الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين الابتدائية

Summary

هطول فوسفات الكالسيوم هو وسيلة مريحة واقتصادية لترنسفكأيشن من الخلايا المستزرعة. مع التحسين، وأنه من الممكن استخدام هذه الطريقة على الخلايا التي يصعب بالنقل مثل الخلايا العصبية الأولية. نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة لدينا ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم من الخلايا العصبية قرن آمون cocultured مع الخلايا astroglial.

Abstract

هطول فوسفات الكالسيوم هو وسيلة مريحة واقتصادية لترنسفكأيشن من الخلايا المستزرعة. مع التحسين، وأنه من الممكن استخدام هذه الطريقة على الخلايا التي يصعب بالنقل مثل الخلايا العصبية الأولية. نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة لدينا ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم من الخلايا العصبية قرن آمون cocultured مع الخلايا astroglial.

Introduction

الخلايا العصبية الأولية هي واحدة من أصعب أنواع الخلايا لبالنقل كما هي تالية للتفتل وحساسة جدا للتغيرات البيئية الصغرى. هناك أربعة أنواع شائعة الاستخدام من أساليب التعبير عن الجينات خارجية والرنا دبوس الشعر القصير (shRNAs) في هذه الخلايا ^1. لكل منها مزاياه وعيوبه. على سبيل المثال، عادة ما يتم إجراء التثقيب الكهربائي في الخلايا العصبية معزولة طازجة ^2، كما يجب أن يتم نقل الخلايا في cuvettes لترنسفكأيشن. يمكن أن عدوى فيروس عادة تحقيق كفاءة عالية جدا ^3، ولكنه أكثر ومحفوفة بالمخاطر بالنسبة للمشغلين كثيفة العمالة. العديد من الكواشف ترنسفكأيشن بوساطة الدهون المتاحة تجاريا، بدرجات متفاوتة من النجاح في الخلايا العصبية ومستويات مختلفة من السمية الخلوية.

ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم يمثل طريقة مريحة واقتصادية لإدخال الجينات الغريبة إلى الخلايا العصبية. كان يستخدم الأسلوب الأول لإدخال الحمض النووي اتش سل في الثديياتليرة سورية من قبل غراهام وفان دير إب (1973) ^4. تم إجراء ترنسفكأيشن عن طريق خلط كلوريد الكالسيوم مع الحمض النووي المؤتلف في العازلة الفوسفات. وهذا يسمح للتشكيل الفوسفات الحمض النووي / يترسب الكالسيوم والتي، عندما انخفض تدريجيا على أحادي الطبقة من الخلايا، والتمسك سطح الخلية، ويتم تناولها من قبل الإلتقام و اخيرا يدخل في النواة ^5. ومن شأن هذه العملية تؤدي إلى التعبير عن الجينات الغريبة التي أدخلت في الخلية المستهدفة. الكفاءة نموذجية من مجموعة فوسفات الكالسيوم ترنسفكأيشن بين 0،5-5٪ ^6-8. ومع ذلك، مع الحرص على التحسين والتنفيذ المتسق للبروتوكول تجريبي، فمن الممكن للوصول إلى الكفاءة ترنسفكأيشن ما يقرب من 50٪. نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة لدينا ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم من الخلايا العصبية قرن آمون الأولية، التي cocultured مع الخلايا astroglial في شكل شطيرة ^9.

Protocol

1. إعداد الجرذ نجمية الثقافة للإعلام مشروطة ونجمية الخلايا العصبية Cocultures.

1. إعداد تشريح العازلة (BSS، انظر الجدول 1 للصفة) وتخزينها في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
2. تخدير الفئران الوليدة حديثي الولادة (P0-P2) مع isoflurane وفي كوب 500 مل.
3. عندما الجراء غير قادرة على الحركة، ورذاذ مع الايثانول 70٪ وقطع رأس.
4. إزالة الدماغ.
   1. عقد رئيس بحزم مع زوج من ملقط دومون # 5، واستخدام مقص غرامة لجعل شق خط الوسط من خلال الجلد والجمجمة.
   2. فضح الدماغ عن طريق تعكس الجمجمة على الجانبين، وإزالة الدماغ في طبق يحتوي BSS الباردة.
5. فصل نصفي الكرة المخية من الدماغ البيني وجذع الدماغ تحت نطاق تشريح. إزالة بعناية كل السحايا عن طريق تثبيت الأنسجة مع زوج واحد من ملقط وسحب بلطف بعيدا السحايا مع زوج آخر من الملقط.
6. جمع كل من نصفي الكرة الأرضية طن واحد 60 مم طبق. باستخدام مقص صغير، وأنسجة اللحم المفروم ناعما كما ممكن. ثم نقل الأنسجة المفروم إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
7. إضافة 1.5 مل من 1٪ الدناز الأول و1.5 مل من التربسين 2.5٪ و 12 مل من BSS (الحجم الكلي لل15ML) إلى العقول. احتضان في حمام مائي تهتز لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. لضمان خلط جيدة، وملتف أنبوب باليد كل 5 دقائق.
8. نقل طاف من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر على مدى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. إضافة 3 مل FBS لهذا طاف.
9. إلى القطع المتبقية، إضافة 13.5 مل من BSS و 1.5 مل 2.5٪ التربسين واحتضان بالحمام المائي في الهز لمدة 15 دقيقة أخرى.
10. نقل طاف المتبقية من خلال مصفاة الخلية وتتحد مع طاف من الخطوة 1.8.
11. أجهزة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه.
12. الكريات resuspend في 5 مل من وسائل الإعلام الدبقية. طاف يمكن طرد مرة أخرى لخلايا بيليه المتبقية.
13. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
14. لوحة سلليرة سورية في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 ⁷ لكل 150 سم ² القارورة.
15. تغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام الدبقية جديدة بعد اليوم الطلاء. بعد ذلك، وإطعام الخلايا مرتين في الأسبوع مع وسائل الاعلام الدبقية.
16. عندما وصلت إلى الخلايا> 80٪ confluency (حوالي 10 يوما بعد الطلاء)، وتجميد الخلايا في أسفل 90٪ مصل الحصان و 10٪ DMSO والحفاظ على الاسهم في النيتروجين السائل. يتم تجميد الخلايا في 2 × 10 ⁶ في قارورة. ما يقرب من 5 قوارير يمكن تجميد كل من القارورة.
17. قبل حوالي 10-14 أيام إقامة ثقافة الحصين، ومطلي الخلايا الدبقية من الأسهم المجمدة. ونحن عادة لوحة خمس 6 لوحات جيدة، وهو ما يكفي لدعم نمو 90 coverslips من الخلايا العصبية قرن آمون (ثلاثة coverslips 15 ملم جولة لكل بئر). ونحن أيضا لوحة إضافية ثمانية إلى عشرة 60 ملم أطباق من الخلايا الدبقية، والذي يستخدم لوسائل الإعلام تكييف N2.1 لترنسفكأيشن. قبل يوم من ثقافة العصبية، ويجب أن تغذى الخلايا مع وسائل الاعلام NB27. يجب أن تكون الخلايا النجمية مثالي> 90٪ متكدسة في الهو النقطة. نجد أن تجميد يقلل كثيرا من عدد من الخلايا الدبقية الصغيرة في الثقافات astroglial. منذ لوحظ زيادة العصبية عندما الخلايا الدبقية الصغيرة موجود في الثقافات astroglial، ونحن دائما استخدام الثقافة astroglial أعدت من الأسهم المجمدة لcoculture مع الخلايا العصبية.

2. العصبية الثقافة

1. coverslips الزجاج نظيفة قبل الشطف الأولى في milliQ 2X المياه. ثم تنقع في حمض النتريك أنها مركزة لمدة 24 ساعة، وتشطف بالماء milliQ لخمس مرات على الأقل على مدى ما مجموعه 2 ساعة. يتم تجفيفها وتعقيمها بواسطة Coverslips الخبز في الفرن على 225 درجة مئوية لمدة 6 ساعة.
2. نقل coverslips إلى 60 ملم الأطباق بعد التعقيم. وضع أربعة نقاط من البارافين معقمة بالقرب من الحافة الخارجية من كل ساترة للحفاظ على الخلايا العصبية فصل من الخلايا الدبقية خلال coculture.
3. coverslips معطف مع 1 ملغ / مل بولي-L-يسين في 0.1 م العازلة بورات بين عشية وضحاها في الحاضنة 37 درجة مئوية.
4. في اليوم التالي، وشطف coverslips مرتين في م العقيمةilliQ الماء لمدة 15 دقيقة على الأقل لكل منهما. ثم يتم تحضين أنها بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام الطلاء في الحاضنة 37 درجة مئوية.
5. الموت ببطء الفئران الحوامل (E18) من خلال التخدير isoflurane وتليها استرواح الصدر، والموت ببطء الفئران الجنينية بواسطة قطع الرأس. إزالة العقول وتشريح من نصفي الكرة المخية كما هو موضح أعلاه.
6. تشريح خارج الحصين من نصف الكرة المخية. إخضاع جميع الحصين في أنبوب 15 مل المخروطية، وهضم مع التربسين 0.25٪ (0.5 مل 2.5٪ التربسين، 4.5 مل BSS) في 37 ℃ لمدة 15 دقيقة.
7. يتم شطف الحصين هضمها في BSS 3X لمدة 5 دقائق لكل منهما. ثم يتم المسحوقة أنها مع ماصة باستير الزجاج، ويتم تحديد كثافة الخلية باستخدام عدادة الكريات. ثم يتم المصنفة الخلايا العصبية في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 ⁵ خلايا لكل 60 مم طبق.
8. حوالي 2-4 ساعة بعد الطلاء، ونقل coverslips مع الخلايا العصبية التي تعلق على الأطباق التي تحتوي على الخلايا astroglial، مع الخلايا العصبية لأسفل نحو الدبقية. في DIV3، إضافة إلى السيتوزين الأرابينوزيدالخلايا في تركيز النهائي من 5 ميكرومتر لوقف انتشار الخلايا الدبقية.

3. ترنسفكأيشن الكالسيوم

1. وسائل الإعلام حالة N2.1 على الدبقية اليوم قبل ترنسفكأيشن.
2. في يوم من ترنسفكأيشن، واتخاذ وسائل الإعلام مكيفة N2.1 الخروج من الدبقية ونقل إلى طبق جديد. نقل coverslips مع الخلايا العصبية في وسائل الإعلام N2.1 مكيفة. دعونا تتوازن في الحاضنة لمدة 10-30 دقيقة.
3. لمجموعة واحدة من أنابيب معقمة، والجمع بين 1-4 ميكروغرام من الحمض النووي، 12.5 ميكرولتر من 2 M و CaCl _2، وH ₂ O معقمة لحجم ما مجموعه 100 ميكرولتر. لمجموعة الثانية من الأنابيب، إضافة 100 ميكرولتر من 2X HBS.
4. إضافة حجم ⅛ من 2X HBS (12.5 ميكرولتر) في وقت لأنبوب يحتوي على خليط و CaCl ₂ / DNA، vortexing للبضع ثوان في كل مرة. السماح للأنابيب على الجلوس لمدة 15 دقيقة.
5. بعد 15 دقيقة الحضانة، إضافة قطرة قطرة الخليط ترنسفكأيشن إلى الخلايا. احتضان لمدة 1-1.5 ساعة. هناك طبقة من الرواسب مثل الرمل يجب أن تكون مرئيةتحت المجهر باستخدام الهدف 10X.
6. بعد الحضانة، وشطف مرتين مع coverslips الحارة HBS غسل العازلة.
7. العودة coverslips إلى أطباق الأصلي مع الدبقية، إضافة حمض kynurenic إلى تركيز النهائي من 0.5 ملم.
8. الخلايا العصبية Transfected يمكن تصوير الحية أو المجهزة للكيمياء سيتولوجية مناعية في وقت مبكر من اليوم التالي. يمكن البقاء على قيد الحياة الخلايا العصبية تصل إلى ثلاثة أسابيع بعد ترنسفكأيشن.

النتائج

عندما يتم تحسين المعلمات مختلفة من ترنسفكأيشن وبعناية للرقابة من تجربة إلى تجربة، فمن الممكن الحصول على الكفاءات ترنسفكأيشن تصل إلى 50٪. الشكل 1 يبين حقل من الخلايا العصبية التي يتم transfected مع GFP على DIV4. يحتوي على حقل ما مجموعه 28 الخلايا العصبية، ومنها و transfected 1...

Discussion

وهناك العديد من المعايير الأساسية التي يجب أن تسيطر عليها بعناية لtransfections ناجحة على الدوام ^10،11. المعلمة الأكثر أهمية بالنسبة لترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم هي قيمة الرقم الهيدروجيني لل2X HBS، والتي تختلف في أيدينا عادة ما بين 7،10-7،15. نوصي جعل ثلاث دفعات من الأسهم م...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09	straight / sharp 8.5 cm
Vannas-Tubinger spring scissors	Fine Science Tools	15008-08	angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-16
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91401-14	blunt / 14.5 cm
Spring scissors	Fine Science Tools	15006-09	angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge
Isoflurane	Webster Veterinary	14043-225-06
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
MEM	Sigma	M2279
100 mM Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Glucose	Sigma	G8270
10x HBSS	Sigma	H4385
1 M HEPES, pH 7.3	Gibco/Invitrogen	15630-080
GlutaMAX	Gibco/Invitrogen	35050-061
Neurobasal Media	Gibco/Invitrogen	21130-049
B27 Supplement (50x)	Gibco/Invitrogen	17504-044
N2 Supplement	Gibco/Invitrogen	17502-048
Ovalbumin	Sigma	A5503
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Invitrogen	15070-063
2.5% Trypsin	Gibco/Invitrogen	15090-046
DNase I	Sigma	DN-25
Cytosine arabinoside	Calbiochem/EMD Millipore	251010
Kynurenic acid	Sigma	K3375