تنظير القولون في الفئران مرنة لتقييم شدة التهاب القولون والقولون والمستقيم الأورام باستخدام نظام التحقق من صحة بالمنظار التهديف

Summary

على مدى السنوات القليلة الماضية، ظهرت المناظير الجيل الجديد كمساعدات البحوث التشخيصية الهامة لتقييم التهاب القولون وأورام القولون والمستقيم الفئران. نقدم هنا بروتوكول مفصلة لتقييم بالمنظار لأورام القولون والمستقيم والتهاب في الفئران، فضلا عن نظام التهديف الرواية التي تستخدم معرفات العشرية لتوثيق شدة التهاب القولون بالمنظار وأورام القولون والمستقيم.

Abstract

استخدام المناظير الحديثة لأغراض البحث سهلت إلى حد كبير فهمنا لأمراض الجهاز الهضمي. على وجه الخصوص، وكان التنظير التجريبية مفيدة للغاية للدراسات التي تتطلب تقييمات المتكررة في حيوان مختبر واحد، مثل تلك تقييم آليات مرض التهاب الأمعاء المزمن وسرطان القولون والمستقيم من التقدم. ومع ذلك، فإن الأساليب المستخدمة في دراسات تختلف اختلافا كبيرا. وقد تم نشر ما لا يقل عن ثلاثة أنظمة التهديف بالمنظار لالتهاب القولون الفئران ونشرت تفشل بروتوكولات لتقييم أورام القولون والمستقيم لمعالجة وجود التهاب القولون مصاحبة لذلك. تطور هذه الدراسة ويؤكد نظام التهديف بالمنظار استنساخه أن يدمج تقييم كل من الالتهاب والأورام في وقت واحد. هذا النظام رواية التهديف من ثلاثة عناصر رئيسية هي: 1) تقييم مدى وشدة التهاب القولون والمستقيم (استنادا إلى نتائج حول الشرج، والشفافية في ووللتر، المخاطية النزيف، والآفات البؤرية)، 2) تسجيل الكمي للآفات الورم (شبكة الخريطة وشريط الرسم البياني)، و3) الفرز العددية من الحالات السريرية التي صلتها المرضية والبحوث على أساس وحدة عشرية مع الفئات المعينة من الآفات لوحظ و مضاعفات بالمنظار (معرفات عشري). تم إعداد الفيديو ومخطوطة الواردة في هذه الوثيقة، وبعد بروتوكولات وافق IACUC، لتسمح للمحققين ليسجل فئران التجارب الخاصة باستخدام منهجية بالمنظار التحقق جيدا وقابلة للتكرار للغاية، مع خيار نظام للتمييز القاصي من الداني التهاب القولون بالمنظار (D-PECS ).

Introduction

وقد أجريت التنظير الفئران كأداة بحثية مفيدة لأكثر من عقد من الزمان ^1-3. حتى الآن، وقد استخدمت معظم الدراسات التي تستخدم الفئران التنظير المناظير جامدة، وعلى الرغم من أن البعض يستخدم أيضا التنظير السيني مرنة. يوفر التنظير الفئران نتائج فورية وتقدير أكثر موضوعية لمدى الحياة الطبيعية في الأمعاء، وشدة الالتهاب، وتطور الورم مقارنة مع التدابير غير المباشرة، مثل فقدان وزن الجسم، والإسهال، والأنسجة (والذي هو دون المستوى الأمثل عندما الآفات غير مكتمل)، في حين تقدم رؤى على الصحة العامة من القولون. وعلى الأخص، يسمح التنظير لتقييم المتكررة من النماذج الحيوانية المختبرية مع مرور الوقت، في مقابل الفحص النسيجي التقليدية التي تتطلب الحيوان إلى أن يتم التخلص وكولون إلى أن تحصد لتحليل ^1. على الرغم من هذه المزايا، واستخدام التكنولوجيا بالمنظار الفئران لم تكن على نطاق واسع ومحدودة بسبب عدم وجود بروتوكولات موحدة لimplementatiوعلى التهديف من النتائج المرضية. نفذت بشكل صحيح، التنظير الفئران يحمل وعدا كبيرا لزيادة تسهيل فهمنا وتوصيف النماذج الحيوانية من دول متعددة المزمنة وأمراض الجهاز الهضمي، بما في ذلك الأمراض الالتهابية الأمعاء، والتهاب القولون، وأورام القولون والمستقيم.

فائدة التكنولوجيا بالمنظار الفئران يتوقف على التكاثر والموضوعية، الأمر الذي يتطلب وجود إجراءات الفحص موحدة و، غير زائدة عن الحاجة، وموثوق بها نظام التسجيل المستمر للأمراض المعوية. وقد تم نشر ما لا يقل عن ثلاثة أنظمة التهديف وصفي لتقييم التهاب القولون بالمنظار ^4-6، وكذلك لعلاج أورام القولون ^4،7،8 في الفئران. ومع ذلك، ذكرت هذه النهج ونظم التهديف ليست قابلة للمقارنة بسهولة عبر الدراسات. في كثير من الحالات، ليس هناك تعريف واضح للمعايير المستخدمة لتصنيف الآفات، وعندما تعطى المعايير، فإنها تختلف على نطاق واسع. علاوة على ذلك،لا توجد نظم التهديف ذكرت أن دمج تقييم كل من التهاب القولون والأورام، وهما من الأمراض القولون الأكثر شيوعا التي يمكن أن تحدث في وقت واحد ويكون لها آثار التفاعلية على النتيجة، إلى أداة قياس واحدة. أخيرا، ونظم التهديف بالمنظار التي لا توجد لالتهاب القولون غالبا ما يكون التهاب فئات محدودة مع التمييز (أي. خيارات ضيقة التهديف على جداول صحيح قصير، وغالبا 1-4) لتمثيل صحيح سيناريوهات تطور المرض وتمكن من استخدام التحليل الإحصائي حدودي.

في هذه الورقة، ونحن تصف استخدام المنظار المرن لتقييم شدة التهاب القولون وأورام القولون الفئران ووصف بروتوكول موحد لتوظيف هذه التكنولوجيا في تقييم التشريحية في المنطقة حول الشرج والمستقيم، والقولون البعيدة. نحن لتوضيح المشاكل الفعال خلال التنظير لتقليل الصدمة والصورة الفنية، ونحن تصف نظام التسجيل استنساخهعلى أساس التحقق من صحة المعلمات السريرية المنشورة. نظام التهديف يدمج تقييم كل من الالتهاب والأورام المعوية باستخدام مستوى عال من التمييز مع 12 درجات ممكن من الالتهاب، ورسم الخرائط الورم وخيارات التخطيط، ونظام الرواية وحدة عشرية (أي معرفات عشري) لتسليط الضوء على نتائج ذات قيمة تشخيصية محددة ( أي تطور الورم، ومضاعفات أثناء التنظير، الخ). استخدام المعرفات العشرية يسمح لتتبع السريع لمجموعات البيانات ذات الصلة لمزيد من التحليل المصب. أخيرا، ونحن أداء اختبار موثوقية وصلاحية نظام التهديف في نماذج الفئران متعددة من التهاب القولون وسرطان القولون المرتبط (ديكستران كبريتات الصوديوم (DSS) التي يسببها التهاب القولون، المطثية العسيرة العدوى، وazoxymethane / التي يسببها سرطان القولون DSS).

Protocol

1. إعداد نظام التنظير

1. إعداد نظام التنظير قبل التخدير الفئران، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. استخدام ureteroscope الفيديو المصممة للبشر لهذا البروتوكول (الشكل 1). القطر الخارجي للأنبوب الإدراج 9.9 الأب (3.3 ملم)، ونهايته البعيدة 8.5 الأب (2.8 ملم)، والقطر الداخلي للقناة هو 6 أجهزة الاب (1.2 ملم).
2. على الرغم من أن استخدام المناظير لم تم ربط انتقال المرض [9]، تعقيم المنظار وعدسة مع 70٪ من الإيثانول ¹⁰ أو مع التقنيات المناسبة عند التعامل مع الكائنات الحية الدقيقة التي تشكل بوغ. إعداد مواد التشحيم العقيمة للجراثيم وغير الخدش مسح والأنسجة لتشبع طرف المنظار.
3. نعلق حقنة 3 مل كامل من الهواء (أو مناسبة خليط الغاز CO ₂₎ إلى الجزء العلوي من القناة الأجهزة.
4. بدوره على السلطة، واقامة توازن اللون الأبيض في الضوء الأبيض العادي،فضلا عن ضيق نطاق التصوير (مبادرة حوض النيل) واسطة، عند الاقتضاء. منذ عام 2001، وقد وفرت مبادرة حوض النيل فوائد التصوير التشخيصي كما تؤكد هياكل الأوعية الدموية غرامة على الأغشية المخاطية، بما في ذلك الآفات التقرحي ورمي، والتي لها الأوعية الدموية غير طبيعية مميزة ^11. وضع مبادرة حوض النيل مرشح يحد من الطول الموجي للضوء القبض على 390-445 نانومتر و530-550 نانومتر، الذي يسلط الضوء على الهياكل مع الهيموغلوبين.
5. طباعة النموذج التهديف التقييم (الشكل 2) لتسجيل النتائج الخاصة بك. تصبح مألوفة مع توقع الصور العادية ومبادرة حوض النيل (الشكل 3A) وتعريف ودرجات كل معيار قبل الامتحان (انظر القسم 6.1).
6. إعداد الحل القائم على تلوين الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لchromoendoscopy، إذا رغبت في ذلك. في chromoendoscopy، يتم تنفيذ امتحان باستخدام صبغة على العكس من متوسطة إلى تسليط الضوء على التغيرات المخاطية. استخدام الميثيلين الأزرق (0.1-1٪) واللون القرمزي النيلي (0.1٪) حلول (الشكل 3B). مذكرةأن الميثيلين الأزرق هو عامل الأكسدة والاختزال التي يمكن أن تنتج الجذور المؤكسدة أو غير مباشرة عبر ربط من مخلفات الأحماض الأمينية، وتدهور DNA ^12، والتي يمكن أن تتداخل مع تحليل العينة.

2. التخدير العام للماوس

1. اختيار مخدر وكيل وإدارة الطريق. استشارة طبيب بيطري من منشأة الموارد الحيوانية أو المؤسسي جنة رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) بشأن التداخل المحتمل من الأدوية مع نظام المناعة، وأهداف البحث. بعض الأدوية قد تؤثر على البيانات الشخصية خلوى في التعبير الحيوانات، بما فيها القوارض ^13. استخدام ثلاثي بروم إيثانول عن طريق الحقن لإجراءات المحطة أو isoflurane والتنظير للبقاء على قيد الحياة، جنبا إلى جنب مع الضوابط المناسبة.
2. لتحريض وإدارة 4-5٪ من 100٪ في isoflurane والأكسجين بمعدل 0.2-0.5 لتر / دقيقة، واستخدام 0.5-2٪ للصيانة. هذا البروتوكول ليس مناسبا لجميع الحيوانات. استشر الطبيب البيطري منشأةللحصول على التعليمات المناسبة والتدريب. تلتزم التوصيات IACUC ذات الصلة لتحقيق أعلى معايير الرفق بالحيوان. تأكد من أن الماوس إذا تخدير كامل.
3. 'الشريط' الماوس تخدير إلى جدول السطح الظهري في دعم أو موقف بطني باستخدام شريط لاصق المختبر. حذار من التوجه التشريحية على الشاشة المنظار الخاص بك. تأمين الحدود القصوى في الدنيا والذيل. ويمكن أيضا أن توضع عصابة من الشريط على صدره لمنع الحركة بعيدا عن جهاز التنفس الصناعي، ولكن تجنب تقييد الحركات التنفسية الصدري.

3. مفصلة بالمنظار فحص

1. البحث عن الآفات حول الشرج قبل إدخال المنظار في المستقيم، ثم دفع منظار من خلال فتحة الشرج.
2. معطف المنظار مع زيوت التشحيم الجراحية المعقمة. تأكد من عدم معطف سطح CCD (جهاز تهمة جانب) أجهزة الاستشعار.
3. إدراج المنظار وبدء التسجيل. أشرطة الفيديو المسجلة هي مفيدة لمتقييم eticulous من التنظير إذا لزم الأمر بعد الفحص. حاول تنفيذ التنظير في طول أقل قدر ممكن من الوقت لتقليل تهيج الأمعاء / المخاطية.
4. تطبيق الهواء باستخدام حقنة لتعيين ببطء بعيدا جدران الامعاء. اعتمادا على حجم الماوس، استخدم 1-2 مل من الهواء. تجنب الإفراط في نفخ الهواء، بل قد يسبب ضيق في التنفس والموت من الفأرة تخدير.
5. دفع المنظار إلى الأمام كما كنت تمهيد الطريق مع الهواء أو دوران لطيف من النطاق. لا تقدم المنظار إذا كنت لا أرى لمعة الأمعاء. الثقوب أو الدموع المستقيم / القولون يمكن أن تحدث في هذه المرحلة، وخاصة في صغار الفئران (<8-10 أسابيع من العمر). التقاط الصور عند الضرورة.
6. كما سلف نطاق، وتقييم ما إذا كان هناك نزيف عفوية (كما هو موضح طبيعيا المخاطية نزيف غير المرتبطة التنظير الصدمة). ويمكن ملاحظة نزيف عفوية كما يدخل المنظار المستقيم والقولون.
7. كماsess شفافية جدار القولون. يتم تعريف الشفافية والقدرة على تصور الأوعية الدموية جماعية في القولون والتي من الأحشاء الأخرى المحيطة (الشكل 4). اقتراح لطيف من نطاق (الظهر إلى الأمام، في اتجاه عقارب الساعة، عكس عقارب الساعة) سوف يساعد تحديد ما إذا كان يمكن رؤية الأوعية الدموية في سياق الأحشاء الأخرى. ويمكن أيضا أن ينظر الأنسجة الدهنية المساريقي. ملاحظة إذا كان المستقيم داخل تجويف الحوض يبدو أقل شفافية من جدار القولون في تجويف البطن.
8. فحص لتحديد نوع وعدد من الآفات البؤرية (المناطق ذمي، تقرحات، والقرحة، ورمي الجماهير). سيسجل هذا في شكل التهديف باستخدام النتيجة التهاب القولون ومعرفات العشرية التي تم وضعها.
9. مرة واحدة يتم الوصول إلى المنطقة التي تنثني نحو caudally القولون في القولون الداني، سحب المنظار ببطء والبحث عن وجود اتصال النزيف (والذي يحدث نتيجة لتفتيت المخاطية بعدالمنظار متقدمة أو إزالتها). فإنه ليس من الضروري أن تتخلص من سطح القولون عمدا. الغشاء المخاطي القولون والمستقيم صحية لا تنزف بعد الفحص بالمنظار الصحيح.

4. خزعة

1. عندما تكون هناك حاجة الخزعات، إدراج ملقط الخزعة من خلال قناة مخصصة لأجهزة المنظار. رصد النهوض ملقط على الشاشة المنظار لمنع انثقاب الأمعاء.
2. فتح أكواب خزعة من ملقط لحوالي 60-80 درجة زاوية كوب إلى كوب، وتوجيههم إلى منطقة الفائدة. ملقط أو ضغط مفرط قد فتحت فهم طبقات اضافية من الأنسجة المعوية، مما يؤدي الى ثقب الناجم عن خزعة من جدران الأمعاء شفافة صحية. في حالة حدوث ثقب، الموت ببطء الحيوان أثناء التخدير التالية توصيات IACUC الخاص بك. الثقوب يؤدي إلى التهاب الصفاق endotoxemia و.
3. إغلاق أكواب خزعة، وتسحبهم مع الحفاظ إغلاق ملقط.
4. ريمولقد العينة من ملقط من قبل بيغ الأنسجة مع الحل الذي هو لطيف إلى الأنسجة وملقط. الحمض النووي الريبي في وقت لاحق وبرنامج تلفزيوني وحلول العمل المشترك، وإذا لزم الأمر، استخدام إبرة لطرد العينة. تجنب تآكل أكواب forcep أو حواف القطع.

5. التعافي من التخدير

1. عند الانتهاء من الفحص، وتوفير بيئة دافئة لالماوس حتى يتعافى. استخدام إما الضوء الكهربائي، أو وسادة دافئة وضعت في 37 درجة مئوية. تجنب ارتفاع درجة الحرارة؛ توسع الأوعية المحيطية يهدد الانتعاش الحيوان. رصد الماوس عن كثب حتى الشفاء التام.

6. نظام متكامل بالمنظار التهديف من القولون والمستقيم الصحة مع عشري معرفات

1. استخدام النموذج التهديف (الشكل 2) وتعريفات المعلمة أدناه (التقييم بالمنظار الفئران التهاب القولون والمستقيم وأورام باستخدام نظام عشري المرجحة-التهديف: معلمة التعاريف، والبروتوكول) لأمثلة واختياري "نظام القاصي-الدانية بالمنظار التهاب القولون سجل '(D-PECS) كمبادئ توجيهية لتقييم nonbiased وحفظ السجلات التفصيلية.
2. تسجيل المعلمات الأربعة من التهاب القولون والمستقيم وصفها على شكل نظام التسجيل (الشكل 2). تقييم بدقة المنطقة حول الشرج، والشفافية في الأمعاء، ونوع من النزيف المعوي (إذا كان موجودا)، وجود وكمية من الآفات البؤرية (التآكل، التقرحي، و / أو ورمي).
3. عند تقييم أورام لأغراض البحث، ودراسة كمية، والموقع، والحجم، ووصفها باستخدام خريطة القولون وشريط الرسم البياني على شكل التهديف. فإن المبلغ العددية من عشرات حصل عليها وعدد من الآفات (عند الاقتضاء) تحديد التهاب القولون الخلفية، النوع الأكثر الغالبة من الآفة، وعدد من الآفات.

النتائج

تم إعداد البروتوكول والصور المعروضة في هذه الدراسة مع المنظار أوليمبوس URF-V مرنة ^و14 مبادرة حوض النيل ^11،15. تم حفظ الصور في الفيديو MPEG-2 تنسيق والصور في JPG، TIF، PNG، أو تنسيق DICOM مع أقصى 1،280 خ 1،024 بكسل، فلاش USB قابلة للتحويل إلى ذكريات المحمولة القياسية. مبادرة حو?...

Discussion

هناك عدة اعتبارات بشأن تعديل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للتقنية بالمنظار في الفئران. وتشمل الجوانب الهامة من الإجراء التي تحتاج إلى أن يتقن خلال استخدام المناظير المرنة تعديل حجم الهواء اللازمة لمنع انتفاخ البطن والجهاز التنفسي وسطا من الفأرة، والجوانب الفنية الطف...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System