العزلة من الأنسجة الدهنية خلايا المناعة

Summary

الأنسجة الدهنية (AT) هو موقع على مكثفة تنشيط الخلايا المناعية والتفاعل. تقريبا جميع خلايا الجهاز المناعي موجودة في AT ويتم تغيير النسب من خلال السمنة. العزلة المناسبة، القياس الكمي، وتوصيف AT السكان الخلايا المناعية تعتبر بالغة الأهمية لفهم دورها في مرض immunometabolic.

Abstract

وقد أدى اكتشاف تسلل زيادة البلاعم في الأنسجة الدهنية (AT) من القوارض والبشر يعانون من السمنة المفرطة إلى تكثيف الاهتمام مساهمة الخلايا المناعية لمقاومة الانسولين وجهازية. العزلة والكمي لمختلف السكان الخلايا المناعية في العجاف والسمنة AT الآن تقنية تستخدم عادة في المختبرات immunometabolism، ويجب توخي الحذر الشديد حتى الآن سواء في انسجة الخلايا الوعائية والعزلة في تحليل التدفق الخلوي بحيث البيانات التي تم الحصول عليها هو موثوق بها والتأويل . في هذا الفيديو نحن لشرح كيفية اللحم المفروم، هضم، وعزل الخلايا المناعية التخصيب انسجة جزء الأوعية الدموية. وفي وقت لاحق، وتبين لنا كيفية الضامة تسمية الأجسام المضادة والخلايا الليمفاوية T وكيفية البوابة بشكل صحيح عليها في تجارب التدفق الخلوي. يتم توفير تدفق ممثل المؤامرات الخلوي من الدهون التي تغذيها الهزيل وارتفاع الدهون في الفئران السمينة التي تغذيها منخفضة. وثمة عنصر حاسم من هذا التحليل هو استخدام الأجسام المضادة التي تفعللا يتألق في القنوات حيث في الضامة هي autofluorescent بشكل طبيعي، فضلا عن استخدام ضوابط التعويض المناسب.

Introduction

تاريخيا، كان ينظر إلى الأنسجة الدهنية (AT) كجهاز تخزين خاملة من الدهون، والذي يوسع والعقود ردا على توازن الطاقة. ونحن نفهم الآن أن AT يمثل جهازا الغدد الصماء التي تفرز ديناميكية بنشاط عدد من الهرمونات التي تؤثر تأثيرا مباشرا سلوك التغذية والنظامية توازن الجلوكوز. وبالإضافة إلى ذلك، على مدى العقد الماضي كان هناك تقدير متزايد لسكان العديد من الخلايا المناعية المقيمين في AT جزء الأوعية الدموية اللحمية (صندوق التبرعات الخاص)، فضلا عن مساهمتها في AT التوازن.

القدرة على فصل AT خلية شحمية وصندوق التبرعات الخاص باستخدام هضم كولاجيناز تليها الطرد المركزي المغاير وقد وصفت لأول مرة في عام 1964 رودبيل ^1. غالبا ما يتم استخدام كولاجيناز الثاني للفصل خلية شحمية وصندوق التبرعات الخاص بسبب الصيانة من مستقبلات الانسولين خلية شحمية ^1. في وقت مبكر، وتجزيء الأنزيمية من AT كان يعمل في المقام الأول لدراسة الشحمcyte الأيض وعزل preadipocytes. وفي الآونة الأخيرة، وهذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع توافر نطاق واسع من أجهزة قياس التدفق الخلوي وعدد متزايد من المتاحة تجاريا الأجسام المضادة fluorophore مترافق، يسرت توصيف AT الخلايا المناعية.

على الرغم من وجود الخلايا المناعية في التهاب AT وقد وصفت سابقا ^2، وأوراق المنوية بواسطة يسبيرج وآخرون. وشو وآخرون. نشرت في عام 2003 كانت أول لتوثيق تراكم AT الضامة (الصراف الآلي) في السمنة، والتي تفرز السيتوكينات الالتهابية وترتبط مع المقاومة AT-محددة والنظامية الأنسولين ^3،4. خدم هذه الملاحظات كأساس لحقل جديد من التحقيقات التي صيغت مؤخرا، "immunometabolism،" ⁵ و تم متابعتها من قبل دراسات تورط مختلف السكان الخلايا المناعية، بما في ذلك الخلايا الجذعية ^{6، 7} الخلايا البدينة، الخلايا T ^{8 -}10، خلايا B ^11، خلايا NKT ^{12، 13} الحمضات، والعدلات ^14،15 في تطوير البدانة ترتبط مقاومة الأنسولين.

الهدف من هذه المقالة هو أن تقدم وصفا مفصلا لتقنية هضم كولاجيناز تستخدم لعزل خلايا AT صندوق التبرعات الخاص لتوصيف وأجهزة الصراف الآلي وAT خلايا T عن طريق التدفق الخلوي. وقد تم تحسين هذا البروتوكول للماوس AT، ومع ذلك، يمكن أن تستفيد من المشاهدين قراءة مقال ممتاز تقديم تفاصيل مستفيضة حول الاستفادة المثلى من هذه التقنية للإنسان في ^16. الجمهور المستهدف من هذه المادة يتضمن محققين من ذوي الخبرة المحدودة والعاملة مع الماوس AT وأداء التدفق الخلوي. وتعرض العديد من الاعتبارات العملية لتحقيق التوازن بين العائد الخلوية وقدرتها على البقاء مع الوقت والموارد، فضلا عن الضوابط المثلى التدفق الخلوي لوصف AT السكان الخلايا المناعية. بالإضافة إلى بروتوكول لدينا، والقراء هي referrإد إلى المادة إن الرب مؤخرا من قبل باسو وآخرون. لمناقشة ممتازة لبعض الجوانب الفنية من التدفق الخلوي لتشمل الضوابط المناسبة والتعويضات ^17.

Protocol

1. الكواشف واللوازم

قبل الشروع في هذا البروتوكول التجريبي، وإعداد الكواشف التالية:

1. 70٪ من الإيثانول
2. 1X PBS
3. 1X DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) تستكمل مع 0.5٪ BSA
4. FACS العازلة: 1X DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم)، 2 مم EDTA، و 1٪ FCS
5. العازلة ACK: 150 ملي NH ₄ الكلورين، 10 ملي KHCO _3، و 0.1 ملي نا ₂ EDTA في الماء

2. الحصاد وإعداد الأنسجة الدهنية

1. الموت ببطء الفئران وفقا للإجراءات التي وافق عليها IACUC الخاصة بكل مؤسسة.
2. تبلل تماما الفراء مع الايثانول 70٪.
3. إجراء شق على مستوى عملية الخنجري (الجزء السفلي من عظمة القص) وفتح التجويف الصدري لفضح القلب، مع الحرص على عدم قطع أي الأوعية الدموية الرئيسية.

ملاحظة: عند هذه النقطة، بل هو أيضا مفيدة لترك الحجاب الحاجز سليمة بقدر ممكن وخفض خدش للخروج من الجانب الأيمن من القفص الصدري للسماح الدم وسائل الإرواء في التدفق من التجويف الصدري.

4. مقطع الأذين الأيمن للسماح الدم وسائل الإرواء للهروب من نظام الدورة الدموية.

ملاحظة: عندما يكون التعامل مع الفئران السمينة، التامور الزائدة AT قد تحتاج إلى إزالة للسماح بالوصول إلى القلب.

5. فهم القلب مع ملقط وإدراج بلطف إبرة في البطين الأيسر من خلال قمة. يروي ببطء الماوس مع 15 مل العقيمة PBS.

ملاحظة: تخفيض معدل نضح إذا بدأت الرئتين لملء والتوسع.

6. فتح التجويف البريتوني وإزالة منصات الدهون perigonadal باستخدام الحرص على تجنب أي أنسجة الغدد التناسلية.
7. وضع منصات الدهون في وزن قارب على الجليد تحتوي على 2 مل 1X DPBS (بدون المغنيسيوم أو الكالسيوم) تستكمل مع 0.5٪ BSA، واللحم المفروم في الدقيقة القطع الجميلة.

الحمار = "jove_content"> ملاحظة: الحد من كمية AT لكل وزن القارب إلى 1.2 غرام. اذا كان المبلغ من AT يتجاوز 1.2 غرام، تقسيمها بالتساوي بين اثنين من وزن القوارب.

8. الحفاظ على عينات من على الجليد وإعداد 3 مل كولاجيناز حل هضم في AT عينة تتكون من 1X DPBS تستكمل مع 0.5٪ BSA، 10 مم CaCl _2، و 4 ملغ / مل كولاجيناز، من النوع الثاني.

3. الهضم كولاجيناز

1. نقل AT إلى 50 مل أنابيب مخروطية بواسطة صب جناسة والشطف وزن القارب مع DPBS 1 مل (0.5٪ BSA) و 3 مل كولاجيناز الثاني حل هضم.
2. احتضان عند جناسة في شاكر التناوب (200 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
3. إضافة 10 مل DPBS (0.5٪ BSA) إلى أنابيب مخروطية ومكان على الجليد.
4. يسحن جناسة مرات عديدة باستخدام 10 مل ماصة المصلية، وتمرير الايقاف الخلية من خلال 100 ميكرون مرشح في لأنبوب جديد 50 مل المخروطية.
5. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية في 500 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 والتطويرعلى سبيل المثال؛ C.
6. صب طاف و resuspend SVF الخلية بيليه في 3 مل العازلة ACK إلى ليز تلويث الكريات الحمراء.
7. إضافة 12 مل FACS العازلة وتعليق خلية الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
8. صب طاف و resuspend SVF بيليه الخلية في نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة.

ملاحظة: استخدام حجم الخلية بيليه كدليل لمدى FACS العازلة ل resuspend فيه. إذا كان يغطي الخلية بيليه الجزء السفلي من مل المخروطية أنبوب 50، استخدم 0.5-1 مل FACS العازلة، وإلا، في resuspend 0.25-0.5 مل.

9. مكان العينات على الجليد وإعداد مأخوذة تخفيف 01:10 من كل عينة لفرز الخلايا عن طريق خلط 40 ميكرولتر العازلة FACS، 50 ميكرولتر حل الأزرق التريبان (0.2٪)، و 10 ميكرولتر التعليق الخلية.
10. عد خلايا قابلة للحياة على أساس التريبان الأزرق الإقصاء وتمييع تعليق خلية إلى تركيز النهائي من 5-10 × 10 ⁶ خلية / مل.

4. تلطيخ المضادات سطح الخلية

1. أضف مكافحة فأر CD16/CD32 الأجسام المضادة (اف سي بلوك) إلى التركيز النهائي من 0.5-1 μg/10 ⁶ خلايا، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
2. نقل العينات (≥ 10 ⁶ خلايا) إلى 12 × 75 مم البوليسترين جولة أنابيب أسفل. إعداد أنابيب منفصلة إذا تحليل أجهزة الصراف الآلي وخلايا T، والجمع بين الخلايا الإضافية لإعداد عدد كاف من الأنابيب لاستيعاب التعويضات المطلوبة ومضان تعديل ناقص واحد (FMO) الضوابط.

ملاحظة: وكمثال على ذلك، عندما سوف قياس نسبة من أجهزة الصراف الآلي على أساس F4/80 وCD11b، التعويضات التالية والضوابط FMO ابد أن نكون مستعدين:

- غير ملوثين (خلايا)

- دابي أو يوديد propidium (PI) وصمة عار واحد (الخلايا؛ لا تضيف صبغة جدوى حتى الخطوة 5.1)

- F4/80 APC (خلايا أو الخرز التعويض) واحد وصمة عار

- CD11b FITC الخلايا أو واحد وصمة عار (حبات التعويض)

- FMO 1 (خلايا): الجرذ IgG2a κ نمط إسوي السيطرة APC + CD11b FITC + صبغ الجدوى (المضافة في الخطوة 5.1)

- FMO 2 (خلايا): F4/80 APC + الجرذ و IgG2b κ نمط إسوي السيطرة FITC + صبغ الجدوى (المضافة في الخطوة 5.1)

3. إضافة الأجسام المضادة الأولية fluorophore مترافق و / أو ضوابط نمط إسوي في التركيز المناسب (انظر الجدول من الكواشف والمواد).
4. حماية العينات من الضوء واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
5. إضافة 2 مل FACS العازلة وتعليق خلية الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
6. صب طاف و resuspend SVF الخلية بيليه في 2 مل FACS العازلة.
7. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، و resuspend بيليه خلية في صندوق التبرعات الخاص ≥ 400 FACS ميكرولتر العازلة.
8. نقل العينات إلى 12 × 75 مم البوليسترين أنابيب أسفل جولة مجهزة 35 ميكرومتر الخلية مصفاة قمم أنبوب.
9. يحفظ بعيدا عن الضوء، وعينات تخزينها في 4 درجات مئوية حتى تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية.

ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ينبغي تحليل الخلايا immeadiately، ومع ذلك، تم إجراء تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية مع هذا البروتوكول بنجاح على الخلايا المسمى المخزنة في نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة لمدة 1-2 ساعة عند 4 درجات مئوية. إذا كان بحاجة إلى الخلايا لتكون ثابتة لزيادة وقت التخزين، ويمكن أن تكون ثابتة الخلايا المسمى مع بارافورمالدهيد 2٪ في 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة قبل التحليل FACS. الشركات الأجسام المضادة تشير إلى أن الخلايا المسمى يمكن تخزينها لمدة تصل إلى أسبوع واحد، ولكن هذا لم يتم اختباره في سياق هذا الإجراء.

5. تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية

1. قبل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، إضافة إلى عينات صبغ الجدوى والضوابط المناسبة للسماح لايف / الميت تمييز الخلية.

ملاحظة: تتوفر تجاريا العديد من الأصباغ جدوى، ولكن ينصح دابي وPI اعتمادا على الإثارة / الانبعاثات الأستاذديزيل من الأجسام المضادة، مترافق fluorophore المستخدمة. تضاف دابي ويوديد propidium إلى كل عينة في تركيز النهائي من 0.2 ملغ / مل.

2. استخدام عينة السيطرة السلبية غير ملوثين، ويفضل خلايا معزولة من نفس الأنسجة والعينات التجريبية، لضبط الجانب مبعثر (SSC) ومبعثر إلى الأمام (FSC) بحيث يتسنى للسكان الخلية (ق) من الفائدة هي على نطاق واسع.

ملاحظة: بالنسبة لتحليل AT الخلايا صندوق التبرعات الخاص، فمن المستحسن أن SSC يتم عرضها في نطاق السجل مقابل FSC في مقياس خطي. استخدام نطاق وسجل لSSC أهمية خاصة عند تحليل أجهزة الصراف الآلي، والتي غالبا ما تكون كبيرة جدا ومحبب.

3. رسم ضوء بوابة مبعثر الأولي يعتمد على نوع الخلية (الخلايا) التي يجري تحليلها، وضبط أنبوب مضخم (PMT) مكسب بحيث الخلايا غير ملوثين هي في أقصى اليسار من الرسم البياني-معلمة واحدة (تركز على ما يقرب من 10 ²⁾ للقنوات المناسبة.

ملاحظة: من المستحسن أن الخلايا الليمفاوية والضامة (أو خلايا الدم النخاعي أخرى) يتم تحليلها بشكل منفصل بسبب وجود خلافات في تألق ذاتي.

4. استخدام عناصر التحكم الملون واحد أو الضد التقاط حبات تعويضات لأداء التعويض متعددة الألوان.

ملاحظة: من المستحسن استخدام الخرز التعويض، ولكن لا بد من ضمان التوافق من كل الأجسام المضادة. على سبيل المثال، والخرز التعويض قد لا عبر تتفاعل مع الأجسام المضادة أرنب، وفي هذه الحالة يطلب من خلايا منعزلة للحصول على سيطرة وصمة عار واحد المناسبة.

5. تعيين غيتس التجريبي القائم على ضوابط FMO معدلة.
6. ضبط تدفق عداد الكريات لجمع العدد المناسب من الأحداث على أساس انتشار السكان من الاهتمام وتسجيل البيانات التجريبية.
7. تصدير ملفات البيانات FCS للتحليل غير متصل. وهناك العديد من البرامج المتاحة لتدفق cytometrتحليل البيانات ذ. نوصي Cytobank، منصة على شبكة الإنترنت التي تسمح investigatores لتخزين وتحليل البيانات وتوليد الأرقام من أي جهاز كمبيوتر مع الوصول إلى الإنترنت ^18. بالإضافة إلى ذلك، Cytobank يوفر القدرة على جعل الوصول إليها الجمهور البيانات أو تقييد الوصول إلى المتعاونين.

النتائج

وقد استخدم الهضم كولاجيناز من AT تليها الطرد المركزي المغاير لعزل صندوق التبرعات الخاص من منصات الدهون بربخي من الفئران C57BL/6J ذكر تغذية قليلة الدهون (10٪ سعر حراري من الدهون)، أو ارتفاع الدهون (60٪ سعر حراري من الدهون) النظام الغذائي (LFD وHFD ، على التوالي) لمدة 16 أسبوعا. ثم ?...

Discussion

وقد أدى الاهتمام المتزايد في دور الجهاز المناعي في العواقب الأيضية من السمنة إلى الاستخدام الواسع النطاق للالتدفق الخلوي لتحديد خصائص الخلايا المناعية من AT. على الرغم من أن بروتوكول الدقيقة تختلف بين المختبرات على أساس الخبرة الخاصة بهم والمعدات المتاحة، وتشمل الخ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml	Life Technologies	14190-250
DAPI	Life Technologies	D3571
BSA	Sigma	A2153-100G
collagenase	Sigma	C6885-5G
propidium iodide solution	Sigma	P4864-10 ml
stable stack 20 microliter	Rainin	SS-L10
20 microliter filter tips	Rainin	SRL10F
stable stack 250 microliter tips	Rainin	SS-L250
1000 microliter tips	Rainin	GPS-L1000
1000 microliter filter tips	Rainin	GP-L1000F
250 microliter Filter Tips	Rainin	SR-L200F
FC Block	BD Biosciences	553142
fisher 100mn strainers	Fisherbrand	22-363-549
medium weigh dish	Fisherbrand	02-202B
aluminum foil	Fisherbrand	1213100
mincing scissors	Fisherbrand	089531B
Vortex	Fisherbrand	2215365
50 ml conical tubes	BD Falcon	14-959-49A
filter top FACS tubes	BD Falcon	352235
10 ml pipette case 200	BD Falcon	1367520
round bottom tubes	BD Falcon	352058
5 ml syringe	BD Falcon	309646
V Bottom Plates	Costar	07-200-107
transfer bulb pipette	Thermo Scientific	13-711-22
Shaker	Thermo Scientific	11 676 071
Adhesive mat	Thermo Scientific	1368750
Cell Culture Centrifuge	Sorvall	75253839
Adapters	Sorvall	75003723
Rat anti-mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553142	Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells
Rat anti-mouse F4/80	eBioscience	17-4801	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321
Rat anti-mouse CD11b	eBioscience	11-0112	Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031
Armenian Hamster anti-mouse CD11c	eBioscience	12-0114	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88
Goat anti-mouse MGL1/2	R&D Systems	FAB4297P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Goat anti-mouse CD206	R&D Systems	FAB2535P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Rat anti-mouse CCR2	R&D Systems	FAB5538P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P
Armenian Hamster anti-mouse TCRβ	BD Biosciences	553174	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956
Rat anti-mouse CD8a	BD Biosciences	552877	Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784
Rat anti-mouse CD4	BD Biosciences	557956	Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963
Table 1. List of Materials and Reagents.