JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هو عرض وجهاز الاستشعار البيولوجي البصرية خالية من التسمية للكشف عن البكتيريا السريع. يستند جهاز الاستشعار البيولوجي على سي مسامية ذات البنية النانومترية، الذي تم تصميمه لالتقاط مباشرة الخلايا البكتيريا المستهدفة على سطحه. نستخدم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، يجمد على محول التي يسهل اختراقها، وتحقيقات الالتقاط. وتبين الدراسات لدينا انطباق هذه أجهزة الاستشعار للكشف عن تركيزات منخفضة البكتيرية في غضون دقائق مع عدم وجود تجهيز العينات قبل (مثل تحلل الخلية).

Abstract

تم تصميم جهاز الاستشعار البيولوجي البصرية خالية من التسمية على أساس المسامية ذات البنية النانومترية سي لالتقاط السريع والكشف عن البكتيريا القولونية K12، والكائنات الحية الدقيقة الطراز. يعتمد جهاز الاستشعار البيولوجي على الربط المباشر للخلايا البكتيريا المستهدفة على سطحه، في حين لم يكن يحتاج إلى المعالجة (مثلا عن طريق تحلل الخلية) من العينة التي شملتها الدراسة. ويستخدم سي رقيقة mesoporous كعنصر محول البصري للجهاز الاستشعار البيولوجي. تحت الضوء إضاءة بيضاء، يعرض طبقة مسامية حلها جيدا أنماط هامش فابري بيرو في الطيف انعكاسية لها. تطبيق تحويل فورييه السريع (الاتحاد الفرنسي للتنس) إلى نتائج البيانات الانعكاسية في ذروة واحدة. ويتم رصد التغيرات في كثافة الذروة الاتحاد الفرنسي للتنس. وبالتالي، والتقاط البكتيريا المستهدفة على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي، من خلال التفاعلات مستضد الضد، يؤدي الى تغييرات قابلة للقياس في شدة قمم الاتحاد الفرنسي للتنس، والسماح ل"الوقت الحقيقي" مراقبة المرفق البكتيريا. الإقليم الشمالي "> الفيلم سي mesoporous، ملفقة من قبل عملية طلى بأكسيد الألومنيوم الكهروكيميائية، ومترافق مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ومحددة للبكتيريا المستهدفة. وأكد الشلل، immunoactivity وخصوصية الأجسام المضادة من خلال التجارب وضع العلامات الفلورية. مرة واحدة يتعرض لها جهاز الاستشعار البيولوجي لل البكتيريا المستهدفة، ويتم التقاط الخلايا مباشرة على مسامية السطح سي تعديل الأجسام المضادة، وهذه الأحداث التقاط محددة تؤدي إلى تغيرات كثافة في الأغشية الرقيقة التدخل البصرية الطيف من جهاز الاستشعار البيولوجي. علينا أن نظهر أن هذه أجهزة الاستشعار يمكن الكشف عن البكتيريا تركيزات منخفضة نسبيا (كشف الحد من 10 4 خلية / مل) في أقل من ساعة.

Introduction

الكشف المبكر والدقيق للالبكتيريا المسببة للأمراض من المهم للغاية لسلامة الأغذية والمياه، والرصد البيئي، ونقطة من الرعاية التشخيص 1. عن تقنيات علم الأحياء المجهرية التقليدية هي مضيعة للوقت، شاقة، وتفتقر إلى القدرة على الكشف عن الكائنات الحية الدقيقة في "الوقت الحقيقي" أو خارج بيئة معملية، أجهزة الاستشعار تتطور لمواجهة هذه التحديات 2-5.

في السنوات الأخيرة، التي يسهل اختراقها سي (PSI) برز كمنصة اعدة لتصميم أجهزة الاستشعار وأجهزة الاستشعار 6-20. على مدى العقد الماضي ونشرت العديد من الدراسات حول أجهزة الاستشعار وأجهزة الاستشعار البصرية القائمة على المبادرة 21،22. ملفقة طبقة ذات البنية النانومترية PSI عادة عن طريق الكهروكيميائية النقش انوديك من واحدة من الكريستال رقاقة سيليكون. المواد النانوية الناتجة PSI يحمل العديد من الخصائص من المفيد، مثل سطح كبير وحجم الحرة، المسام الأحجام التي يمكن السيطرة عليها والانضباطي الأمثلخصائص كال 10،16. الخصائص البصرية للطبقة PSI، مثل معان ضوئي 8،11 والضوء الأبيض القائم على الانعكاس التداخل 7،19، تتأثر بشدة الظروف البيئية. القبض على ضيف التحاليل الجزيئات / الهدف ضمن نتائج طبقة مسامية في تغيير في متوسط ​​معامل الانكسار من الفيلم، يحتفل به بوصفه التشكيل في الطيف معان ضوئي أو تحولا في الطيف الموجي انعكاسية 10.

على الرغم من أن الابتكار واسعة في PSI التكنولوجيا biosensor البصرية، لا يوجد سوى عدد قليل من التقارير على منصات القائم على المبادرة للبكتيريا الكشف 6،8،20،23-29. بالإضافة إلى ذلك، فإن معظم هذه الدراسات إثبات صحة مفهوم أثبتت "غير المباشرة" الكشف عن البكتيريا. وبالتالي، هناك حاجة تحلل قبل عام من الخلايا لاستخراج شظايا بروتين / الحمض النووي المستهدف، سمة للبكتيريا درس 29. نهجنا هو الاستيلاء على البكتيريا المستهدفة مباشرةالخلايا على جهاز الاستشعار البيولوجي PSI. لذلك، يتم يجمد الاجسام المضادة، والتي هي محددة لاستهداف البكتيريا، على سطح مسامية. ملزمة للخلايا البكتيريا، عبر تفاعلات الضد مستضد، على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي تحدث تغييرات في السعة (كثافة) من الطيف الانعكاسية 24-26.

في هذا العمل، ونحن التقرير على بناء وجهاز الاستشعار البيولوجي القائم على المبادرة البصرية وإظهار تطبيقه كمنصة biosensing خالية من التسمية للكشف عن الإشريكية القولونية (E. كولاي) K12 البكتيريا (تستخدم الكائنات الحية الدقيقة نموذج)، ورصد الإشارات الضوئية هو الضوء الذي ينعكس من البنية النانوية PSI بسبب فابري بيرو التدخل رقيقة (الشكل 1A). ترتبط التغييرات في ضوء السعة / كثافة لتجميد محددة من خلايا البكتيريا المستهدفة على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي، مما يسمح للكشف السريع وتقدير من البكتيريا.

Protocol

1. إعداد المؤكسدة المسامية شافي 2

  1. رقائق حفر سي (جانب واحد مصقول على <100> الوجه ومخدر بشكل كبير، ف نوع، 0.0008 Ω · سم) في 03:01 (ت / ت) حل HF مائي والإيثانول المطلق لمدة 30 ثانية في تيار مستمر الكثافة من 385 مللي أمبير / سم 2. يرجى ملاحظة أن HF هو سائل ضارة للغاية، وأنه ينبغي التعامل معها بعناية فائقة.
  2. شطف السطح من مسامية سي (PSI) الفيلم الناتج مع الايثانول المطلق عدة مرات؛ تجف الأفلام تحت غاز النيتروجين الجاف.
  3. أكسدة العينات PSI محفورا طازجة في فرن أنبوب في 800 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في الهواء المحيط (وضع العينة في الفرن في درجة حرارة الغرفة، حرارة الفرن إلى 800 درجة مئوية، ويترك في الفرن لمدة 1 ساعة، وإيقاف فرن وإزالة عينات من الفرن في درجة حرارة الغرفة فقط).

2. Biofunctionalization من PSiO 2 السقالات

  1. احتضان لبسي المؤكسد (PSIO 2) عينة لمدة 1 ساعة في mercaptopropyl (trimethoxysilane-3) 95٪ (MPTS) حل (108 ملي في التولوين).
  2. شطف PSiO 2 عينة المعالجة سيلاني مع التولوين، والميثانول، والأسيتون؛ الجافة تحت غاز النيتروجين الجاف.
  3. احتضان PSiO 2 عينة تعديل سيلاني لمدة 30 دقيقة في 1 مل من 100 ملي PEO-iodoacetyl حل البيوتين.
  4. شطف PSiO 2 عينة تعامل مع البيوتين 0.1 M الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل عدة مرات.
  5. احتضان PSiO 2 عينة تعديل البيوتين لمدة 30 دقيقة في 1 مل من 100 ميكروغرام / مل streptavidin (SA) حل.
  6. شطف SA المعاملة PSiO 2 عينة مع 0.1 M PBS الحل عدة مرات.
  7. احتضان SA-تعديل PSiO 2 عينة مما أدى لمدة 30 دقيقة في 1 مل من 100 ميكروغرام / مل البيروكسيديز E. القولونية وحيدة النسيلة الأجسام المضادة (الغلوبولين المناعي G، مفتش) حل أو مع 100 ميكروغرام / مل مفتش البيروكسيديز أرنب (كنموذج للالأجسام المضادة وحيدة النسيلة).

3. الفلورسنت وصفها ومضان المجهري

  1. احتضان السطوح تعديل مفتش مع 15 ميكروغرام / مل فلوريسئين (FITC) الموسومة المضادة أرنب مفتش لمدة 40 دقيقة ومع 15 ميكروغرام / مل فلوريسئين (FITC) الموسومة المضادة مفتش الماوس كمجموعة تحكم.
  2. شطف عينات تعديل مع 0.1 M PBS الحل عدة مرات.
  3. فحص العينات تحت المجهر مضان.

4. الثقافة البكتيريا

  1. زراعة E. البكتيريا القولونية K12 في أنبوب 10 مل مع 5 مل من لوريا BERTANI (LB) متوسطة (تكوين المتوسطة في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات: 5 غرام من كلوريد الصوديوم، 5 غرامات من خلاصة الخميرة، و 10 غرام من تريبتون). احتضان البكتيريا الهز بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. رصد تركيز البكتيريا من خلال قراءة الكثافة الضوئية (OD) في طول موجة من 600 نانومتر. بعد نمو بين عشية وضحاها في LB المتوسطة، وقراءة OD 600 باستخدام الطيف لتحديد تركيز البكتيريا. عدد الخلايا هو وخيمةctly النسبي للمقاييس OD 600 (1 OD 600 = 10 8 خلية / مل).

5. البكتيريا الاستشعار

  1. وضع PSiO تعديل مفتش-2 وأنيق PSiO 2 (كما في السيطرة) عينات في زنزانة تدفق زجاجي حسب الطلب. إصلاح الخلية التدفق لضمان أن يتم قياس العينة انعكاسية في نفس المكان خلال جميع القياسات.
  2. احتضان العينات مع E. القولونية K12 التعليق (10 4 خلية / مل) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم إزالة البكتيريا عن طريق التعليق بيغ الخلية مع 0.85٪ ث / ت محلول ملحي لمدة 30 دقيقة.
  3. رصد التغيرات في البيانات الانعكاسية في كافة مراحل التجربة. تحتاج جميع القياسات البصرية التي يتعين الاضطلاع بها في مائي المحيطة بها. وينبغي جمع الأطياف باستخدام مطياف CCD وتحليلها عن طريق تطبيق تحويل فورييه السريع (الاتحاد الفرنسي للتنس)، كما هو موضح سابقا 25،26.
  4. تأكد من وجود البكتيريا علىسطح جهاز الاستشعار البيولوجي، من خلال مراقبة العينات تحت المجهر ضوء تستقيم فورا بعد التجربة biosensing.

النتائج

وتعد المبادرة المؤكسد (PSiO 2) الأفلام كما هو موضح في المقطع نص البروتوكول. يبين الشكل 1B عالية الدقة مجهرية الإلكترون المسح من الناتج الفيلم PSI بعد الأكسدة الحرارية. وتتميز طبقة PSiO 2 بواسطة المسام أسطواني واضحة المعالم التي يبلغ قطرها في حدود 30-80 نان?...

Discussion

هي ملفقة وimmunosensor البصرية تسمية خالية، استنادا إلى البنية النانوية PSiO 2 (فيلم فابري بيرو رقيقة)، وتأكيد انطباق إمكاناتها بوصفها جهاز الاستشعار البيولوجي للكشف عن البكتيريا.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم اسرائيل (منحة رقم 1118-1108 ومنحة رقم 1146/12) وصندوق البحوث التذكارية كرول مينا. ES بامتنان بدعم مالي من معهد روسيل Berrie تقنية النانو.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Si waferSiltronix Corp.Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%)Merck101513
Ethanol absoluteMerck818760
PBS buffer solution (pH 7.4)prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/vprepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS)Sigma Aldrich Chemicals175617
PEO-iodoacetyl biotinSigma Aldrich ChemicalsB2059
Streptavidin (SA)Jackson ImmunoResearch Labs Inc.016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidinJackson ImmunoResearch Labs Inc.016-010-084
Biotinylated-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.115-095-003
Biotinylated E. coli antibodyJackson ImmunoResearch Labs Inc.1007
E. coli (K-12)was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion

References

  1. Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
  2. Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. . Food Microbiol.: Fundamentals and Front. 2, (2001).
  3. Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744 (2005).
  4. Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126 (2006).
  5. Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3 (2003).
  6. Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439 (2007).
  7. Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385 (2004).
  8. Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797 (2001).
  9. Dancil, K. -. P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J., Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. . Development of a Porous Silicon Based Biosensor. 536, 557-562 (1999).
  10. D'Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys - Condens Matter. 18 (33), S2019 (2006).
  11. de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361 (2004).
  12. Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108 (1998).
  13. Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393 (2006).
  14. Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636 (2005).
  15. Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250 (2006).
  16. Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375 (2005).
  17. Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327 (2007).
  18. Schwartz, M. i. c. h. a. e. l. P., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084 (2006).
  19. Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859 (2000).
  20. Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775 (2008).
  21. Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755 (2011).
  22. Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230 (2009).
  23. Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502 (2011).
  24. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E., Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. . Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. 733, (2012).
  25. Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via "Direct Cell Capture". Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
  26. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
  27. Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656 (2005).
  28. Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. . Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49 (2007).
  29. Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
  30. Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
  31. Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305 (1998).
  32. Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669 (2008).
  33. Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951 (2013).
  34. Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817 (2007).
  35. Banada, P. P., Bhunia, A. K., Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 567 (2008).
  36. Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S., Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. . Designing receptores for the next generation of biosensors. , 105 (2013).
  37. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803 (2007).
  38. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003 (2009).
  39. Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339 (2008).
  40. Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 83 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

81 biosensor E

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved