تقييم ما قبل السريرية من التيروزين كيناز مثبطات لعلاج اللوكيميا الحادة

Summary

يتم التعبير عن مستقبلات التيروزين كيناز ectopically في العديد من أنواع السرطان وتم تحديدها كأهداف العلاجية في سرطان الدم الحاد. يصف هذا المخطوط استراتيجية فعالة لتقييم ما قبل السريرية من مثبطات كيناز التيروزين لعلاج سرطان الدم الحاد.

Abstract

قد تورطت مستقبلات التيروزين كيناز في تطور وتقدم العديد من أنواع السرطان، بما في ذلك سرطان الدم والأورام الصلبة، وتكون الأهداف العلاجية druggable جذابة. نحن هنا تصف استراتيجية من أربع خطوات فعالة لتقييم ما قبل السريرية مثبطات التيروزين كيناز (TKIs) في علاج سرطان الدم الحاد. في البداية، تم استخدام تحليل لطخة غربية لتأكيد تثبيط الهدف في خلايا سرطان الدم مثقف. ثم يتم تقييم النشاط الوظيفي باستخدام المقايسات مولد الرمع في ميثيل أو الثقافات أجار لينة. يتم تقييم المركبات التجريبية التي تثبت النشاط في المقايسات الثقافة خلية في الجسم الحي باستخدام NOD SCID جاما (مجموعة موردي المواد النووية) الفئران زرع orthotopically مع خطوط الخلايا البشرية سرطان الدم. الأولي في الدراسات المجراة الدوائية تقييم تثبيط الهدف في انفجارات معزولة عن اللوكيميا في نخاع العظام. ويستخدم هذا النهج لتحديد الجرعة والجدول الزمني اللازم لإدارة فعالة تمنع الهدفأيون. دراسات لاحقة تقييم فعالية TKIs في الجسم الحي باستخدام luciferase المراسل معربا عن خلايا سرطان الدم، مما يسمح للإضاءة الحيوية للرصد غير الغازية من عبء اللوكيميا وتقييم استجابة علاجية باستخدام في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي نظام التصوير. وكانت هذه الاستراتيجية فعالة لتقييم TKIs في المختبر والمجراة ويمكن تطبيقها لتحديد وكلاء جزيئيا المستهدفة مع الإمكانات العلاجية أو للمقارنة المباشرة وإعطاء الأولوية للمركبات متعددة.

Introduction

سرطان الدم الليمفاوي الحاد (ALL) هو الورم الخبيث الأكثر شيوعا عند الأطفال ^1،2. معدل البقاء على قيد الحياة عموما للأطفال ALL-B النسب (B-ALL) هو ما يقرب من 85٪، ولكن الأنواع الفرعية بيولوجية معينة، بما في ذلك النسب T-ALL (T-ALL)، يكون لا يزال الأكثر فقرا التكهن حتى مع البروتوكولات العلاجية الحالية. لا يزال مزيد من العلاج من انتكس ALL تحديا ^3. على الرغم من أن الغالبية العظمى من المرضى البالغين المصابين بسرطان الدم الحاد تحقيق مغفرة مع العلاج الكيميائي في خط الهجوم، العديد من المرضى لا تزال تعاني من الانتكاس ^4. ومن المعروف نظم العلاج الكيميائي الحالي في علاج سرطان الدم الحاد لتتسبب في آثار جانبية طويلة المدى القصير والمرتبطة سمية. وبالتالي، هناك حاجة ماسة إلى علاجات أقل سمية التي تستهدف على وجه التحديد خلايا السرطان مع تأثير ضئيل على الأنسجة الطبيعية. في السنوات الأخيرة، وقد تم التركيز على تطوير الرواية، وكلاء المستهدفة جزيئيا مع خصوصية لخلايا السرطان، وغالبا ما تستخدم الكيمياء التكراريةلتوليد المركبات النشطة المتعددة التي يجب عندئذ مقارنة وتحديد أولوياتها ^5. يصف هذا المخطوط استراتيجية فعالة لتقييم ما قبل السريرية من TKIs لعلاج سرطان الدم الحاد، والتي يمكن استخدامها لتقييم مركب واحد أو لمقارنة مباشرة من المركبات متعددة من أجل تسهيل تطوير العقاقير.

طريقة المقدمة هنا يتكون من أربع خطوات. أولا البيوكيميائية (1) ومكافحة سرطان الدم (2) يتم تقييم أنشطة المجمع (ق) في خلية ثقافة، ثم يتم تأكيد تثبيط الهدف في النماذج الحيوانية (3)، وأخيرا الكفاءة العلاجية للTKI (ق) يتم تحديد سرطان الدم في نماذج طعم أجنبي مثلي (4). لهذه الدراسات، فمن المهم اختيار خطوط الخلايا ذات الصلة، والتي هي ممثلين عن الأنواع الفرعية البيولوجية الأكثر شيوعا. وينبغي اختيار خطوط الخلايا، والتي على حد سواء، والتعبير عن الهدف من الفائدة وتفتقر إلى الهدف من الفائدة، للتحقيق في ما إذا كانت الآثار البيولوجية ميدiated عن طريق تثبيط الهدف. وهذا هو ذات الصلة ولا سيما لتطوير مثبطات جزيء صغير، والتي لها آثار خارج الهدف التي قد تكون مهمة للنشاط المضادة للورم. من الضروري أيضا اختيار خط الخلية التي تعتمد على الهدف للآثار وظيفية مثل الانتشار أو البقاء على قيد الحياة. ويمكن استخدام دراسات التحقق من صحة الهدف الأولي (خارج نطاق هذه المقالة) باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي أو وسائل أخرى محددة لمنع الهدف لتحديد خطوط الخلايا التي تعتمد على الهدف. ومن المستحسن أيضا لاختيار خطوط الخلايا التي يمكن أن تشكل xenografts الفئران، مثل أن نتائج زراعة الخلايا يمكن أن يكون ترجمة لفي التجارب المجراة على نحو أكثر مباشرة.

لتقييم النشاط البيوكيميائية بوساطة TKIs في خلايا سرطان الدم، انخفاض في مستقبلات الفسفرة يمكن استخدامها كمؤشر على تثبيط الهدف. ويمكن استخدام تحليل لطخة غربية أو ELISA المقايسات، وهذا يتوقف على مدى توافر ونوعية الأجسام المضادة.إذا كانت الأجسام المضادة مع خصوصية كافية لهدف المتاحة، فحوصات ELISA هي الأفضل لأنها أكثر كمية وكفاءة. في الحالات التي تكون فيها الأجسام المضادة مع خصوصية كافية لELISA ليست متاحة، قد يكون من الضروري تحليل لطخة غربية. في هذه الحالة، يمكن مناعي من كمية كبيرة من المحللة تكون مفيدة للكشف عن الأهداف التي هي في وفرة منخفضة. هذا النهج هو ذات الصلة ولا سيما لقياس الفوسفات، والبروتينات، والتي قد يكون لها نصف حياة قصيرة للسماح للتغيرات السريعة في إشارة استجابة للمؤثرات البيئية. بعض البروتينات فسفرته هي عطوب للغاية، وعلى الأرجح نتيجة لتشكيل معقدة مع phosphatases. للكشف قوية وثابتة من هذه البروتينات فسفرته، قد يكون من الممكن أيضا لعلاج الخلايا مع pervanadate، وهو لا رجعة فيه بروتين تيروزين الفوسفاتيز المانع ^6، لتحقيق الاستقرار في الفوسفات من البروتين قبل إعداد لست] خلية كاملة.

إلىتحديد ما إذا كان النشاط البيوكيميائية النتائج في تأثيرات مضادة للورم، والعمليات البيولوجية التي تعتمد على الهدف يمكن رصدها في التجارب القائمة على الخلية. لخطوط خلية سرطان الدم، النشاط المضاد للسرطان الدم بوساطة TKIs يمكن تقييمها باستخدام فحوصات أجريت في تشكيل مستعمرة ميثيل أو أجار لينة ^7. أجار لينة قد يكون من المفضل لأن هذا هو وسيلة الصلبة التي هي أكثر قابلية للتلاعب إذا كان العلاج تتكرر مع TKI ضروري. في حين أن العديد اللوكيميا myloid (AML) خطوط الخلايا الحادة وشكل مستعمرات في أجار لينة، فإن معظم خطوط الخلايا ALL تشكل فقط المستعمرات في ميثيل، والذي هو وسيلة شبه صلبة. على الرغم من أنه من الممكن لتحديث المتوسطة و / أو TKIs في الثقافات ميثيل، فقط كميات صغيرة يمكن استخدامها مع وتيرة محدودة. وبالمثل، فإنه من الصعب صمة عار المستعمرات دون تعطيل لهم في ميثيل. ينبغي أن تحدد الدراسات الأولية قدرة خطوط الخلايا المناسبة لشكل مستعمرات في ميثيل و / أو أجار لينة ورانه الكثافة المثلى من الخلايا في الثقافة بحيث المستعمرات غير قابلة للتداخل وعدد كاف إحصائيا للحصول على البيانات ذات الصلة (عادة 50-200 المستعمرات في لوحة 35 ملم).

بينما في فحوصات المختبر هي قوية وفعالة من حيث التكلفة، ولها آثار أخلاقية أقل من التجارب على الحيوانات كلها، والنهوض من المركبات العلاجية يتطلب دليلا على فعالية وسلامة في النماذج الحيوانية. لفي الدراسات المجراة، خطوط الخلايا البشرية سرطان الدم الحاد يمكن زرعها في orthotopically NOD.Cg-Prkdc ^SCID أنا l2rg ^tm1Wjl / SzJ (مجموعة موردي المواد النووية) الفئران وTKIs عن طريق الحقن أو عن طريق الفم بالتزقيم يمكن أن تدار بسهولة. بعض خطوط الخلايا قد تتطلب تعرض الفئران مجموعة موردي المواد النووية إلى خلية المنخفضة التي تعتمد على خط جرعة من الإشعاع من أجل xenografts أن ينشئ، والفئران في هذه الحالة قد لا تتسامح مع أنبوب تغذية عن طريق الفم دون فترة نقاهة 5-10 يوم آخر التشعيع. يصف هذا المخطوط جيل من B-ALL وT-ALL xenografts استخداميمكن إنشاء خطوط خلية معينة (697 وJurkat) كأمثلة ولكن xenografts في الفئران مجموعة موردي المواد النووية باستخدام مجموعة واسعة من خطوط الخلايا. في حال أن خطوط الخلايا الأخرى هي أكثر قابلية للتطبيق، شرط التشعيع، ينبغي تحديد العدد الأمثل من الخلايا لزرع، وتوقيت ظهور المرض وتطور تجريبيا. من الناحية المثالية، فإن هذه النماذج وانتفاذ كاملة (كل حيوان زرع يتطور سرطان الدم)، حركية متناسقة (اللوكيميا تقدم مماثل في جميع الحيوانات)، ونافذة معالجة معقولة (مثالي بين 20-30 يوما من بدء العلاج وإزالة من الدراسة بسبب المرض) . ويمكن زيادة عدد الخلايا المزروعة لتحسين انتفاذ والاتساق الحركية أو انخفضت إلى تحسين إطار العلاج إذا لزم الأمر.

لتحديد ما إذا TKIs تتدخل لإعاقة الهدف في الجسم الحي، يتم جمع عينات من الفئران مع xenografts سرطان الدم بعد العلاج مع TKI أو مركبة فقط. من الناحية المثالية، فإن جرعةوتسترشد جدول د الإدارة لهذه التجارب من خلال الدراسات الدوائية، والتي يمكن في كثير من الأحيان أن يقوم بها المختبرات التجارية وخارج نطاق هذا المقال. إذا كانت البيانات الدوائية المتاحة، وتركيز مركب المطلوبة لتثبيط فعالية المستهدفة في خلية ثقافة والحد الأقصى للتركيز مصل الدم بعد جرعة واحدة من TKI يمكن استخدامها لتحديد جرعة البداية لدراسات على الحيوانات. يمكن أن الدراسات الدوائية أيضا بإبلاغ توقيت جمع العينة بعد العلاج للدراسات الدوائية وطريقة التعاطي. تثبيط الهدف يمكن تقييمها في أي جهاز المتضررة ولكن الأنسجة التي يتم جمع معظم بسهولة ومعالجتها هي الأفضل. خطوط الخلايا سرطان الدم الحاد الأكثر إقامة في الكبد ونخاع العظم والطحال والدم المحيطي، والجهاز العصبي المركزي، على الرغم من أن أجهزة معينة المتضررة ومدى engraftment في هذه الأجهزة تختلف بين النماذج. بروتوكول المعروضة هنا يقيم phosphس البروتين تثبيط نخاع العظام في استخدام تحليل لطخة غربية، ولكن الأجهزة الصلبة قد يكون من الأسهل لجني باستمرار وتتطلب معالجة الحد الأدنى أو أي قبل التجميد، مما يتيح فرصة أقل للتدهور الفوسفات البروتينات أثناء جمع العينات وتجهيزها. ويمكن أيضا أن تستخدم المناعية لتقييم أورام أو الأجهزة المتضررة من سرطان الدم الصلبة.

أخيرا، يتم تحديد الكفاءة العلاجية للTKI (ق) في نماذج طعم أجنبي مثلي سرطان الدم. لهذه الدراسات، توقيت بدء العلاج يمكن أن تختلف، بحيث يتم إنشاء أكثر أو أقل المرض. العلاج قد تبدأ على الفور بعد زرع لإجراء الدراسات الأولية ومن ثم يتأخر في دراسات لاحقة حتى يتم الكشف عن عبء المرض كبيرة لتقريب أكثر عن كثب نموذج العلاج التشخيص. من الناحية المثالية، وهذه النماذج الحيوانية أيضا القدرة على القياس غير الغازية من عبء المرض. قمنا الأمثل للأساليب إدخال إبليس اليراعبورصة عمان الجين في خطوط الخلايا سرطان الدم باستخدام جزيئات الفيروسات مثل، والسماح لغير الغازية، وتحليل طولية من بداية ظهور أعراض المرض والتقدم وتقييم عبء المرض في نخاع العظام والأعضاء الصلبة. الحرجة لهذا النهج هو استخدام خطوط الخلايا وحيدة النسيلة الموسومة luciferase المراسل لمنع التقلبات في تطوير سرطان الدم، معربا عن luciferase المراسل المرتبطة باستخدام خطوط الخلايا بولكلونل والعلاج ليست لها علاقة مع TKI ^8.

أخذت معا، وهذه الخطوات يمكن استخدامها لتقييم لTKI واحدة أو للمقارنة المباشرة وترتيب TKIs متعددة. بينما البروتوكولات المعروضة هنا التركيز على تطوير TKIs، وهذه الأساليب يمكن تكييفها لأهداف أخرى وموصوفة اعتبارات للتنمية الفحص. وبالتالي، قد يكون هذا أكثر قابلية للتطبيق على نطاق واسع الاستراتيجية لتقييم ما قبل السريرية وكلاء جزيئيا المستهدفة للعلاج من سرطان الدم الحاد.

Protocol

اتبعت كل التجارب التي تنطوي على الحيوانات والمعايير التنظيمية التي وافقت عليها لجنة جامعة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية كولورادو. تمت الموافقة على بروتوكول يتبين من جامعة جنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية كولورادو.

1. الفوسفات من البروتين البقعة الغربية

1. إعداد لست]
   1. خطوط الخلايا ثقافة التعبير عن مستقبلات التيروزين كيناز من الفائدة. خلايا الحصاد وصفيحة 3-5 × 10 ⁶ خلية / عينة في 400 ميكرولتر المتوسطة النمو في 48 طبق جيدا زراعة الأنسجة. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ لمدة 2-3 ساعة.
   2. إضافة 100 ميكرولتر من حل 5X TKI في النمو المتوسطة واحتضان لمدة 60 دقيقة.
   3. إعداد العازلة تحلل مع 50 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5)، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 10 ملي EDTA، 10٪ (V / V) الجلسرين، 1٪ (V / V) تريتون X-100، ومثبطات الأنزيم البروتيني. إذا لن يتم التعامل مع الثقافات pervanadate قبل الحصاد، إضافة مثبطات إنزيم الفوسفاتيز (orthova 1 ملم الصوديومnadate و 0.1 ملي كربونات الصوديوم) إلى تحلل العازلة.
   4. إعداد pervanadate (PV) حل المانع الفوسفاتيز فورا قبل الاستخدام. إعداد محلول 0.3٪ من بيروكسيد الهيدروجين (تنبيه) في البرد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في أنبوب الظلام على الجليد (1:100 تمييع الحل الأسهم 30٪). تغلي قسامة من 0.2 M الصوديوم orthovanadate (OV، تنبيه) محلول المخزون لمدة 5 دقائق. تمييع 1:10 في برنامج تلفزيوني لجعل 20 ملي OV الحل في درجة حرارة الغرفة (RT). خلط 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين و 20 ملي OV 1:1 و احتضان في الظلام في RT لمدة 20 دقيقة.
   5. تمييع الكهروضوئية في المتوسطة كاملة (60 ميكرولتر PV + 940 ميكرولتر المتوسطة). إضافة 100 ميكرولتر من المخفف PV / جيد. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ لمدة 3 دقائق ثم وضع لوحة على الجليد.
   6. حصاد الخلايا في أنابيب microfuge الباردة في 2،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. طاف نضح والخلايا resuspend في 120 ميكرولتر من العازلة تحلل. احتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة. توضيح المحللة في microfuge الباردة في 6،000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق. نقل سوبrnatant إلى أنبوب الباردة الطازجة. المحل في -80 درجة مئوية.
2. مناعي
   1. تدور باستمرار بروتين G حبات sepharose و في microfuge في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف وتغسل حبات 2X مع 1 مل PBS الباردة. إضافة حجم مساو من برنامج تلفزيوني لجعل الطين 50٪. إضافة الأجسام المضادة الأولية و 20 ميكرولتر 50٪ بروتين G حبات لكل عينة. احتضان لمدة 2 ساعة - O / N عند 4 درجات مئوية على محور دوار.
   2. نبض أسفل حبات البرد في microfuge في 9،000 دورة في الدقيقة. إزالة طاف وتغسل حبات 2X مع 150 ميكرولتر العازلة تحلل الباردة. تدور في microfuge الباردة في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف و resuspend بيليه في 20 ميكرولتر العازلة عينة SDS 2X مع 2 المركابتويثانول (تنبيه). استخدام فورا أو تخزينها في -80 درجة مئوية.
   3. عينات يغلي لمدة 5 دقائق وعلى المدى SDS-PAGE-تريس جليكاين هلام. نقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز الفوسفات وكشف البروتين بواسطة لطخة غربية.
   4. شطف وصمة عار مع الماء ثم احتضان في 2٪ SDS، 62.5 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 6.8)، 0.1 M β-المركابتويثانول (تنبيه) لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية. شطف 2X مع الماء ثم يغسل لمدة 60-90 دقيقة في 5-6 التغيرات في TBS-T لإزالة تجريد الحل.
   5. الكشف عن البروتين الكلي من قبل لطخة غربية.

2. ميثيل الفحص

1. قسامة 4 مل من ميثيل المتوسطة قاعدة الإنسان في أنابيب مخروطية 50 مل باستخدام العقيمة تتحمل كبيرة حادة نهاية الإبرة. (ملاحظة: ميثيل يمكن aliquoted وتخزينها في -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد في RT O / N قبل استخدامها)
2. إضافة 500 ميكرولتر من 10X TKI أو مركبة في النمو المتوسط ​​إلى 4 مل من ميثيل وخليط دوامة لمدة 10 ثانية.
3. الحصاد وخلايا العد. إعداد تعليق خلية في النمو المتوسطة في التركيز، وهو 10X أعلى من تركيز الخلية النهائي. إضافة 500 ميكرولتر الخلية تعليق لخليط ميثيل. دوامة لمدة 10 ثانية وترك الجلوس لمدة 10 دقيقة لإزالة الفقاعات.
4. وضع 4 مل من خليط ميثيل باستخدام حقنة 5 مل العقيمة وتأه حمل نهاية إبرة حادة. تجنب وضع الفقاعات. الاستغناء 1 مل من الخليط ميثيل في وسط الثلاث 35 ملم الأنسجة لوحات الثقافة. دوامة الأطباق حتى يتم تغطية الجزء السفلي تماما مع ميثيل.
5. لكل لوحة ميثيل، وإعداد 10 سم معقمة لوحة زراعة الأنسجة مع اثنين إضافية 35 ملم لوحات زراعة الأنسجة مملوءة بالماء المعقم لضمان بيئة رطبة. مكان الثقافات في الماء تغلف حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ لمدة 10-14 يوما.
6. عد المستعمرات بعد 1-2 أسابيع. يجب أن تكون المستعمرات أكثر من 20 خلايا وليس متداخلة. المستعمرات يمكن عدها باستخدام مجهر مقلوب مجهزة مرحلة المجهر مع شبكة أو باستخدام عداد مستعمرة الآلي. وينبغي أيضا تقييم التغييرات في حجم مستعمرة أو التشكل في الاستجابة للعلاج مع TKI. لتحسين الكشف عن طريق مكافحة مستعمرة، المستعمرات وصمة عار وذلك بإضافة 60-100 ميكرولتر من (3 - (4،5-ثنائي ميثيل-2-thiazolyl) -2،5-ثنائي الفينيل-2H-نتروبلو بروميد سولution (الإنتقالي العسكري، 5 ملغ / مل في H ₂ O، تخزينها في -20 درجة مئوية، بعيدا عن الضوء، تنبيه) غلبه الحكمة على سطح كل لوحة واحتضان لمدة 8 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2.

3. لينة آجار الفحص

1. إعداد 1٪ أجار النبيلة للطبقة القاع، 0.7٪ أجار النبيلة للطبقة العليا والمتوسطة 2X النمو. تتوازن 2X المتوسطة النمو في 42 ° C حمام الماء. الحرارة 1٪ و 0.7٪ أجار النبيلة في الميكروويف (حوالي 1 min/100 مل)، وتتوازن في حمام مائي 42 ° C. خلط أجزاء متساوية من 1٪ أجار و 2x والمتوسطة بشكل منفصل 0.7٪ أجار و 2x المتوسطة في 50 مل conicals. خطة 10 مل من أجار لينة خليط / لوحة ستة جيدا لكل طبقة.
2. تسمية 6 جيدا لوحات زراعة الأنسجة. ملء كل جيدا مع 1.5 مل 1٪ خليط أجار لينة. تجنب فقاعات أثناء الطلاء. لوحات الجافة مع الأغطية قبالة في هود عقيمة لمدة 30 دقيقة.
3. عد الخلايا. إعداد تعليق خلية في النمو المتوسطة في التركيز، وهو 500X أعلى من concentrati الخلية النهائيعلى. إضافة تعليق خلية إلى 0.7٪ خليط أجار، تخلط جيدا والاستغناء 1.5 مل من الخليط خلية أجار على الجزء العلوي من طبقة أجار 1٪. دعونا الطبقة العليا يصلب لمدة 30 دقيقة.
4. إعداد 1X المتوسطة النمو تحتوي على TKI أو السيطرة على السيارة. إضافة 2 مل من المتوسط ​​مع التركيز المطلوب من TKI على رأس الطبقة العليا أجار.
5. احتضان الثقافات لمدة 10 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2. إزالة واستبدال المتوسطة تتراكب كل 3 أيام.
6. عندما المستعمرات مرئية للعين المجردة، تتراكب نضح المتوسطة وإضافة 200 ميكرولتر نيترو نتروبلو الحل الأزرق (1 ملغ / مل NBT في H ₂ O، تخزينها في 4 درجة مئوية، بعيدا عن الضوء، تنبيه). العودة إلى الحاضنة لمدة 24-48 ساعة. الانتقال إلى 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل قبل العد. ويمكن تخزين لوحات الملون في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد. عد المستعمرات باستخدام مجهر أو عداد مستعمرة الآلي.

4. تقييم الفوسفات تثبيط البروتين في الجسم الحي

1. جمع جأذرع نموا في مرحلة سجل بواسطة الطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي في أعلى الجدول 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة و resuspend في برنامج تلفزيوني في تركيز المناسب (عادة 1-5 × 10 ⁷ خلية / مل). خلايا الزرع في حجم 100 ميكرولتر في الأسبوع 6-12 الفئران مجموعة موردي المواد النووية القديمة عن طريق الحقن في الوريد في الوريد الذيل باستخدام حقنة الانسولين 28 G. وضع الحيوان في كابح، تسخين الذيل في كوب من الماء الدافئ لتمدد الأوردة، وتنظيف الذيل مع مسحة الكلورهيكسيدين قبل الحقن. بعد الحقن، وممارسة الضغط على موقع الحقن باستخدام شاش معقم حتى يتوقف النزيف. زرع ما لا يقل عن 3 حيوانات / المجموعة. الحفاظ على الفئران على المياه التي تحتوي على 1 ملغ / مل سلفات الجنتاميسين.
2. أربعة عشر يوما بعد الزرع، وعلاج الحيوانات مع TKI أو مركبة فقط، وعينات الحصاد لتحليل تثبيط الهدف. وزن الحيوانات وعلاج مع الجرعة المناسبة (ملغم / كغم من وزن الجسم) من TKI أو مركبة. إدارة العلاج في حجم 5 مل / كغرام من وزن الجسم عن طريق داخل الصفاق (IP) حقن أو 10 مل / كجم من وزن الجسم عن طريق التغذية الأنبوبية عن طريق الفم. للحقن الملكية الفكرية، وكبح جماح الماوس يدويا وحقن في الربع السفلي الأيمن من البطن باستخدام إبرة G 29. لأنبوب تغذية عن طريق الفم، وكبح جماح الماوس يدويا مع الاستمرار على الحيوان في وضع مستقيم. وضع أنبوب التغذية الأنبوبية في الفم على اللسان وداخل الجزء الخلفي من الفم. تطبيق ضغط طفيف لتمرير أنبوب عبر المريء الى المعدة و. كساد الغطاس حقنة لإدارة العلاج. إذا لم المكبس خفض بسهولة يجب إزالة إبرة التغذية الأنبوبية وأعادت. إعداد الصياغات TKI فورا قبل الاستخدام.
3. إذا كان المطلوب معالجة pervanadate، وإعداد حل PV 20 دقيقة قبل الحصاد كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1.1.4) وتمييع في المتوسطة مع 1 ميكرومتر MgCl ² و 100 U / مل الدناز (120 ميكرولتر PV + 880 متوسطة ميكرولتر). ملاحظة: PV مستقرة لا يقل عن 1 ساعة بعد التخفيف.
4. تضحية الحيوانات CO ₂ الخدر في أبالوقت تكبده (ق) بعد العلاج. تشريح عظام الفخذ عن طريق إزالة الفراء والجلد والعضلات من الساق بأكملها بحيث تتعرض العظام تماما. إزالة عظام الفخذ بواسطة قطة مع تشريح مقص أقل بقليل من مفصل الورك، ومرة ​​أخرى فوق مفصل الركبة. نقل إلى طبق بتري ونخاع العظام مطاردة مع 1 مل PBS الباردة أو حل PV المخفف باستخدام حقنة و27 G الإبرة. إذا علاج مع PV، في احتضان RT في الظلام لمدة 10 دقيقة.
5. إعداد لست] وتحليل مستويات الفوسفات من البروتين والبروتين الكلي، كما هو مبين أعلاه (الخطوات 1.1.6-1.2.5).
6. Quantitate النسبية الفوسفات من البروتين ومستويات البروتين الكلي للكل عينة باستخدام كثافة. حساب النسبية phospho-protein/total-protein إلى متوسط ​​قيمة phospho-protein/total-protein للحيوانات المعالجة السيارة.

5. تقييم نشاط مكافحة سرطان الدم من TKIs في جميع النماذج طعم أجنبي

1. إذا لزم الأمر، وتعريض الفئران ل200 CGY الإشعاع في irradiator-RS 2000 PRIO يوم واحدr لزرع. الفئران زرع مع خطوط الخلايا سرطان الدم كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4.1). زرع ما لا يقل عن 6 الفئران في كل مجموعة. تحديد الفئران عن طريق الأذن لكمة. بدلا من ذلك، يمكن استخدام علامة سوداء لتحديد الفئران مع علامات التجزئة على ذيولها. إضافة تخصيب اليورانيوم لأقفاص للحد من احتمالات العدوان قفص زميله أثناء الدراسة.
2. علاج الفئران مع TKI أو مركبة فقط كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4.2). رصد الوضع الصحي من الفئران يوميا عبر الفحص البدني والعزم الوزن. الأعراض المتوقع سرطان الدم (انخفاض مستوى النشاط، وفقدان الوزن، والشلل أطرافه الخلفية، والتهابات العين). عادة ما يرتبط فقدان الوزن أكثر من 10٪ -15٪ مع وفاة الماوس في غضون يومين وعادة ما يكون نقطة نهاية بديلة للموت وفقا لمتطلبات IACUC القياسية.
3. رصد engraftment وتطوير سرطان الدم عبر الجسم الحي تلألؤ بيولوجي في نظام التصوير يصل إلى 2x الأسبوعية. إعداد 200X-D وسيفيرين محلول المخزون (30 ملغ / مل) في STERIلو المياه. المزيج بلطف بواسطة انقلاب حتى يذوب D-وسيفيرين تماما. استخدامها على الفور، أو قسامة والتجميد في -20 درجة مئوية. قبل التصوير باستخدام في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي نظام التصوير، وذوبان الجليد مأخوذة من D-RT في وسيفيرين وتمييع 01:02 في برنامج تلفزيوني إلى تركيز النهائي من 15 ملغ / مل وتصفية تعقيم خلال 0.2 ميكرون التصفية.
4. تخدير الفئران قبل التصوير مع 1.5٪ isoflurane واستنشاق الأكسجين في. رصد تخدير كافية، وتتميز استرخاء العضلات، وفقدان الحركة، وفقدان الاستجابة لتحفيز أخمص القدمين قرصة.
5. مباشرة قبل التصوير، وإدارة 150 ملغ / كغ من وزن الجسم D-وسيفيرين عن طريق الحقن الملكية الفكرية (10 ميكرولتر من 15 ملغ / مل وسيفيرين / غرام من وزن الجسم).
6. استخدام نظام التصوير تلألؤ بيولوجي في الجسم الحي لالتقاط سلسلة من الصور 2 مع متتابعة 30 و 60 و 90 ثانية والتعرض الصورة النهائية مع التعرض ثانية 120. بعد التصوير، والعودة إلى أقفاص الفئران ورصد للتعافي من التخدير. تبعا لشدة تلألؤ بيولوجي، يمكن أن تختلف مرات التعرض. وينبغي سلفا مرات التعرض الأمثل لنموذج معين وأبقى متناسقة بحيث شدة إشارة لنقطة زمنية قابلة للمقارنة عبر الفردية الدراسة بأكملها.
7. تحديد شدة تلألؤ بيولوجي لكل فأر باستخدام المعيشة صورة 3.2 اقتناء وتحليل البرمجيات. تحديد مجموع القيم في قياس تدفق الفوتونات / ثانية صنف من الفائدة (ROI) من حجم متطابقة على كل الماوس الرسم.
8. التضحية الفئران عن طريق CO ₂ التعرض وخلع عنق الرحم إذا المحتضرة، واظهار الشلل، في حالة أكبر من 15٪ وفقدان الوزن، أو في نهاية الدراسة. تشريح الفئران والملاحظات سجل (مثل تضخم الغدد الطحال والكبد، أو الليمفاوية؛ شاحب نخاع العظام). تشريح عظام الفخذ ونخاع العظام مطاردة مع PBS الباردة باستخدام إبرة G 27.
9. جمع الخلايا في microfuge في 2،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. الخلايا resuspend في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FBS واحتضان لمدة 5 دقائق على RT.جمع الخلايا وصمة عار مع 20 ملغ / مل دابي (4،6-Diamidino-2-phenylindole هيدروكلوريد، 1:1،000) وFITC مترافق α-hCD45 (1:100) أو الماوس مفتش الرقابة ₁ الضد isotype (1:100) . تقييم سرطان الدم engraftment باستخدام التدفق الخلوي. البوابة على السكان قابلة للحياة (دابي سلبية) وتحديد النسبة المئوية للخلايا CD45 + (انفجارات نخاع العظام٪).

النتائج

المقايسات المقدمة هنا تقييم آثار البيوكيميائية والوظيفية بوساطة TKIs، ويمكن استخدامها لتصنيف المركبات رواية تقوم على درجة تثبيط الهدف في المختبر والمجراة، والحد من تشكيل مستعمرة، والتأخير في حدوث الاييضاض في الفئران مجموعة موردي المواد النووية المزروعة مع lucife...

Discussion

يصف هذا المخطوط استراتيجية فعالة لتقييم مثبطات التيروزين كيناز الرواية في علاج سرطان الدم الحاد. باستخدام هذا النهج، يتم تقييم الأنشطة البيوكيميائية ومكافحة سرطان الدم الأول في المقايسات خلية مقرها في المختبر ثم في نماذج طعم أجنبي في الجسم الحي. تم استخدا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
Hydrogen Peroxide	MP Biomedicals	#02194057	GHS05, GHS07, H302-H318
Sodium Orthovanadate	Sigma	#S6508	GHS07, H302+ H312+H332
2-Mercaptoethanol	Sigma	#M7522	GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410
ColonyGel Human Base Medium	ReachBio	#1101
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)	Sigma	#M5655	GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341
Difco Noble Agar	BD Biosciences	#214883
Nitrotetrazolium Blue Chloride	Sigma	#N6639	GHS07, H302
D-Luciferin Firefly, Potassium Salt	PerkinElmer	#122796
4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride	Sigma	#D9542
FITC CD45	BD Bioscience	#347463
FITC Mouse IgG1 Isotype control	BD Bioscience	#51-35404X-2
Gentamycin Sulfate	Sparhawk	#NDC58005-633-04
Protease Inhibitors	Roche	#11836153001
DNase	Sigma	#D4263
Protein G Beads	Invitrogen	#10-1242
Isofluran	VETONE	#NDC13985-030-60
			Equipment
Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm	Nunclon	#D7804-500EA
Cell culture dishes, diam. 100 mm x  H 20 mm	Nunclon	#D8429-1CS
6-well plates	BD Bioscience	#353046
14 gauge x 4 inch blunt-end needles	Cadence science	#7956
5 ml syringe with luer-lok	BD Bioscience	#309646
GelCount automated colony counter	Oxford Optronix
In vivo bioluminescence imaging system	PerkinElmer	#IVIS200
Scout pro portable balances, scale	Ohaus	#SP202
Broome style rodent restrainer	Plas-labs	#551-BSRR
Ear punch, punch diameter: 2 mm	FST	#24210-02
Chlorhexidine swabs, Prevantics	PDI	#B10800
Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2	Monoject	#8881500042
Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile	Instech	#FTP-20-38
1 mL Luer-Lok disposable syringe	BD Bioscience	#309628
Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle	BD Bioscience	#329465
Extra fine bonn scissors	FST	#14084-08
Student fine scissors	FST	#91460-11
Moria ultra fine forceps	FST	#11370-40
Extra fine graefe forceps	FST	#11150-10
Scalpel handle	FST	#10003-12
Scalpel blades	FST	#10011-00