JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة في البروتوكول الموقع التهجين الأمثل للكشف colormetric التعبير الرنا الميكروي في الفورمالين أقسام الكلى ثابتة.

Abstract

في هذه المادة ونحن تصف طريقة للكشف اللونية من ميرنا في الكلى من خلال الموقع التهجين مع digoxigenin في المفتاحية تحقيقات الرنا الميكروي. هذا البروتوكول، وضعت أصلا من قبل Kloosterman وزملاؤه للاستخدام واسع النطاق مع تحقيقات Exiqon ميرنا 1، تم تعديل للتغلب على التحديات الكامنة في تحليل ميرنا في أنسجة الكلى. وتشمل هذه القضايا مثل تحديد هيكل والصعب إزالة التحقيق المتبقية والأجسام المضادة. استخدام رقيقة نسبيا، 5 مم، أقسام الأنسجة يسمح لتصور واضح لهياكل الكلى، في حين تم الإبقاء على إشارة قوية التحقيق في الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، تم تحسين ظروف الاعتقال والتحقيق الحضانة لتسهيل التصور والتعبير microRNA مع انخفاض الخلفية وإشارة غير محددة. هنا، يتم وصف بروتوكول الأمثل، الذي يغطي مجموعة الأنسجة الأولية وإعداد من خلال تركيب الشرائح في نهاية الإجراء. وcompone الأساسيةاليلة من هذا البروتوكول يمكن تغييرها لتطبيقها على الأنسجة الأخرى ونماذج ثقافة الخلية.

Introduction

الرنا الميكروي صغيرة (حوالي 22 النيوكليوتيدات طويلة) غير المكودة الرنا التي يتم إنتاجها التطور الطبيعي. أنها تعمل عادة لقمع بروتين تعبير من خلال القمع متعدية أو تدهور مرنا. miRNAs ربط لأهداف مرنا مع التكامل غير مكتملة، مما يجعل من الممكن لميرنا واحدة لقمع أهداف متعددة.

فهم أي نوع من أنواع الخلايا والهياكل التعبير miRNAs هو جزء مهم من فهم الآليات التي من خلالها تغيرات في الخلية ميرنا التعبير وتأثير الظواهر الأنسجة. حين طرق مثل ميرنا التسلسل، QPCR والنشاف الشمالية يمكن استخدامها للكشف لل miRNAs في الأنسجة كله، لا يسمح هذا النهج واحد لتحديد أي نوع من الخلايا المحددة التي جاءت من داخل نسيج معين. تشريح المكونات الخلوية والهيكلية قبل التحليل باستخدام هذه الأساليب يمكن أن يكون صعبا للغاية والظروف اللازمة لتحقيق العزلة الكافية يمكن أن تؤدي إلى alterations في التعبير الجيني أو تدهور الرنا. الرنا الميكروي في الموقع التهجين هي الطريقة المستخدمة لتصور موقع الرنا الميكروي ومستويات التعبير في الأنسجة. هذا الأسلوب هو قيمة خاصة في الأنسجة تتكون من هياكل غير المتجانسة، مثل الكلى.

وقد ثبت MicroRNAs للعب دور تنظيمي في 2،3 التنمية الكلى ووظائف الأعضاء 4. كما تبين التعديلات التعبير microRNA أن تشارك مع أمراض الكلى مثل التليف 5-10، اعتلال الكلية السكري 7، سرطان الكلى 11،12، وإصابة الكلى الحاد 13. في بحثنا، وجدنا أن تحسين الرنا الميكروي الموقع التهجين للأنسجة الكلى في كان قيمة لتحديد المواقع الهيكلية الدقيق ميرنا التعبير في كل من الصحة والمرض 14. تحديد التعبير أنبوبي والخلوية من microRNAs مختلفة أمر مهم لأن تنظيمها من تاقد يكون rgets تعتمد على الوظائف الخلوية. في الدول المريضة من المهم أيضا لتحديد كيفية إحداث تغييرات في التعبير ميرنا قد تؤثر على وظيفة.

وكان الهدف من الطريقة الموصوفة هنا للبناء على منهجيات ISH القائمة التي وضعتها Kloosterman آخرون 15، 16،17 المحققين الآخرين، وتلك التي اقترحتها Exiqon 1 و تحسين طريقة لأنسجة الكلى الفورمالين الثابتة. وقد استخدمنا بنجاح هذا الأسلوب لتحديد الاختلافات الإقليمية المتميزة في الكلى التعبير الرنا الميكروي مير-382 مع جانب واحد انسداد الحالب 18. ويمكن استخدام هذا النهج مع الأنسجة الأخرى كذلك، مع التحسين إضافية.

Protocol

1. أقسام الكلى الأنسجة

  1. يتم قطع الثابتة الفورمالين (10٪) أقسام الكلى جزءا لا يتجزأ من البارافين على شرائح المجهر في سمك 5 ملم باستخدام ميكرومولار HM 355 S. ويمكن تخزين الشرائح لعدة أشهر قبل التحليل.

2. إعداد الحل

  1. تحضير 1 لتر من برنامج تلفزيوني 1X في DDH 2 O في أعلى زجاجة المسمار autoclavable. ملء زجاجة أخرى مع 1 لتر من DDH 2 O. إضافة 1 مل من DEPC إلى كل زجاجة، وغطاء ويهز بقوة. السماح للحلول الجلوس بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لتدمير RNAses ثم الأوتوكلاف. إضافة 400 مل توين-L 20-1 من برنامج تلفزيوني 1X لجعل PBS-T.
  2. إعداد بروتين K العازلة (50 mMTris، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 و 1 مم CaCl 2 في DEPC المياه المعالجة).
  3. تحضير محلول 0.2٪ الجلايسين في برنامج تلفزيوني-T.

3. إعداد الأنسجة

  1. إعداد كمية كبيرة من العازلة التهجين (50-100 مل) تتألف من 50٪ الفورماميد، 5X SSC، 0.1٪ توين، 9.2ملي حامض الستريك لتعديل درجة الحموضة إلى 6، 50 ميكروغرام / مل الهيبارين، و 500 ميكروغرام / مل الحمض النووي الريبي الخميرة في DEPC معاملة ده 2 O. تقسم إلى 1 مل مأخوذة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  2. إزالة البارافين من الأنسجة عن طريق غسل 3X في الزيلين الطازجة لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  3. ترطيب أقسام الأنسجة بنسبة 5 دقيقة حضانات في خفض تركيزات الإيثانول (100٪، 75٪، 50٪، و 25٪) في DDH 2 O.
  4. علاج الشرائح مع ما يكفي من DEPC لتغطية كامل أقسام الأنسجة (حوالي 0.4-0.5 مل) لمدة 1 دقيقة. جعل متأكد من الأنسجة لا تجف.
  5. شطف الشرائح في DEPC معاملة PBS-T مرتين لمدة 5 دقائق، وجمع النفايات المحتوية DEPC للتخلص السليم. جميع الكواشف يجب DEPC المعالجة للقضاء على RNAses من هذه النقطة.
  6. Prewarm بروتين K العازلة وإضافة بروتين K إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل. تغطية أقسام الأنسجة مع الحل K بروتين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. بسرعة إزالة proteinasه K الحل وإضافة 0.2٪ الجلايسين في برنامج تلفزيوني-T لمدة 30 ثانية.
  8. شطف الشرائح في DEPC معاملة PBS-T مرتين لمدة 30 ثانية لكل منهما.
  9. إصلاح المقاطع في تقدم طازجة بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة.

4. تهجين

  1. إضافة 50 ميكرولتر من العازلة التهجين (50٪ الفورماميد، 5X SSC، 0.1٪ توين، 9.2 ملي حمض الستريك لتعديل درجة الحموضة إلى 6، 50 ميكروغرام / مل الهيبارين، 500 ميكروغرام / مل الحمض النووي الريبي الخميرة) في قسم الأنسجة، وتغطي مع ريبونوكلياز HybriSlips مجانا مجرد قطع أكبر من أقسام الأنسجة.
  2. أقسام Prehybridize في الرطوبة تسيطر فرن التهجين لمدة 2 ساعة في درجة حرارة التهجين يحدد ل 'التحقيق 3 المسمى digoxigenin (عادة الحمض النووي تيم لجنة التحقيق -21 ° C، (أي 54 درجة مئوية لمدة مير 382، تحقيق DNA تيم = 75 ° C )، وذلك باستخدام مناديل مختبر الأنسجة غارقة في 50٪ formamide/50٪ 5X SSC للحفاظ على ترطيب الغرفة.
  3. تمييع التحقيق ميرنا، والسيطرة الايجابية (U6، RNA النووية الصغيرة) والسيطرة السلبية (تدافعتتسلسل) إلى 40 نانومتر في المنطقة العازلة التهجين (75 ميكرولتر من العازلة هو مطلوب في القسم).
  4. تسخين التحقيق في المخزن التهجين عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. إزالة الشرائح من الفرن التهجين وإزالة coverslips والعازلة التهجين الزائدة من prehybridization.
  6. إضافة 75 ميكرولتر من العازلة التي تحتوي على التحقيق في قسم الأنسجة، مباشرة إلى الأنسجة. تغطية الأنسجة مع HybriSlips فقط كبيرة بما يكفي لتغطية أقسام الأنسجة.
  7. حفظ الشريحة مستوى حامل، والعودة إلى الفرن التهجين للحضانة بين عشية وضحاها في درجة حرارة من الخطوة 4.2 (حوالي 16 ساعة).

5. التشدد غسل

  1. إضافة 200 ميكرولتر 2X SSC، تسخينها إلى درجة حرارة التهجين، فقط تحت حافة واحدة لل coverslips للمساعدة في الافراج ساترة من الأنسجة. إزالة ساترة عن طريق إمالة الشريحة.
  2. تغسل الشرائح في 200 ميكرولتر من 50٪ الفورماميد، 50٪ 2X SSC في التهجين 3X درجة الحرارة لمدة 30 دقيقة لكل منهما.
  3. شطفالشرائح في برنامج تلفزيوني 5X-T في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق كل يوم شاكر المداري على سرعة منخفضة.

6. كشف

  1. احتضان الشرائح في عرقلة العازلة (2٪ الماعز أو مصل الحصان، 2 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني BSA-T) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري على سرعة منخفضة.
  2. تمييع شظايا مكافحة DIG-AP فاب في عرقلة العازلة في 1:100. إضافة 100 ميكرولتر في قسم الأنسجة، وتغطي مع HybriSlips مجرد قطع كبيرة بما يكفي لتغطية هذا الباب.
  3. احتضان الضد في غرفة ترطيب عند 4 درجات مئوية خلال الليل (حوالي 16 ساعة).
  4. تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني-T 7X، لمدة 5 دقائق كل يوم شاكر المداري على سرعة منخفضة.
  5. تغسل الشرائح العازلة في AP (100 ملي TrisHCl درجة الحموضة 9.5 و 50 ملي MgCl 2، 100MM كلوريد الصوديوم، 0.1٪ توين 20) 3X، لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  6. إضافة الحل NBT / BCIP إلى عازلة AP (200 μl/10 العازلة مل)
  7. إضافة 400-500 مل من المخفف حل NBT / BCIP إلى كل شريحة لتغطية كامل جميع أقسام الأنسجة. تطوير في الظلام، ومستوى، humidifغرفة العبوات الناسفة لمدة 4-5 ساعة.

7. تصاعد الشرائح

  1. يذوى المقاطع في زيادة تركيزات الإيثانول (25٪، 50٪، 75٪، 100٪) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  2. احتضان في 5X الزيلين من أجل مسح المقاطع.
  3. جبل الشرائح في Permount تصاعد المتوسطة وبين عشية وضحاها الجافة.

النتائج

مجالات قسم الأنسجة التي تصبح جفت خلال التهجين، حضانات أو غسل الخطوات عموما في نهاية المطاف أكثر تلطيخ بحزن خلال تطوير NBT / BCIP. الشكل 1 يبين جزء من قسم الكلى الذي تراجع HybriSlip الخروج من حافة الأنسجة، والسماح لها لتصبح المجففة جزئيا. على الرغم الإماهة والتغطية في ...

Discussion

كان الهدف من هذه المقالة لوصف بروتوكول لميرنا التهجين في الموقع الذي يعمل بشكل جيد في أنسجة الكلى الفورمالين الثابتة. بينما كان يعمل خارج هذا البروتوكول وقد تم تحديد العديد من المصادر المهمة للقطعة أثرية تلطيخ. يمكن الاهتمام الدقيق لهذه النقاط تساعد على تجنب تل...

Disclosures

ليس هناك شيء في الكشف عنها.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأميركية للصحة منح HL082798 HL111580 و.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ParaformaldehydeSigmaP6148
PBSGibco70011044
Diethyl PyrocarbonateSigmaD5758
Tween-20SigmaP1379
XylenesSigma534056
EthanolUltra Pure200CSPTP
Tris-HClLife Technologies15506-017
CaCl2SigmaC2536
GlycineJ.T. Baker4059-00
Citric AcidSigmaC2404
FormamideSigmaF9037
20x SSC BufferLife Technologies15557-044
HeparinSAGENT25021-400-30
Yeast RNALife TechnologiesAM7118
MgCl2SigmaM8266-1004
NaClJ.T. Baker4058-01
Proteinase KFermentasEO0491
3’ DIG- miRNA probeExiqonmiR dependent-05
3’ DIG- Scrambled miR probeExiqon99004-05
3’ DIG- U6 miR probeExiqon99002-05
Anti-Digoxigenin-Ab FabRoche11093274910
NBT/BCIPRoche11681451001
PermountFisherSP15-500
CoverslipsFisherFit to tissue size
Microtom HM 355 SThermo Scientific23-900-672
In-slide Out Hybridization OvenBoekel241000
Aluminum Tray AssemblyBoekelC2403973
Stainless Steel Rack InsertBoekelC2403754

References

  1. Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
  2. Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
  3. Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
  4. Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
  5. Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
  6. Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
  7. Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
  8. Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
  9. Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
  10. Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
  11. Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
  12. Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
  13. Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
  14. Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
  15. Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
  16. Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
  17. Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

81

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved