أيضا، للحصول على نتائج ذات دلالة إحصائية، ويتطلب كل حالة تجريبية لا تقل عن أربعة يكرر (الآبار) في نفس التجربة، والحد الأدنى من 3 تجارب مستقلة.

2. إعداد خلية ثقافة المتوسط ​​تحتوي على DMEM المتوسطة تستكمل مع 4.5 غرام / لتر جلوكوز، 15٪ مصل بقري جنيني، و 1٪ القلم بكتيريا، والحرارة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
3. تمييع الإنسان غدية القولون الظهارية (كاتشو-2) الخلايا في خلية متوسطة ومكان200-400 ميكرولتر من الحل خلية في العلوية (القمي) غرفة إدراج transwell، في مناطق ذات كثافة من 1.5 × 10 ⁵ خلية / سم ^2. ملء الدنيا (basolateral) غرفة مع 700-900 ميكرولتر من المتوسطة الخلية.
4. خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO _2، و 95٪ الرطوبة ل16-21 يوما، لتحل محل المتوسطة في الغرفة العلوية والسفلية كل 3-4 أيام، وذلك باستخدام وحدات التخزين المشار إليها في الخطوة 1.3. استبدال المتوسطة في الترتيب التالي للحفاظ على الضغط فوق (بدلا من أدناه) أحادي الطبقة الخلية: نضح المتوسطة من مجلس النواب، نضح المتوسطة من مجلس الشيوخ، وملء الغرفة العليا مع متوسطة جديدة، وملء مع مجلس النواب متوسطة جديدة.

2. المصادقة على GI الظهارية نفاذية حاجز طريق بطريق الظهارة المقاومة الكهربائية (طير) والمناعية من منعطفات ضيقة

1. للتخزين على المدى القصير (أقل من 2 أسابيع)، يغرق أقطاب STX100 في المحاليل بالكهرباءنشوئها (0.1-0.15 M بوكل أو كلوريد الصوديوم). توصيل كابل كهربائي إلى منفذ كهربائي على EVOM متر فولت أوم بحيث يكون النظام تماس في الداخل ويتم الاحتفاظ القطب التماثل. للتخزين على المدى الطويل، وشطف مع DH ₂ O وتخزين في حالة جافة ومظلمة.
2. لتعقيم الأقطاب، تزج في الإيثانول لمدة 15 دقيقة والسماح للهواء الجاف لمدة 15 ثانية. بدلا من ذلك، الأقطاب يمكن تخزينها في غطاء فوق البنفسجية. شطف الأقطاب في محلول معقم بالكهرباء (العازلة الفوسفات المالحة، PBS) أو 0.1-0.15 M بوكل كلوريد الصوديوم أو الحل، قبل كل قياس المقاومة.
3. مع متر فولت أوم لتعيين الإعداد المقاومة، ضع عموديا الأقطاب في بئر يحتوي على إدراج transwell، مع القطب قصيرة في مجلس الشيوخ والقطب طويلة في مجلس النواب لمس قاع البئر. ما إن تستقر القراءة EVOM، وتسجيل قيمة المقاومة (أوم الواردة في؛ Ω) لكل بئر.
4. حساب المقاومة (resistanم تطبيع للمنطقة؛ Ω × سم ²⁾ من عينات عن طريق طرح المقاومة الخلفية (طير من إدراج transwell دون الخلايا) وضرب من قبل مساحة الغشاء. وغالبا ما ذكرت القيم المقاومة في الأدب. (انظر مناقشة)
5. تكرار القياسات كل 1-2 أيام حتى تقدر طير أدى إلى الحد الأقصى والهضبة، مشيرا إلى تشكيل حاجز النفاذية، والتي تأخذ عادة 2-3 أسابيع من لحظة platting الخلية. قد تتغير قيم هضبة طير والوقت اللازم لتحقيق سلامة الحاجز وفقا لعدد مرور الخلية.
6. للتحقق من وجود منعطفات ضيقة في الطبقات الوحيدة الخلية مع ارتفاع طير (تساوي أو تزيد على قيمة العتبة لتشكيل حاجز)، وإصلاح الخلايا عن طريق الحضانة مع البرد بارافورمالدهيد 2٪ لمدة 15 دقيقة. ثم، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 1 ميكروغرام / مل مكافحة occludin. غسل خلايا مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 7.5 ميكروغرام / مل والأجسام المضادة الثانوية صفت luorescently. استخدام الآبار مع انخفاض طير كعنصر تحكم السلبية لتشكيل حاجز.

ملاحظة: كبديل لمكافحة occludin، يمكن استخدام الأجسام المضادة للبروتينات تقاطع ضيق البديلة.

7. استئصال الغشاء بعناية التصفية الذي يتم إرفاق أحادي الطبقة الثابتة، وجبل على الشرائح للتصوير باستخدام epifluorescence أو المجهري متحد البؤر.

3. تقييم بطريق الظهارة نقل الناقلون المستهدفة

1. تسمية استهداف الأجسام المضادة (الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة ضد ICAM-1، ومكافحة ICAM، في هذا المثال) مع ¹²⁵ الأول، كما هو موضح سابقا ^7. استخدام برادفورد مقايسة لتقدير تركيز البروتين وعداد غاما لتحديد ¹²⁵ I المحتوى على الضد، ثم حساب نشاط محدد في التهم لكل دقيقة (CPM) / ملغ من الأجسام المضادة المسمى.

ملاحظة: للسيطرة على النوعية، إعادةالجفت الإجراء من قبل مفتش وسم الفأر، والتي سيتم استخدامها لإعداد البلاغات الوطنية المغلفة غير المستهدفة. لدراسة نقل البضائع العلاجية، كرر الإجراء وصفها البضائع، على سبيل المثال، ألفا غالاكتوزيداز (α غال) في هذا المثال. يمكن استخدام بدائل للعامل الاستهداف، ومراقبة غير محددة، أو البضائع العلاجية. ويمكن أيضا أن تستخدم أساليب بديلة لتسمية المركبات وتقدير تركيز نظرائهم المسمى.

2. الزوجان المسمى استهداف الأجسام المضادة (المضادة للICAM في مثالنا) على سطح البلاغات الوطنية. في هذا المثال، واحتضان nanobeads البوليسترين (قطر 100 نانومتر) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع ^I-125 المضادة للICAM للسماح امتصاص السطح، كما هو موضح ^7.

ملاحظة: للحصول على سيطرة غير محددة استخدام ^I-125 مفتش. لتتبع نقل البضائع، استخدام مزيج من الأجسام المضادة التي تستهدف ^و125 البضائع التي تحمل علامات الأول (α غال في مثالنا).

3. أجهزة الطرد المركزي في 13،000 x ج لمدة 3 دقائق وإزالة نظرائهم غير المغلفة في طاف بواسطة الطموح. resuspend الكرية تحتوي على البلاغات الوطنية المغلفة باستخدام 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني قبل pipetting، ويصوتن في انخفاض القوة لتعطيل المجاميع الجسيمات المحتملة (20-30 نبضات قصيرة).
4. لNC توصيف وقياس حجمها، والتشتت المتعدد، وζ المحتملة من الجسيمات المغلفة باستخدام تشتت الضوء الحيوي (اتباع الإرشادات بائع)، وتحديد عدد ¹²⁵ أنا المسمى استهداف جزيئات الأجسام المضادة (مثل مكافحة ICAM) على سطح الجسيمات باستخدام جاما المرتدة.

ملاحظة: يمكن تكرار هذه الأساليب لنظرائهم غير محددة والعلاجية. حجم الجسيمات المغلفة يتراوح حوالي 200 نانومتر.

5. إضافة ¹²⁵ نكس-I الأجسام المضادة، (على سبيل المثال ^I-125 المضادة للICAM البلاغات الوطنية؛ 56 نانوكوري / مل) إلى مجلس الشيوخ أعلاه متموجة كاتشو-2 الطبقات الوحيدة مع طير و# 8805؛ 350 Ω × ² سم (انظر مناقشة) على خلفية (16-21 يوما بعد البذر). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة واحدة أو المزيد من الوقت المطلوب فترات. قياس طير (القسم 2.3) قبل وبعد الحضانة لتقييم آثار البلاغات الوطنية على حاجز النفاذية.

ملاحظة: يمكن تكرار هذا الإجراء لنظرائهم غير محددة والعلاجية.

6. جمع المتوسطة من الغرف العلوية والسفلية وغسلها مرة واحدة مع 0.5 مل DMEM عند 37 درجة مئوية (الغرفة العليا) أو 1 مل درهم ₂ O (مجلس النواب). جمع يغسل لقياس مجموع محتوى النظائر المشعة باستخدام عداد غاما.
7. لقياس جزء الخلية، واستئصال تصفية نفاذية، على سبيل المثال باستخدام شفرة حلاقة لخفض حول حواف، واحتضان في أنبوب عداد غاما مع 1٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة (للافراج عن محتويات الخلية)، قبل قياس الخلية المرتبطة مجموع النشاط الإشعاعي.
8. لقياس ¹²⁵ أنا أعيدمستأجرة من البلاغات الوطنية أثناء النقل أو بسبب تدهور محتمل، مزيج أول 300 ميكرولتر من العينة (من الكسور العلوي، وانخفاض، أو خلية) مع 700 ميكرولتر من 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني و 200 ميكرولتر حمض الخليك ثلاثي الكلور (TCA). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وفي الوقت نفسه هذه المرة، وقياس النشاط الإشعاعي شامل لهذه العينة في عداد غاما.
9. عينات الطرد المركزي في TCA 3،000 x ج لمدة 5 دقائق لفصل البروتين سليمة (بيليه) من البروتين المتدهورة أو ¹²⁵ جزء الأول (طاف). قياس النشاط الإشعاعي من ¹²⁵ حرة أنا جزء وطرح هذه القيمة من مجموع النشاط الإشعاعي تقاس قبل الطرد المركزي. هذا وسوف توفر كمية البروتين المسمى الذي لا يتحلل.

4. آلية بطريق الظهارة نقل Nanocarriers المستهدفة

1. التسمية الألبومين مع ¹²⁵ I كما هو موضح في القسم 3.1 والتي أبلغت ^7.

ملاحظة: الزلال هو 66.5البروتين كيلو دالتون، وبالتالي، وهي مادة كبيرة نسبيا. على الرغم من أن السيطرة صالحة للنقل السلبي من الأجسام الكبيرة (على سبيل المثال 200 نانومتر المستخدمة هنا البلاغات الوطنية)، وينبغي أن تكون بديلا مع أصغر الجزيئات الخاملة التتبع عند دراسة نقل ناقلات المخدرات أصغر (انظر مناقشة).

2. لتقييم النقل paracellular باستخدام تسرب الزلال paracellular والثقافة كاتشو-2 الطبقات الوحيدة على transwell إدراج كما هو موضح أعلاه.
3. إلى متوسطة الغرفة العليا فوق الخلية أحادي الطبقة، إضافة إما ¹²⁵ I-الزلال وحده (السيطرة السلبية تظهر على المستوى القاعدي من التسرب)، أو ¹²⁵ البلاغات الوطنية التي تستهدف الأضداد I-الزلال وغير رديولبلد (كما هو موضح في القسم 3.5). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة الفاصل الزمني المحدد الوقت (ق)، والتي ينبغي أن تتطابق مع تلك درست عند اختبار النقل NC. قياس طير (القسم 2.3) قبل وأثناء وبعد الحضانة، ثم جمع كل الكسور لمجموع ¹²⁵ أنا وأنا حرة ¹²⁵ القياسات كما هو مبين. في القسم 3 ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك يصاحب ذلك من السيطرة ^I-125 الزلال وغير رديولبلد البلاغات الوطنية مفتش يمكن استخدامها كمجموعة تحكم.
4. كعنصر تحكم إيجابية لفتح تقاطعات بين الخلايا، إضافة وسائل الإعلام خلية تحتوي على 5 ملي H ₂ O ₂ إلى الغرف العلوية والسفلية من إدراج transwell، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم، وقياس طير (القسم 2.3) وإضافة ¹²⁵ I-الألبومين إلى الغرفة العليا للفترات الزمنية المحددة. قياس طير في نقاط مختلفة في جميع أنحاء الحضانة الوقت لتحديد قيمة الاضمحلال طير الناجمة عن H ₂ O ₂ الافتتاحية التي يسببها للتقاطعات الخلية.
5. في التجارب المتوازية، وتقييم النقل العابر للخلايا، وتسمى أيضا transcytosis، من ¹²⁵ نكس أنا المستهدفة التي يحتضنها متموجة كاتشو-2 مع الطبقات الوحيدة إما 50 ميكرومتر monodansylcadaverine (حركة التغيير الديمقراطي؛ المانع من بوساطة بالكلاذرين الإلتقام)، 1 ميكروغرام / مل فيليبين (المانع من caveolar الإلتقام بوساطة)، و 0.5 ميكرومتر فورتمانفي (المانع من فوسفتيدلينوستول 3 كيناز [PI3K]، والمشاركة في macropinocytosis)، أو 20 ميكرومتر [5 - (N-إيثيل-N-الآيزوبروبيل) الأميلوريد] (EIPA، المانع من macropinocytosis وبوساطة CAM الإلتقام ^15).

ملاحظة: ^I-125 مفتش البلاغات الوطنية ^و125 I-الزلال يمكن استخدام ضوابط السلبية لتأثير هذه المثبطات، وغيرها من الأساليب (مثل تقنيات سيرنا) قد توفر تثبيط أكثر انتقائية.

6. قياس طير (القسم 2.3) قبل وأثناء وبعد حضانة الخلايا مع مثبطات والمواد رديولبلد، كعنصر تحكم إضافية للتأثير مثبطات على نفاذية أحادي الطبقة.

النتائج

التحقق من صحة نموذج خلية لدينا لدراسة النقل بطريق الظهارة من البلاغات الوطنية المستهدفة، ويبين الشكل 2 أن كاتشو-2 الطبقات الوحيدة الخلية مطلي في مناطق ذات كثافة من 1.5 × 10 ⁵ خلية / سم ² وصلت التقاء ~ 12 يوم وحافظ سلامة أحادي الطبقة تصل إلى 18 يوم، يتبين م...

Discussion

استخدام الأساليب التي تمت مناقشتها أعلاه، يمكن تأسيس نموذج خلية لدراسة نقل البلاغات الوطنية المستهدفة عبر الحواجز الخلوية، مثل المثال المنصوص عليها كاتشو-2 الخلايا الظهارية، والتي هي ذات الصلة لتقييم النقل من التجويف GI في الدم في حالة نظم لتقديم الأدوية عن طريق الف...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell inserts	BD Falcon	353095
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Pen Strep	Gibco	15140
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells	ATCC	HTB-37TM
125Iodine	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Radioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190-235
Bovine Serum Albumin (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Paraformaldehyde (16%)	Fisher Scientific	15710
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)	Marlin 1987
α-Galactosidase, from green coffee beans	Sigma	G8507-25UN
FITC latex beads, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150
Triton X-100	Sigma	234729-500ML
Trichloroacetic acid (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Monodansylcadaverine (MDC)	Sigma	D4008
Filipin	Sigma	F9765
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)	Sigma	A3085
Wortmannin	Sigma	W1628
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard2
Volt-ohm meter	World Precision Instruments	EVOM2
TEER electrodes	World Precision Instruments	STX100	Electrodes available for different well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS)	Malvern	Nano-ZS90