JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الاستجابة المناعية الفطرية يحمي الكائنات الحية من الإصابة الممرض. وثمة عنصر حاسم من الاستجابة المناعية الفطرية، وانفجر الجهاز التنفسي بلعمية، وتولد أنواع الاكسجين التفاعلية التي تقتل الكائنات الدقيقة الغازية. نحن تصف مقايسة انفجر الجهاز التنفسي يحدد مقدار أنواع الاكسجين التفاعلية تنتج عندما يتم الناجم عن الاستجابة المناعية الفطرية كيميائيا.

Abstract

انفجار الجهاز التنفسي بلعمية هي جزء من الاستجابة المناعية الفطرية للإصابة الممرض وينطوي على إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS). ROS سامة وتعمل على قتل الكائنات الحية الدقيقة phagocytized. في الجسم الحي الكمي للالمشتقة بلعمية ROS يوفر معلومات بشأن قدرة الكائن الحي على شن استجابة مناعية فطرية قوية. نحن هنا وصف بروتوكول لتحديد ومقارنة ROS في الأجنة الزرد كله على الحث الكيميائي للانفجار الجهاز التنفسي بلعمية. هذا الأسلوب يجعل من استخدام مركب غير الفلورسنت التي يصبح الفلورسنت على الأكسدة التي كتبها ROS. و pipetted الأجنة الزرد الفردية في آبار من صفيحة ميكروسكوبية والمحتضنة في هذا الركيزة الفلورة مع أو من دون محفز الكيميائية للانفجار في الجهاز التنفسي. وكميا مضان في كل بئر في نقاط زمنية المطلوب باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية. تم تعديل قراءات مضان للقضاء على مضان الخلفية ثم شاركmpared باستخدام المفردة اختبار t. يسمح هذا الأسلوب للمقارنة من احتمال انفجار الجهاز التنفسي الأجنة الزرد في مراحل تنموية مختلفة وردا على التلاعب التجريبية مثل ضربة قاضية البروتين، من overexpression، أو العلاج مع وكلاء الدوائية. ويمكن أيضا أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لمراقبة استجابة انفجر الجهاز التنفسي في الكلى تشريح كله أو مستحضرات خلية من الكلى من الزرد الكبار وبعض أنواع الأسماك الأخرى. ونحن نعتقد أن البساطة النسبية والقدرة على التكيف من هذا البروتوكول سوف تكمل البروتوكولات القائمة وسوف تكون ذات فائدة للباحثين الذين يسعون إلى فهم أفضل للاستجابة المناعية الفطرية.

Introduction

ويتكون الجهاز المناعي من فرعين: المناعة الفطرية والتكيفية. المناعة الفطرية هي أكثر تطويريا القديمة من الحصانة على التكيف. ويعتقد حاليا أن يكون اللافقاريات المناعة الفطرية فقط، في حين تمتلك كل من الفقاريات فروع الفطرية والتكيفية. في حين الحصانة التكيف يمنح الحصانة محددة وطويلة الأمد لبعض مسببات الأمراض، والحصانة الفطرية هو استجابة فورية لغزو البكتيريا، والفيروسات، والفطريات. أحد الجوانب الحاسمة للاستجابة المناعية الفطرية ينطوي على الإفراج عن السيتوكينات و chemokines، مما يؤدي إلى التهاب وتجنيد البالعات (مثل الضامة، العدلات) لابتلاع وتدمير الغزاة الأجانب.

الاستجابات المناعية الفطرية الناجحة تنطوي على: (1) الاعتراف الكائنات الدقيقة الغازية، (2) تحريض من أجهزة الطرد المركزي الإشارات المناسبة (على سبيل المثال الإفراج عن السيتوكينات وكيموكينات)، (3) التنمية السليمة / أعداد كافية من الخلايا البلعمية، (4) هجرة البالعات إلى مواقع الإصابة، (5) الإحاطة من مسببات الأمراض، و (6) تدمير الكائنات الحية الدقيقة غارقة. وهناك نقص في أي واحدة من هذه الخطوات يمكن أن تؤدي إلى المضيف طغيان، والخضوع ل، والعدوى. A الاستجابة المناعية الفطرية قوية أمر حيوي لصحة الكائنات الحية لأنها خط الدفاع الأول ضد مسببات الأمراض في جميع النباتات والحيوانات. في الفقاريات، فإنه يقوي أيضا الاستجابة المناعية التكيفية 1. لذا، فمن الأهمية بمكان أن نكون قادرين على تقييم جميع جوانب الاستجابة المناعية الفطرية من أجل فهم أفضل وذلك لتحسين وظيفتها.

وتستخدم العديد من الكائنات الحية نموذج لدراسة المناعة الفطرية، بدءا من Arabadopsis إلى C. ايليجانس لذبابة الفاكهة إلى الفئران إلى الخلايا البشرية المستزرعة. ميزة لاستخدام الزرد (دانيو rerio) نظام نموذجي لدراسة المناعة الفطرية هي أن الزرد هو الفقاريات، مع كل الفطرية والتكيفية ايمفقد المناعة، إلا أن تطور المناعة الفطرية والتكيفية يتم فصل زمنيا. الزرد تعتمد فقط على الحصانة الفطرية للوقاية من العدوى حتى يصبح الحصانة التكيف تعمل بكامل طاقتها، والذي يحدث بعد حوالي 4-6 أسابيع الإخصاب 2. بالإضافة إلى أدوات للتلاعب الجيني، والوضوح البصري، وتنمية الخارجية السريعة، والحصانة الفطرية كوضع مبدأ الدفاع في الأجنة الزرد توفر نموذج مبسط للدراسة تعقيدات الاستجابة المناعية الفطرية في الجسم الحي.

وقد وضعت بروتوكولات متعددة لتقييم جوانب مختلفة من الاستجابة المناعية الفطرية في الأجنة الزرد. والتحقق من صحتها وميكروأرس RNAseq أن ملامح خلوى التي تسببها الاستجابة المناعية الفطرية الزرد هي مماثلة لتلك التي للبشر ولقد اقترح أيضا إشراك الجينات غير متوقعة في المناعة الفطرية 3،4. شفافية الجنين الزرد والفلورسنت، transgenجيم سلالات من مسببات الأمراض والزرد تسمح لرؤية ديناميكية التفاعلات المضيف الممرض في الجسم الحي في الوقت الحقيقي. جعلت الأجنة الزرد المعدلة وراثيا معربا عن GFP تحت سيطرة العدلات محددة الميلوبيروكسيداز المروج 5،6 أو بلعم محددة MPEG1 المروج 7 من الممكن تصور وقياس الهجرة بلعمية إلى مواقع الالتهابات الموضعية 8 وكذلك لتصور البلعمة وتدمير fluorescently المسمى مسببات الأمراض 8،9. الأجنة الزرد هي أيضا قابلة للتوليد فحوصات عالية الإنتاجية وشاشات الكيميائية. وفقا لذلك، وقد تم مؤخرا تطوير أساليب إنتاجية عالية من التحليل Transcriptome على بناء 10 وإصابة الهجرة بلعمية إلى مواقع الإصابة التي يسببها كيميائيا 11.

من التقنيات المذكورة أعلاه، فإن أيا كميا تقييم المرحلة النهائية من الدمار من قبل الممرض البالعات. هذه المرحلة النهائيةينطوي على انفجار الجهاز التنفسي (أي إنتاج ريوس والمركبات السامة الأخرى)، والذي قتل مسببات الأمراض اجتاحت. أوكسيديز NADPH الانزيم هو المصدر الرئيسي للROS في الخلايا البلعمية. تجميع مفارز من نتائج انزيم أوكسيديز NADPH في نقل الإلكترونات إلى الأكسجين، وتوليد الأنيونات الفائق. من خلال التفاعلات الإنزيمية لاحقة، ويمكن بعد ذلك تحويلها الفائق في بيروكسيد الهيدروجين وحمض تحت الكلور (الشكل 1A). هو انفجار الجهاز التنفسي من البالعات الذي يقتل مسببات الأمراض وبالتالي، فإن القياس الكمي لإمكانات الجهاز التنفسي انفجار الأجنة الزرد يدل على صحة المناعة الفطرية بشكل عام. وضعنا مقايسة على أساس مضان لقياس انفجر الجهاز التنفسي في مجموعات من الأجنة الزرد الفردية 12. يستخدم هذا الاختبار في غير الفلورسنت، وانخفاض شكل، صبغة خلايا قابلة للاختراق متاحة تجاريا. هذه الصبغة، 2 '، 7'-dichlorodihydrofluorescein ثنائي الأسيتات (H2DCFDA)، يتم تحويلها إلى الفلوريةمجمع المائة، 2 '، 7'-dichlorofluorescein (DCF)، بناء على الأكسدة. يمكن للROS المتنوعة الناتجة عن انفجار الجهاز التنفسي بلعمية أكسدة H2DCFDA وتوليد مضان 24. ظهور مضان يمكن استخدامها لقياس ومقارنة استجابة انفجر الجهاز التنفسي بين مجموعات من الزرد. ويستخدم البروتين كيناز C خلات ناهض phorbol ميريستات (سلطة النقد الفلسطينية) للحث على كيميائيا أوكسيديز NADPH لإنتاج ريوس وبالتالي زيادة قراءات مضان (الشكل 1B). هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة من نسخة معدلة ومحسنة من هذا الجنين الزرد الجهاز التنفسي انفجار الفحص. هذا الاختبار يمكن استخدامها للمقارنة بين انفجار الجهاز التنفسي بين مجموعات من الأجنة الزرد الفردية مع مرور الوقت و / أو استجابة لالتلاعب التجريبية (مثل morpholino بوساطة البروتين ضربة قاضية). استخدام هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع غيرها من فحوصات المناعة الفطرية الزرد، وتقديم صورة أكثر اكتمالا من المعقدة والحرجةالاستجابة المناعية الفطرية.

Protocol

1. رعاية الزرد والصيانة

  1. تربية: تفرخ قداس الزرد الكبار كما هو موضح سابقا 13. جمع الأجنة ولدت كما هو موضح سابقا 14.
  2. حقن مكروي (إذا رغبت): Microinject 1-4 مرحلة خلية الأجنة الزرد مع أليغنوكليوتيد] morpholino ضربة قاضية لمنتجات الجين أو مرنا إلى overexpress منتجات الجين كما هو موضح سابقا 15.
    1. الحفاظ على مجموعة كافية من الضوابط وهمية حقن (لا يقل عن 48 المعيشة، حقن وهمية الأسماك السيطرة و48 المعيشة، وهناك حاجة إلى التلاعب الأسماك تجريبيا لملء البئر صفيحة ميكروسكوبية 96).
  3. الحفاظ على الأجنة: نمو الأجنة في أطباق بتري العميق عند 28 درجة مئوية في الماء البيض (60 ميكروغرام / مل الفوري المحيط بحر الملح في الماء المقطر-تعقيمها) حتى المرحلة التنموية المنشودة (استجابة الجهاز التنفسي هو انفجار لا يمكن كشفها باستخدام هذا البروتوكول في الأجنة الزرد الذين تقل أعمارهم عن 2 يوما بعد الإخصاب 12). ملاحظة: لقد كان سbserved أن منع تصبغ في الأجنة الزرد إما عن طريق استخدام 1-2-فينيل ثيويوريا (PTU) أو الزرد متحولة golden/slc24a5 لا يغير كثيرا من تحريض من قبل سلطة النقد الفلسطينية مضان (بيانات غير منشورة، الأجنة اختبارها في 48، 72، و 96 HPF).
    1. إزالة الأجنة الميتة يوميا مع ماصة نقل البلاستيك.
    2. صب الماء بعناية البيض القديمة وتجديد بالماء بيضة جديدة يوميا.
  4. الأجنة Dechorionate: في يوم من التجربة والأجنة dechorionate (إن الأجنة لا تزال في chorions الخاصة بهم) كما هو موضح سابقا باستخدام اثنين من ملقط غرامة 14 (هذا الاندفاع فحص الجهاز التنفسي يمكن أيضا إجراء تشريح على الكلى من الزرد الكبار 12 و بروتوكولات مفصلة عن الكلى تشريح من الزرد الكبار وقد وصفت في وقت سابق 16،17).

2. إعداد الحل

  1. إعداد محلول المخزون من H2DCFDA: زن من 1 ملغ من H2DCFDA.
    1. ديssolve 1 ملغ من H2DCFDA في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لجعل 1 ملغ / مل محلول المخزون.
    2. جعل مأخوذة 22 ميكرولتر من هذا الحل الأسهم في 1.7 مل أنابيب microcentrifuge.
    3. التفاف مأخوذة من H2DCFDA حل الأسهم في رقائق الألومنيوم والاحتفاظ بها في الظلام كلما كان ذلك ممكنا لأن H2DCFDA هو الحساسة للضوء.
    4. مأخوذة متجر H2DCFDA في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  2. تنبيه - إعداد محلول المخزون من خلات phorbol ميريستات (سلطة النقد الفلسطينية): زن من 1 ملغ من سلطة النقد الفلسطينية باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (مثل القفازات، نظارات واقية وقناع).
    1. حل سلطة النقد الفلسطينية في 1 مل من DMSO لجعل 1 ملغ / مل محلول المخزون.
    2. جعل 11 ميكرولتر مأخوذة في 1.7 مل أنابيب microcentrifuge.
    3. مخزن aliquots من سلطة النقد الفلسطينية حل السهم عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  3. يعد حل عمل H2DCFDA: في يوم من التجربة، وجعل الحل تعمل H2DCFDA بإضافة جزء 1 محلول المخزون H2DCFDA إلى 1جزء DMSO (500 ميكروغرام / مل H2DCFDA تركيز النهائي). على سبيل المثال، إضافة 20 ميكرولتر من محلول المخزون H2DCFDA و 20 ميكرولتر DMSO إلى رقائق ملفوفة 1.7 مل أنبوب microcentrifuge.
  4. يعد حل عمل سلطة النقد الفلسطينية: في يوم من التجربة، وجعل الحل تعمل سلطة النقد الفلسطينية وذلك بإضافة جزء 1 محلول المخزون سلطة النقد الفلسطينية إلى 49 أجزاء المياه nuclease حرة (20 ميكروغرام / مل تركيز النهائي سلطة النقد الفلسطينية). على سبيل المثال، وتمييع 10 ميكرولتر حل سلطة النقد الفلسطينية الأسهم في 490 ميكرولتر المياه nuclease خالية في أنبوب 1.7 مل ميكروسنتريفوج.
  5. إعداد الحل الجرعات من H2DCFDA: في يوم من التجربة، وجعل الحل الجرعات H2DCFDA مع تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل H2DCFDA في الماء البيض. يمكن تعديل وحدات التخزين أعدت للحلول الجرعات كما تريد، ولكن تأكد من أن تركيزات النهائي من الكواشف والحفاظ عليها. على الكلى، بدلا من الماء البيض، واستخدام نفس حجم medium/F-12 تعديل Dulbecco والنسر (50٪ DMEM، و 50٪ F-12، من دون أحمر الفينول). لجعل 5 مل من H2DCFDAالجرعات الحل، استخدم 5 مل ماصة المصلية لنقل 5 مل من الماء البيض (أو DMEM/F-12) إلى 15 مل المخروطية أنبوب الطرد المركزي ملفوفة في احباط وصفت 'H'.
    1. إزالة 10 ميكرولتر من المياه البيض (أو DMEM/F-12) من 15 مل أنبوب مخروطي المسمى 'H' وتجاهل.
    2. إضافة 10 ميكرولتر من الحل H2DCFDA العمل في أنبوب 15 مل المخروطية المسمى 'H' ودوامة لخلط (هذا الحجم يكفي لمدة 48 الجنين أو عينات الكلى (نصف كامل 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا) وسوف توفر هذه الآبار قياسات مستوى من مضان الخلفية).
  6. إعداد الحل الجرعات من H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية: في يوم من التجربة، وجعل حل H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية الجرعات مع تركيزات النهائي من: H2DCFDA - 1 ميكروغرام / مل وسلطة النقد الفلسطينية - 400 نانوغرام / مل. لجعل 5 مل من H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية الحل الجرعات، استخدم 5 مل ماصة المصلية لنقل 5 مل من الماء البيض (أو DMEM/F-12) في أنبوب 15 مل المخروطية الجديد المسمى 'H + P'.
    1. إزالة 110 _6؛ لتر من الماء بيضة (أو DMEM/F-12) من 15 مل أنبوب مخروطي المسمى 'H + P' وتجاهل.
    2. إضافة 10 ميكرولتر من الحل H2DCFDA العمل، ثم إضافة 100 ميكرولتر من حل سلطة النقد الفلسطينية العاملة في أنبوب 15 مل المخروطية المسمى 'H + P' ودوامة لخلط (هذا الحجم يكفي لمدة 48 عينات أو النصف الآخر من كامل 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا ).
  7. الحفاظ على حلول الجرعات على الجليد.

3. صفيحة ميكروسكوبية قارئ البرمجة

  1. إعداد الصك: السلطة على القارئ صفيحة ميكروسكوبية.
    1. الاحماء مصدر الضوء.
    2. وضع برنامج لقراءة مضان: مثل الإثارة: 485 نانومتر؛ الانبعاثات: 528 نانومتر؛ بصريات الوظيفة: أعلى 510 نانومتر؛ الحساسية: 65، مع الهز الخطوة 5 ثانية قبل القراءة.

4. حسنا 96 صفيحة ميكروسكوبية إعداد (انظر الشكل 2)

  1. جمع اللوازم: الحصول الأطباق مع الأجنة dechorionated، أسود 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا، P200 pipettor ونصائح، دلو الثلج مع H2DCFDA وحلول الجرعات H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية، P200 pipettor الأقنية، واثنين من الخزانات المعقمة، رقائق الألومنيوم، ومقص.
  2. نقل الأجنة واحد في كل بئر من 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا: استخدام مقص لقطع طرف ماصة بحيث الأجنة أو الكلى مناسبا من خلال فتح.
    1. تعيين pipettor P200 إلى 100 ميكرولتر ونقل جنين واحد جنبا إلى جنب مع الماء البيض (أو DMEM/F-12) إلى أكبر عدد ممكن من آبار سوداء 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا كما تريد (ليس من الضروري تغيير غيض ماصة لكل مختلفة عينة الجنين داخل حالة تجريبية، ولكن قد يكون من الضروري تغيير نصائح بين الظروف التجريبية). تأكد من تجنب نقل chorions المتبقية، وهذه تميل إلى الانحراف البيانات التي تم جمعها. لنقل الكلى، وهو pipettor حجم أكبر (لتعيين 100 ميكرولتر) يمكن استخدامها، ويمكن خفض نصائح ماصة للحصول على حجم أكبر تتحمل، إذا لزم الأمر. قد يكون من الضروري لدمج الآبار دون الجنين أو الكلى العينات، ولكن معالحلول الجرعات للسيطرة على بعض التلاعب التجريبية.
  3. إضافة حلول الجرعات: صب H2DCFDA الحل الجرعات في العقيمة 25 مل الخزان.
    1. استخدام الأقنية P200 pipettor وثمانية نصائح لماصة في وقت واحد 100 ميكرولتر من الحل H2DCFDA الجرعات في عمود واحد على البئر صفيحة ميكروسكوبية 96 (500 نانوغرام / مل تركيز النهائي من H2DCFDA).
    2. كرر هذا (تغيير نصائح ليس من الضروري) للعديد من كأعمدة كما تريد (عادة ستة أعمدة أو 48 بئرا إذا يملأ كامل صفيحة ميكروسكوبية 96 أيضا). إضافة إلى هذا الحل نصف العينات الجنين السيطرة والنصف من العينات الجنين التلاعب بشكل تجريبي (ويرد مثالا جيدا 96 صفيحة ميكروسكوبية حتى في الشكل 2، وهذه الآبار (برتقالي اللون) ستوفر البيانات مضان الخلفية في عينات لا يسببها مع سلطة النقد الفلسطينية) .
    3. صب الحل الجرعات H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية في عالم جديد، خزان معقم 25 مل.
    4. استخدام الأقنية P200 pipettor وثمانية نصائح لsimultaneously ماصة 100 ميكرولتر من H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية الحل الجرعات في الأعمدة المتبقية (باللون الأحمر في الشكل 2) من البئر صفيحة ميكروسكوبية 96 (تغيير نصائح ليست ضرورية، تركيزات النهائي من H2DCFDA-500 نانوغرام / مل وPMA-200 نانوغرام / مل) .
  4. تغطية صفيحة ميكروسكوبية بورق الألمنيوم.
  5. يهز صفيحة ميكروسكوبية لحوالي 20 ثانية في 150 دورة في الدقيقة إلى التجانس الحلول في كل بئر.
  6. احتضان صفيحة ميكروسكوبية عند 28 درجة مئوية عندما لا يتم قراءتها.

5. مضان الكمي

  1. قراءة صفيحة ميكروسكوبية في الوقت = 0 ساعة بعد إضافة سلطة النقد الفلسطينية باستخدام المعلمات هو موضح في الخطوة 3.1.2.
    1. مواصلة اتخاذ قياسات كل بضع دقائق لالفاصل الزمني المطلوب أو احتضان رقائق ملفوفة صفيحة ميكروسكوبية عند 28 درجة مئوية حتى نقطة وقت لاحق ومن ثم اتخاذ قياس نقطة النهاية في الوقت المطلوب (على سبيل المثال 4 ساعة بعد إضافة سلطة النقد الفلسطينية).
  2. استخدام ر البلاستيكاملحول ماصة لاسترداد الأجنة من الآبار.
  3. الموت ببطء الأجنة وفقا لرعاية الحيوان واستخدام البروتوكول، على سبيل المثال الانغماس في تريكين MS222.
  4. التخلص من صفيحة ميكروسكوبية ومواد أخرى يمكن التخلص منها في حاوية النفايات biohazardous.

6. تحليل البيانات

  1. البت في نقطة الوقت الذي كنت ترغب في مقارنة القيم مضان (على سبيل المثال 4 ساعة بعد إضافة سلطة النقد الفلسطينية، الجدول 1).
  2. طرح قيمة مضان متوسط ​​المجموعة الضابطة التي يسببها الغير من القيم مضان السيطرة على المجموعة الفردية سلطة النقد الفلسطينية التي يسببها لل.
  3. كرر هذا لصالح المجموعة التجريبية مع وبدون سلطة النقد الفلسطينية.
  4. تخزين هذه القيم مضان تطبيع في عمودين، ومراقبة + مجموعة سلطة النقد الفلسطينية وسلطة النقد الفلسطينية + مجموعة التجريبية (الجدول 2).
  5. حساب المتوسطات الحسابية والانحرافات المعيارية للقيم مضان تطبيع للسيطرة + سلطة النقد الفلسطينية الحبوع والتجريبية مجموعة + سلطة النقد الفلسطينية.
  6. مقارنة القيم مضان تطبيع باستخدام المفردة اختبار t لتحديد الدلالة الإحصائية (الجدول 2).
  7. الرسم البياني وسائل السيطرة + مجموعة سلطة النقد الفلسطينية وسلطة النقد الفلسطينية + مجموعة تجريبية مع أشرطة الخطأ تعكس الانحرافات المعيارية المناسبة.
  8. تسجيل مستوى الدلالة على الرسم البياني وفي أسطورة الرقم (الشكل 2).

النتائج

هنا، ونحن نقدم بيانات مقارنة استجابة انفجر الجهاز التنفسي في الأجنة الزرد (من النوع البري، AB الخلفية) في 48 و 72 ساعة بعد الإخصاب (HPF). 48 HPF الأجنة بمثابة المجموعة الضابطة لدينا و72 HPF الأجنة كمجموعة تجريبية لدينا. وكان حجم العينة المستخدمة 24 الأجنة التي يسببها للامم المتح?...

Discussion

الوظيفة الأساسية للالبالعات هو الكشف، تبتلع، وتدمير مسببات الأمراض. قدرة البالعات لإنتاج انفجار الجهاز التنفسي أمر بالغ الأهمية الكافية لهذه المهمة. وبالتالي، القياس الكمي للاستجابة انفجار الجهاز التنفسي هو أسلوب واحد للسماح للمقارنة بين الصحة العامة والمناعة ال...

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أنوه أعضاء في الماضي والحاضر من المختبر كيم، مارك Nilan للرعاية الزرد والصيانة، والدكتور روبرت ويلر لإجراء مناقشات مفيدة وتبادل البيانات، والمعاهد الوطنية للصحة منح 3RO1GM087308-02S1 و1P20RR024475-01A2 ومين الزراعية والغابات تجربة محطة (عدد النشر 3303) للحصول على التمويل.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Instant Ocean Sea SaltInstant OceanSS15-10
H2DCFDASigma Aldrich35845-1G
PMAFisherBP6851
DMSOSigma AldrichD2438-5X10ML
Tricaine S MS222Western Chemical100 grams
DMEM/F-12, No Phenol Red Life Technologies11039-021
Deep Petri DishesVWR89107-632
Plastic Transfer PipettesFisher13-711-7M
#5 Dumont ForcepsElectron Microscopy Sciences72700-D
1.7 ml Micro Centrifuge TubesAxygen10011-724
15 ml Conical Centrifuge TubesVWR21008-918
5 ml Serological PipettesGreiner Bio One606180
Synergy 2 Multi-Mode Microplate ReaderBioTekContact BioTek
Black 96 Well MicroplateVWR82050-728
25 ml Sterile ReservoirsVistaLab3054-2003
P200 PipettorGilsonF123601
Multichannel PipettorVWR89079-948
Pipette TipsVWR89079-478

References

  1. Medzhitov, R., Janeway, C. A. Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
  2. Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
  3. Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
  4. Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
  5. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
  6. Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
  7. Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
  8. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
  9. Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
  10. Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription - Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
  11. d'Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
  12. Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
  13. Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
  14. Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  16. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
  17. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
  18. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  19. Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'Definitive' (and 'Primitive') Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
  20. Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
  21. Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
  22. Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
  23. Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
  24. . Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , .

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

79

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved