الغزو الجرثومي المعوي الخلايا الظهارية المعوية<em&gt; في المختبر</em&gt; تتعزز بشكل كبير عن طريق دائرة إنتشار عمودي الموديل

Summary

أداء المقايسات ثقافة الخلية عن التحقيق في التصاق البكتيريا وغزو تحت الظروف الهوائية عادة ما يكون غير ممثل لل في الجسم الحي بيئة. A إنتشار نموذج غرفة العمودي يسمح دراسة التفاعلات بين العوامل المسببة للأمراض البشرية العطيفة الصائمية مع الخلايا الظهارية في الأمعاء تحت أكثر في الجسم الحي تشبه ظروف، مما أدى إلى تعزيز الغزو الجرثومي.

Abstract

وقد تم التحقيق في التفاعلات من مسببات الأمراض البكتيرية مع الخلايا المضيفة على نطاق واسع باستخدام طرق زراعة الخلايا في المختبر. ولكن كما يتم تنفيذ مثل هذه المقايسات ثقافة الخلية تحت الظروف الهوائية، وهذه نماذج في المختبر قد لا تمثل بدقة في بيئة الجسم الحي الذي تفاعلات المضيف الممرض تأخذ مكان. لقد قمنا بتطوير نموذج المختبر في العدوى التي تسمح للcoculture من البكتيريا والخلايا المضيفة في ظل ظروف مختلفة والغاز المتوسطة. الدائرة إنتشار عمودي (VDC) نموذج يحاكي ظروف في أمعاء الإنسان حيث البكتيريا سيكون تحت ظروف انخفاض الأكسجين جدا في حين سيتم تزويد الأنسجة بالأوكسجين من مجرى الدم. وضع الاستقطاب الخلية (IEC) الطبقات الوحيدة الظهارية في الأمعاء نمت في إدراج Snapwell إلى VDC يخلق مقصورات قمية وbasolateral منفصلة. يتم تعبئة مقصورة basolateral مع مستنبت الخلية، ومختومة مع perfused ث الأكسجينhilst المقصورة قمية يتم تعبئة مع مرق، تبقى مفتوحة وحضنت تحت ظروف microaerobic. يمكن الحفاظ على حد سواء كاتشو-2 و T84 IECS في VDC في ظل هذه الظروف من دون أي آثار ضارة واضحة على بقاء الخلية أو سلامة أحادي الطبقة. تجارب Coculturing يؤديها مع مختلف C. الصائمية السلالات البرية من نوع وخطوط IEC مختلفة في نموذج VDC مع ظروف microaerobic في المقصورة القمي يؤدي بتكاثر إلى زيادة في عدد التفاعل (ما يقرب من 10 أضعاف) وبين الخلايا (ما يقرب من 100 أضعاف) البكتيريا مقارنة مع الظروف الثقافة الهوائية ^1. البيئة التي تم إنشاؤها في نموذج VDC يحاكي بشكل وثيق على البيئة من خلال C. اجه الصائمية في أمعاء الإنسان، ويسلط الضوء على أهمية أداء في فحوصات المختبر تحت ظروف العدوى التي تحاكي بشكل وثيق في الواقع الجسم الحي. نقترح سوف أن استخدام نموذج VDC تسمح تفسيرات جديدة للتفاعلات الرهانوين مسببات الأمراض البكتيرية والخلايا المضيفة.

Introduction

وقد تم التحقيق في التفاعلات من مسببات الأمراض البكتيرية مع الخلايا المضيفة على نطاق واسع باستخدام طرق زراعة الخلايا في المختبر. استخدام مثل هذه المقايسات ثقافة الخلية، التصاق البكتيريا إلى الخلايا المضيفة، تحديد مستقبلات الخلية المضيفة، الخلية المضيفة مسارات إشارات والغزو الجرثومي للخلايا المضيفة كلها قد درس بالتفصيل، مما أدى في كثير من الملاحظات الهامة. ومع ذلك يتم تنفيذ مثل هذه المقايسات ثقافة الخلية تحت الظروف الهوائية التي قد لا تكون ممثلة للبيئة في الجسم الحي. وجود قيود كبيرة من نماذج في المختبر تستخدم لدراسة التهابات الجهاز الهضمي هو أن الظروف الثقافة بما في ذلك مستويات الاوكسجين عالية يفضلون عموما بقاء الخلية حقيقية النواة. لكن الظروف في لمعة الأمعاء سيكون اللاهوائية تقريبا. مسببات الأمراض المعوية في بيئة منخفضة الأوكسجين جدا التعبير عن الجينات الفوعة التي التعبير التغيرات في الظروف الهوائية ^2. على هذا النحو، الحصول على بيانات باستخدام معيار خلية ثقافة نماذج مAY تعطي مؤشرا غير دقيق من التفاعلات البكتيرية مع الخلايا المضيفة.

العطيفة الصائمية هو العامل المسبب الرئيسي لالتهاب المعدة والأمعاء الحاد الجرثومي في جميع أنحاء العالم، مع الأعراض التي تتراوح من إسهال خفيف إلى الأمعاء الالتهابية الحادة. غالبية C. الصائمية العدوى نتيجة في التهاب المعدة والأمعاء غير معقدة، لكن C. الصائمية هو أيضا وكيل المعدية الأكثر شيوعا التي تم تحديدها في اعتلال الأعصاب المحيطية بما في ذلك متلازمة غيان باريه (GBS). في المملكة المتحدة، تشير التقديرات إلى أن هناك أكثر من 500،000 حالة من حالات التهاب الأمعاء الناجم عن C. عدوى الصائمية كل عام بتكلفة يتوقع أن اقتصاد المملكة المتحدة من 580 مليون جنيه إسترليني. في العالم النامي، C. الصائمية هو السبب الرئيسي للوفيات بين الأطفال. وعلى الرغم من الأهمية التي لا جدال من عدوى العطيفة وعقود من البحث، بما في ذلك التحليل القائم على علم الجينوم شامل، C. الصائمية المرضية لا تزال تفهم سيئةالعود، وعلى النقيض من مسببات الأمراض المعوية الأخرى مثل السالمونيلا، كولاي، الشغيلة، وضمة الكوليرا. عدم وجود نموذج حيواني صغيرة مريحة هو أحد الأسباب الرئيسية لهذا ^3. كما تستخدم على نطاق واسع في نماذج العدوى المختبر هي أكثر مناسبة لدراسة microaerophilic C. الصائمية من مسببات الأمراض المعوية عن الأخرى التي هي اللاهوائيات اختياري. في حين C. ومن المسلم به الصائمية كأحد العوامل الممرضة الغازية، وآليات C. غزو ​​الصائمية من الخلايا الظهارية في الأمعاء (IECS) لا تزال غير واضحة ^4،5. C. وقد تبين غزو الصائمية أن تعتمد على إما microfilaments، الأنابيب الدقيقة، مزيج من الاثنين معا أو لا ^5. اللبس في هذا المجال هو على الارجح بسبب استخدام غير مناسب في الظروف فحص المختبر.

وقد استخدمت عدد من مختلف المقايسات ثقافة الخلية للتحقيق في تفاعلات C. الصائميةمع الخلايا المضيفة. كاتشو-2 ^6، وكانت جميعها تستخدم INT 407 ^7، وT84 ⁸ خطوط الخلايا لدراسة التصاق وغزو قدرات مختلفة C. سلالات الصائمية. ومع ذلك، فإن مستويات التصاق البكتيريا وغزو لC. الصائمية مع IECS هي أقل بشكل كبير من مسببات الأمراض المعوية الأخرى ^ل9. وcoculturing من C. الصائمية مع IECS يتم تنفيذ عادة في حاضنة CO ₂ في ظل ظروف قريبة من مستويات الأوكسجين في الغلاف الجوي، اللازمة لبقاء IECS. C. سوف الصائمية التعبير الجيني تكون مختلفة جدا في بيئة منخفضة الأوكسجين من تجويف الأمعاء بالمقارنة مع ظروف الأوكسجين في الغلاف الجوي.

وقد تم تطوير استخدام غرفة (VDC) نظام إنتشار عمودي الذي يسمح coculture من البكتيريا والخلايا المضيفة في ظل ظروف الغاز ^1،10،11 مختلف المتوسطة و. هذا النظام يحاكي ظروف في أمعاء الإنسان حيث البكتيريا ستكون الأمم المتحدةوسيتم تزويد ظروف دير منخفض جدا من الأوكسجين، بينما الأنسجة مع الأوكسجين من مجرى الدم. وضعت الطبقات الوحيدة IEC الاستقطاب نمت في الخاص 0.4 ميكرون مرشحات في VDC خلق مقصورة قمية وbasolateral، التي امتلأت بشكل فردي مع مرق البكتيرية والخلية مستنبت على التوالي (الشكل 1). وضعت VDC في الجو المتغير الحاضنة تحتوي على 85٪ N _2، 5٪ O _2، و 10٪ CO ₂ عند 37 درجة مئوية، وهو ما يمثل الظروف المثلى لC. الصائمية. وقد غادر مقصورة قمية مفتوحة ومعرضة للجو microaerobic داخل الغلاف الجوي حاضنة متغير، في حين أن المقصورة basolateral مختومة تم توفيرها مع الأوكسجين من قبل الإدارة المستمر لل5٪ CO _2/95٪ O ₂ خليط الغاز مع أنبوب منفذ منع تراكم الضغط . وتأكدت كاتشو-2 بقاء الخلية وسلامة أحادي الطبقة في ظل هذه الظروف من خلال رصد ايلى بطريق الظهارةالمقاومة ctrical (طير) عبر أحادي الطبقة أكثر من 24 ساعة لإثبات بقاء كاتشو-2 أحادي الطبقة الخلية الجسدية والفصل بين المقصورات قمية وbasolateral في ظل ظروف انخفاض الأكسجين في مقصورة القمي. أظهرت طير من الطبقات الوحيدة في لجان التنمية القروية المحافظة في الغلاف الجوي حاضنة متغير (شروط microaerobic) وفي ثقافة الخلية القياسية CO ₂ الحاضنة (الظروف الهوائية) توجد فروق ذات دلالة، مما يدل على سلامة أحادي الطبقة الخلية تحت الظروف الجوية المختلفة ^1. في ظل ظروف microaerobic، ظلت منعطفات ضيقة الحاضر وزعت بالتساوي بين حدود الخلية ونمط تلطيخ occludin مماثلة لخلايا حافظت تحت الظروف الهوائية ^1.

تفاعلات C. الصائمية مع كاتشو-2 و T84 الخلايا في VDC تم التحقيق من خلال تقييم التفاعل البكتيري (التصاق والغزو) والغزو. اثنين C. مختلفة الصائمية البرية من نوع straiواستخدمت NS ^1. C. الصائمية 11168H هو مشتق مفرط التحرك من سلالة تسلسل الأصلي NCTC11168. يظهر سلالة 11168H مستويات أعلى بكثير الاستعمار في نموذج الاستعمار كتكوت وبالتالي تعتبر سلالة مناسبة للاستخدام للدراسات التفاعل المضيف الممرض. 81-176 هو الإنسان وعزل هي واحدة من سلالات مختبر درس على نطاق واسع معظم الغازية. C. أضيفت سلالات الصائمية إلى المقصورة قمية من VDC تحت أي ظروف microaerobic أو الهوائية. لاحظنا سجلت معدلات أعلى لكلا التفاعل وغزو لC. الصائمية في ظل ظروف microaerobic ^1. زيادة C. كانت التفاعلات الصائمية لا يرجع إلى زيادة في أعداد البكتيريا في ظل ظروف microaerobic ^1. تدعم هذه البيانات فرضيتنا بأن البيئة منخفضة الأوكسجين في مقصورة قمية من VDC يعزز التفاعلات البكتيريا المضيفة ويشير إلى أن خصائص الغازية من C. الصائمية هي incrخفت في ظل هذه الظروف. كان هذا هو التقرير الأول عن استخدام نموذج VDC لدراسة العوامل المسببة للأمراض البكتيرية الغازية ويسلط الضوء على أهمية أداء في فحوصات المختبر تحت ظروف العدوى التي تحاكي بشكل وثيق الوضع في الجسم الحي. نموذج VDC يمكن أن تستخدم لدراسة التفاعلات المضيف الممرض للعديد من الأنواع البكتيرية المختلفة.

Protocol

1. نمو الطبقات الوحيدة IEC على الخاص 0.4 ميكرون مرشحات

1. ثقافة كاتشو-2 الخلايا في وسائل الإعلام ضروري تعديل Dulbecco ل(DMEM) تستكمل مع 10٪ (V / V) مصل العجل الجنين، و 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، و 1٪ (V / V) الأحماض الأمينية غير الأساسية في الأنسجة مستوى ثقافة حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ و 95٪ هواء. البذور 4 × 10 ⁵ كاتشو-2 IECS في 0.4 ميكرون فلتر وتنمو لاستقطاب أكثر من 21 أيام، وتغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام.
2. قياس طير لتأكيد حالة استقطاب أحادي الطبقة باستخدام المقاومة فولت أوم متر. في دراساتنا، وطير من 21 يوم كاتشو-2 الخلايا المزروعة في هذه الفلاتر ميكرون 0.4 هو 700-800 Ωcm ^2.

2. إعداد C. الصائمية ومتوسطة الجرثومي للمقايسة Coculturing

1. 24 ساعة قبل المرجوة نقطة انطلاق للمقايسة coculturing VDC، وإعداد طازجة لوحة آغار الدم من C. الصائمية واحتضان عند 37 درجة مئوية تحت ظروف microaerobic (85٪ N _2، 5٪ O _2، و 10٪ CO ₂₎ في الغلاف الجوي حاضنة متغير.
2. في نفس الوقت، يحضن مسبقا 30 مل من مرق البروسيلا عند 37 درجة مئوية تحت ظروف microaerobic في جو الحاضنة متغير.

3. إعداد والتعقيم من نصف الدوائر VDC قبل الفحص

1. تزج تماما نصف الدوائر VDC فضلا عن O-الخواتم والمقابس في حل التعقيم.
2. استخدام معقم 20 مل حقنة، تدفق الحل التعقيم من خلال مداخل الغاز في كلا المجلسين نصف. قد يؤدي عدم القيام بذلك يؤدي إلى تلوث العينات خلال coculturing.
3. ترك كل مكونات مغمورة في محلول التعقيم ل> 1 ساعة.
4. شطف جميع المكونات مع الماء المعقم الطازجة، وذلك باستخدام آخر معقم 20 مل حقنة لطرد مداخل الغاز.

4. إعدادمن اللقاح البكتيري

1. حصاد نصف طبق من C. أعدت نمو الصائمية من لوحة آغار الدم في اليوم السابق إلى 1 مل من مرق البروسيلا preincubated. هذا ينبغي أن تسفر ~ 10 ¹⁰ وت م / مل.
2. قياس الكثافة البصرية للتعليق البكتيرية في 600 نانومتر إلى semiquantify مستعمرة بكتيرية (CFUs).
3. ضبط تعليق البكتيرية إلى المستوى المطلوب اللقاح في 4 مل من مرق البروسيلا preincubated.
4. إجراء التخفيف المتسلسل من هذا تعليق البكتيرية النهائي تليها الطلاء من التخفيفات المناسبة على لوحات أجار الدم في ثلاث نسخ، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية في جو الحاضنة متغير لمدة 48 ساعة لقياس عدد من CFUs البكتيرية الموجودة في اللقاح.

5. إعداد VDC

1. وضع النصف السفلي غرفة شقة VDC على مقاعد البدلاء. يصلح يا الدائري على نصف الدائرة السفلي.
2. فصل مرشح واحد يحمل IECS من tانه الناقل ويغسل ثلاث مرات مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة. وضع مرشح على نصف مجلس النواب، والتأكد من يبقى يا الدائري في المكان.
3. خفض بلطف النصف الغرفة العليا في مكانها. وحالما يتم تجميعها لمدة نصف الدوائر، المشبك معا باستخدام المشابك حلقة. وضع VDC أفقيا على أعلى مقاعد البدلاء، مع اثنين من فتحات متجهة لأعلى.
4. إضافة مل 4 من اللقاح البكتيري في نصف الدائرة القمي.
5. إضافة 4 مل من مستنبت الخلية من بداية الشوط غرفة basolateral.
6. ضع القطع في نهاية فتحات في كلا المجلسين نصف.

6. ربط VDC إلى مشعب الغاز داخل حاضنة الجو متغير

1. وضع VDC في الغلاف الجوي حاضنة متغير على مقربة من مشعب الغاز.
2. فتح منظم امدادات الغاز متصلا مشعب الغاز. نعلق الأنبوب من مشعب في مدخل الغاز على نصف غرفة basolateral من VDC. إرفاق GAق الأنابيب منفذ المؤدية للخروج من متغير جو الحاضنة إلى واحدة من منافذ في قطعة وتنتهي في نصف غرفة basolateral.
3. إغلاق منفذ الأخرى في قطعة وتنتهي في نصف غرفة basolateral. فتح تدفق الغاز في مشعب الغاز، مع الحرص على فتحه ببطء شديد لتجنب ضغط الغاز الزائد، وهذا يمكن أن يؤدي إلى طرد المتوسطة basolateral.
4. والهدف هو تدفق الغاز من 1 فقاعة كل 2-5 ثوانى. دوري اطمئنان على تدفق الغاز خلال التجربة وتعديل إذا لزم الأمر.

7. تفكيك VDC بعد Coculture

1. بعد فترة coculture المناسبة، إغلاق منظم امدادات الغاز متصلا مشعب الغاز. إغلاق تدفق الغاز في VDC في مشعب. فصل مدخل الغاز، ومنفذ الغاز وسدادة من VDC.
2. إزالة VDC من جو الحاضنة متغير. إزالة supernatants قمية وbasolateral وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة subsequenتحليل ر.
3. إزالة المشابك خاتم واتخاذ بلطف بعيدا عن VDC. إزالة عامل التصفية من نصف الدائرة ونقل إلى 6 جيدا طبق خلية ثقافة عقيمة. غسل IECS ثلاث مرات مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة.
4. لتعداد العدد الكلي للبكتيريا التفاعل، إضافة 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على 0.1٪ (V / V) تريتون X-100 إلى IECS واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لليز IEC. إجراء التخفيف المتسلسل من هذه الخلايا المحللة تليها الطلاء من التخفيفات المناسبة على لوحات أجار الدم في ثلاث نسخ، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية في جو الحاضنة متغير لمدة 48 ساعة لقياس عدد من التفاعل CFUs البكتيرية.
5. لتعداد العدد الكلي للبكتيريا الغازية، إضافة 400 ميكرولتر من DMEM خلية ثقافة المتوسط ​​تحتوي على 150 ميكروغرام / مل جنتاميسين إلى IECS واحتضان لمدة 2 ساعة في نسيج الثقافة حاضنة قياسية بلغت 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ و 95٪ الهواء لقتل البكتيريا خارج الخلية،ثم اتبع أما الخطوة 7.4 أعلاه.

8. تنظيف VDC بعد Coculture

غسل VDC مع الماء المعقم ومخزن للجولة المقبلة من التجارب.

النتائج

تجارب Coculturing يؤديها مع C. وقد أثبتت الصائمية البرية من نوع السلالة وIECS في نموذج VDC مع ظروف microaerobic في المقصورة القمي زيادة في عدد من التفاعل (ما يقرب من 10 أضعاف) وبين الخلايا (ما يقرب من 100 أضعاف) البكتيريا مقارنة مع الظروف الثقافة الهوائية في وقت واحد تعتمد الطر?...

Discussion

استخدام في طرق زراعة الخلايا في المختبر لدراسة التفاعلات من مسببات الأمراض البكتيرية مع الخلايا المضيفة هي تقنية تستخدم على نطاق واسع في العديد من المختبرات البحثية. ولكن كما يتم تنفيذ مثل هذه المقايسات ثقافة الخلية تحت الظروف الهوائية، وهذه نماذج في ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts	Harvard Apparatus	66-0001	Manifold & six Snapwell chambers
Caps	Harvard Apparatus	66-0020
O-rings	Harvard Apparatus	66-0007
Clamps	Harvard Apparatus	66-0012
Snapwell filters (pore size 0.4 μm)	Corning Costar	3407
Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter	Millipore	MERS00002
WPA Lightwave II spectrophotometer	Biochrom	80-3003-72