الأولية العظام جليوما Xenografts خلاصة النمو المتسلل و Isocitrate Dehydrogenase الأول طفرة

Summary

تشكل الأورام الدبقية الخبيثة مجموعة غير متجانسة من الأورام الدبقية عالية التسلل ذات السمات السريرية والجزيئية المتميزة. الزينوغرافتات التقويمية الأولية تلخص السمات النسيجية والجزيئية للأنواع الفرعية الخبيثة من الورم الدبقي في نماذج الحيوانات قبل السريرية.

Abstract

تشكل الأورام الدبقية الخبيثة مجموعة غير متجانسة من الأورام الدبقية عالية التسلل ذات السمات السريرية والجزيئية المتميزة. الزينوغرافتات التقويمية الأولية تلخص السمات النسيجية والجزيئية للأنواع الفرعية الخبيثة من الورم الدبقي في نماذج الحيوانات قبل السريرية. ولنمذجة الأورام الدبقية الخبيثة من الدرجتين الثالثة والرابعة لمنظمة الصحة العالمية في مقايسات الزرع، يتم نقل الخلايا السرطانية البشرية إلى موقع تقويم العظام، الدماغ، للفئران المنافضة للمناعة. على النقيض من xenografts الثانوية التي تستخدم الخلايا السرطانية المستزرعة ، يتم فصل خلايا الورم الدبقي البشري عن العينات المستئصالة وزرعها دون مرور مسبق في زراعة الأنسجة لتوليد xenografts الأولية. الإجراء في هذا التقرير تفاصيل إعداد عينة الورم، وزرع داخل الجمجمة في الفئران منقوصة المناعة، ورصد لengraftment الورم وحصاد الورم لتمرير لاحقة إلى الحيوانات المتلقية أو التحليل. يتطلب إعداد الخلايا السرطانية ساعتين وتتطلب العملية الجراحية 20 دقيقة /.

Introduction

الأورام الدبقية الخبيثة هي أورام الدبقية الأولية في الجهاز العصبي المركزي التي تحدث في الدماغ وأحيانا في الحبل الشوكي. تصنف منظمة الصحة العالمية الأورام الدبقية وفقا للتشابه النسيجي مع الخلايا الفلكية أو أوليغودندروسيتوس أو الخلايا النعجلية ثم يتم تصنيفها رقميا (من الأول إلى الرابع) للسمات المرضية للأورام الخبيثة. الأنواع الفرعية الهسولوجية الأكثر شيوعا هي السيتوسيتوماس، الأورام الأوليغوديندروغليوماس والقلة المختلطة. وتتميز الأورام الدبقية الخبيثة التي تشمل الصفوف من الثاني إلى الرابع لمنظمة الصحة العالمية بالنمو الغازي والتكسير إلى العلاجات الحالية. في كل عام في الولايات المتحدة ، يتم تشخيص ما يقرب من 15750 شخصا بورم جلي خبيث ويستسلم ما يقدر ب 12740 مريضا لهذا المرض. وتسلط هذه الإحصاءات الضوء على الطبيعة الفتاكة بشكل خاص للأورام الدبقية الخبيثة والحاجة الهامة إلى تعزيز الفعالية العلاجية.

نماذج السرطان ضرورية للتحقيق في بيولوجيا الورم والعلاجات. خطوط الخلايا السرطانية البشرية تمثل خطوة أولى هامة للتلاعب في المختبر وفي دراسات فيفو xenografting (xenografts الثانوية)¹. ومع ذلك, الثقافات الخلايا السرطانية القياسية الخضوع التحول phenotypic وجنوتيبيك^2-4 التي قد لا تكون استعادة في xenografts الثانوية⁵. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تضيع التغيرات الجينية مثل إيزوقراطيات ديهيدروجيناز(IDH)الطفرات^6،مجموعات الخلايا الجذعية متميزة⁷ والاعتماد على مسارات الإشارات الرئيسية⁸ في ثقافات الخلايا السرطانية. يمكن الحفاظ على ملامح الجينوم إلى حد أفضل في ثقافة مجال السرطان، على الرغم من أنها لا تزال تفشل في مرآة تماما النمط الجيني للأورام الأولية^2،3. زرع العظام المباشر ينفي تأثيرات الثقافة في المختبر ، ويوفر بيئة دقيقة مناسبة ، ويحافظ على سلامة الخلايا التي تبدأ الورم^9،10. لذلك، xenografts الأولية تمثل نموذجا قويا ووثيقة الصلة قبل السريرية لاختبار دقيق العوامل المستهدفة للمساعدة في التصميم العقلاني للتجارب السريرية في المستقبل^5،11،12.

Protocol

1. إعداد تعليق الخلايا السرطانية

ملاحظة: مطلوب موافقات مؤسسية مناسبة لاستخدام مواد المريض والحيوانات لإنشاء وصيانة الأورام الدبقية العظام الأولية xenografts. في المركز الطبي لجامعة فاندربيلت، يتم جمع مواد الورم التي تم استئصالها التي تتجاوز تلك المطلوبة لأغراض التشخيص بموافقة المريض على مستودع أنسجة البحث. يتم تسمية العينات برقم قاعدة بيانات REDcap عشوائي مكون من 5 أرقام ويتم إزالة جميع المعرفات الخاصة بالمرضى. تحتوي قاعدة بيانات REDcap على بيانات سريرية غير محددة لكل عينة في مستودع الأنسجة تشمل الجنس والعمر (بالسنوات) والعرق وحالة البقاء على قيد الحياة وعلم الأمراض وعلاجات السرطان وسنة استئصال الأنسجة ووقت التقدم. للحفاظ على العقم وتحسين نجاح الطريقة xenograft الأولية، وينبغي تجميع جميع الكواشف، والأدوات الجراحية البخار autoclaved، وموقع الجراحية أو إعدادها مقدما.

ملاحظة: عينات الورم الدبقي غالبا ما تحتوي على كميات كبيرة من المايلين والحطام. اعتمادا على حجم العينة، قد يكون من الضروري استخدام أكثر من 4 أنابيب الانحدار متقطعة لإزالة كافية من المايلين والحطام.

ملاحظة: يتم الانتهاء من العملية عندما لا يكون هناك، أو القليل، واضحة للعيان الأنسجة غير المرتبطة المتبقية. تجنب إدخال فقاعات أثناء عملية التحويم.

ملاحظة: قابلية البقاء على قيد الخلية بعد الانفصال عادة ما تكون >90٪. قد تعكس القدرات السفلية العديد من المتغيرات بما في ذلك مناولة الأنسجة دون المستوى الأمثل أو وقت النقل من غرفة العمليات ، أو طريقة حفظ التبريد ، أو تقنية انفصال الباباين. ومع ذلك، قد تظل القدرات الخلوية المنخفضة كافية، طالما أنه قد يتم زرع عدد كاف من القدرات القابلة للحياة في الحجم المناسب. لكل فأر، يتم زرع 50،000-200،000 خلايا قابلة للحياة في حجم 2 ميكرولتر. بسبب طرف مشطوف من إبرة المحاقن, إضافية 5 ميكرولتر تعليق الخلية ينبغي أن تدرج في المجلد النهائي لضمان أن المواد الكافية يمكن استخلاصها إلى حقنة لكل حقنة. على سبيل المثال، لحقن 2 ميكرولتر/فأرة ل 5 فئران، يجب أن يكون الحجم النهائي 15 ميكرولتر (15 ميكرولتر = (5 × 2 ميكرولتر) + 5 ميكرولتر).

1. ضع مواد المريض التي تم إعادة تحديدها حديثا في حاوية معقمة مغطاة على الجليد لنقلها إلى المختبر. معالجة العينة مباشرة لزرع أو cryopreserve العينة في النيتروجين السائل (انظر أدناه) لتخزينها في النيتروجين السائل والاستخدام في وقت لاحق.
2. إعداد حلول الفصام papain (محلول papain، غسل / محلول مثبطات البروتيز ومحلول التدرج متقطعة) في غطاء محرك السيارة معقمة مع مكونات عدة والتعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة. تسمية عقيمة 15 مل أنابيب البوليسترين المخروطية وتوزيع الحلول على النحو التالي:
   • أنبوب 1: 5 مل من محلول الباباين
   • أنبوب 2: 3 مل من محلول مثبط الغسيل / البروتيز
   • أنابيب 3-6: 5 مل كل من محلول التدرج متقطعة
3. ضع عينة الورم الدبقي في الأنبوب 1 مع 5 مل من محلول الباباين والتريتورات مع ماصة 5 مل على مدى فترة زمنية تتراوح بين 10 و 20 دقيقة.
4. ماصة المواد صعودا وهبوطا 10 مرات ومن ثم احتضان المواد لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل بدء الدورة التالية من التحيب.
5. ضع طرف ماصة 5 مل أقرب إلى الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي مع كل دورة من التريتوريشن بحيث يقوم الطرف بلمس الجزء السفلي من الأنبوب للدورتين الأخيرتين.
6. جهاز طرد مركزي عند 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatant وماصة بيليه صعودا وهبوطا 10x في 3 مل من محلول مثبط غسل / بروتياز.
7. طبقة بعناية حجم متساو من التعليق على كل من حلول التدرج 5 مل متقطعة (أنابيب 3-6)، مع مجموعة ماصة في "الجاذبية" الاستغناء عن السرعة.
8. ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي مجهز بدوار دلو متأرجح، مع تقليل سرعة التسارع إلى أدنى إعداد وإيقاف تشغيل الفرامل. جهاز طرد مركزي عند 76 x g لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. مع إيقاف تشغيل الفرامل، يتم الانتهاء من الطرد المركزي بشكل عام بعد 20 دقيقة.
9. إزالة supernatant، resuspend والجمع بين كل بيليه في 5 مل من محلول الملح المتوازن العقيم ووضع الخلايا على الجليد.
10. إزالة جزء (10-100 ميكرولتر) من تعليق الخلية وتحديد كثافة الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد الأزرق تريبان مع مقياس الدم.
11. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في كثافة 25،000-125،000 خلايا قابلة للحياة لكل ميكرولتر.
12. نقل حجم كاف من تعليق الخلية إلى أنبوب 200 ميكرولتر من أجهزة الطرد المركزي (أنبوب PCR) ووضعه على الجليد.

2. إعداد موقع الجراحة والأدوات

ملاحظة: يتم ارتداء قفازات جراحية معقمة أثناء العملية. اعتمادا على متطلبات كل مؤسسة، قد تكون هناك حاجة إلى العباءات الجراحية والقبعات وحراس الوجه.

1. إعداد مقاعد البدلاء تطهيرها لجراحة القوارض مع المناطق المجاورة منفصلة لإعداد الحيوانات، ومجال التشغيل واستعادة الحيوانات.
2. تعقيم الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف البخار. في وقت لاحق، استخدم معقم حبة ساخنة لأدوات فلاش تعقيم عند الانتقال من واحد يخضع إلى آخر.

3. التعريفي، التخدير، والتسكين

ملاحظة: تتطلب العمليات الجراحية التي تتجاوز 15 دقيقة من وقت تخدير الفئران مصدرا للحرارة. لمنع انخفاض حرارة الجسم ، يتم تزويد الفئران بمصدر حراري (بطانية الماء الساخن المتداولة) خلال فترات ما قبل وبعد الجراحة.

1. إعداد كوكتيل الكيتامين / xylazine للتخدير التعريفي بحيث يتلقى كل فأر الكيتامين 100 ملغ / كغ وإكسيلازين 10 ملغ / كغ عن طريق حقن 10 ميكرولتر من الكوكتيل لكل غرام من وزن الجسم.
2. الجدول 1 - الجداول كوكتيل التخدير.

   	تركيز المخزون	حجم التحضير ل
   		فأرة واحدة	خمسة فئران	عشرة فئران
   الكيتامين	100 ملغم/مل	25 ميكرولتر	125 ميكرولتر	250 ميكرولتر
   زيلازين	100 ملغم/مل	2.5 ميكرولتر	12.5 ميكرولتر	25 ميكرولتر
   ملحية متساوية		223 ميكرولتر	1,113 ميكرولتر	2,225 ميكرولتر
   مجموع		250 أول	1250 ميكرولتر	2500 ميكرولتر

3. إعداد محلول الكيتوبروفين للتسكين عن طريق تمييع محلول المخزون (10 ملغم / مل) 1:20 في الماء العقيم الخالي من البيوجين بحيث يتلقى كل فأر جرعة من 5 ملغم / كجم عن طريق حقن 10 ميكرولتر من المحلول لكل غرام من وزن الجسم.
4. وزن وتسجيل الوزن قبل الجراحة. تختلف أوزان الماوس الفردية، ولكن تتراوح عموما من 18-22 غرام.
5. حقن 10 ميكرولتر من كوكتيل الكيتامين / xylazine لكل غرام من وزن جسم الماوس في الفضاء داخل الصفاق مع حقنة الأنسولين. على سبيل المثال، حقن 200 ميكرولتر ل 20 غرام الماوس.
6. تحديد ما إذا كان يتم تخدير الماوس بالكامل عن طريق قرصة إصبع القدم من الساق الخلفية. يستغرق عموما 3-5 دقيقة للفأرة لم يعد الانسحاب من قرصة.
7. حقن 10 ميكرولتر من محلول الكيتوبروفين لكل غرام من وزن جسم الماوس تحت الجلد في الجلد فضفاضة من الجناح مع حقنة الأنسولين. على سبيل المثال، حقن 200 ميكرولتر ل 20 غرام الماوس.
8. حلق الشعر على الجمجمة مع المقصات، فرك فروة الرأس المكشوفة مع بوفيدوني اليود باستخدام قضيب طرف القطن ومن ثم مسح لوحة الكحول. كرر هذه الخطوات، فرك بوفيدوني اليود ومسح الكحول، مرتين أخريين.
9. تطبيق مرهم العيون على عيون الماوس.
10. جعل شق خط الوسط 1 سم تمتد من وراء الأذنين إلى فقط أمام العينين مع شفرة مشرط معقمة.
11. ضع الماوس تحت نطاق تشريح وكشف الجمجمة لتحديد خطوط خياطة. باستخدام حركات دائرية مع الحفر، مركز حفرة بور 2.5 ملم الجانبي إلى bregma و 1 مم الخلفي إلى خياطة التاجية.

4. زرع داخل الجمجمة

ملاحظة: قد تكون أحجام الحقن التي تتجاوز 2.5 ميكرولتر قاتلة للفئران.

1. ضع الماوس على إطار مجسم عن طريق ربط القواطع العلوية فوق شريط القواطع وتطبيق مشبك الأنف بحيث يتم تثبيت الجمجمة بقوة في وضع محايد.
2. رسم 5-10 ميكرولتر من الخلايا في أنبوب الطرد المركزي الدقيق صعودا وهبوطا عدة مرات في حقنة هاملتون 10 ميكرولتر فرضت في حامل التحقيق من المتلاعب مجسمة لخلط التعليق والقضاء على فقاعات. الاكتئاب المكبس بحيث يتم تحميل المحقنة مع 2 ميكرولتر (حجم كاف لحقن واحد).
3. اسحب الحافة الجانبية لشق الجلد لكشف ثقب التجشؤ ، ومع المايكرومانيبولاتور ، أدخل الإبرة في ثقب التجشؤ بحيث يكون الجزء المشمل أسفل سطح الجمجمة مباشرة.
   1. تقدم الإبرة 3 مم ثم سحب الإبرة 0.5 ملم لخلق مساحة للحقن.
   2. تقدم المكبس ببطء أكثر من 30 ثانية ثم السماح للإبرة بالبقاء في الدماغ لمدة 2 دقيقة إضافية. سحب الإبرة تدريجيا عن طريق الصعود 0.5 ملم والانتظار لمدة 30 ثانية إضافية قبل إزالة الإبرة من الدماغ.
4. قم بإزالة الماوس من الإطار المجسم وإغلاق الجرح باستخدام مشبك تلقائي.
5. ضع الماوس على لوحة الاحترار للحفاظ على درجة حرارة الجسم ورصد مستمر لنمط التنفس ولون الأغشية المخاطية والأنسجة المكشوفة (باطن القدمين).
6. ضع الماوس في قفص معقم للميكروسولاتور بمجرد تعافيه بالكامل من التخدير (القص والمسكن) ، وإعادته إلى منشأة سكن الحيوانات.

5. رعاية الحيوان بعد الزرع والمراقبة

ملاحظة: المؤشر الأكثر موثوقية من ورم الحرمان والنمو المتسلل هو تدريجي, فقدان الوزن المستمر يرافقه تطوير الموقف حدب ومعطف الشعر الخام. في حالات نادرة ، لوحظ العجز العصبي التي تشمل ترنح ، عسر القراءة ، والنوبات. xenografts الأولية Orthotopic الغازية للغاية وتتطور على مدى فترة طويلة من الزمن. الفئران عادة ما تظهر أعراض نمو الورم 3-6 أشهر بعد زرع.

1. مراقبة الفئران مع xenografts orthotopic يوميا لتناول الطعام والماء، والسلوك، والاستمالة، وعلامات العدوى في موقع شق.
2. إعطاء الكيتوبروفين (5 ملغم/كغ تحت الجلد، 1-2x في اليوم) إذا لوحظ الألم أو الضيق بعد الجراحة.
3. إزالة القطع التلقائية بعد 8-10 أيام من الجراحة.
4. وزن الفئران أسبوعيا.
5. مراقبة علامات وأعراض ورم النغر.

6. حصاد الورم

ملاحظة: بهذه الطريقة، تحتوي الشريحة التاجية الأولى (#1) على الجانب الخلفي من المصابيح الشمية والجانب الأمامي من الفصوص الأمامية. الورم المحتقن هو الأكثر وفرة في نصف الكرة الأيمن من الشرائح التاجية 3 اللاحقة (شريحة #2، #3، #4) ويتم احتواء مشهد الحقن بشكل روتيني في شريحة تاجية #3. اعتمادا على الاحتياجات التجريبية، يمكن استخدام المواد لمرور الورم، وأقسام الأنسجة المجمدة، والفورماتين الثابتة البارافين أقسام الأنسجة المضمنة، وتدفق قياس الخلايا من الأنسجة المفككة، وزراعة الخلايا أو ال ليسات للحمض النووي، الحمض النووي الريبي، أو تحليل البروتين. أجزاء من الورم قد تكون cryopreserved للاحتياجات المستقبلية مع صلاحية الخلية تتراوح بين 80-95٪.

1. قتل الفئران عن طريق التعرض لفترات طويلة لثاني أكسيد الكربون تليها خلع عنق الرحم.
2. قطع رأس الفئران القتل الرحيم في قاعدة الدماغ (مستوى ماغنوم foramen) مع زوج أكبر من مقص الجراحية، وسحب الجلد من شق إلى الأمام لفضح الجمجمة تماما.
3. أزل الدماغ
   1. إدراج طرف واحد من زوج من مقص الجراحية الجميلة في الجانب الجانبي من ماغنوم foramen إلى مستوى اللحم السمعي الخارجي الأيسر لقطع العظام القذالي على طول الجانب الأيسر من الجمجمة. تنفيذ نفس القطع على الجانب الأيمن.
   2. قطع العظام القذالي على طول الطائرة التاجية من واحد اللحم السمعي الخارجي إلى الآخر وإزالة العظام لفضح المخيخ.
   3. قطع لوحات العظام الأنفية بين العينين.
   4. قطع خياطة القوس عن طريق قطع الخلفي على طول خياطة القوس من لوحات العظام الأنفية إلى bregma. إكمال شق خط الوسط على طول خياطة القوس عن طريق قطع الأمامي من لامبدا إلى bregma.
   5. إدراج بعناية غيض من زوج من ملقط غرامة على طول فتحة القوس على كل جانب لتمزيق أي التصاق دورال الجمجمة إلى الدماغ ومن ثم قشر نصفي الجمجمة أفقيا لفضح الدماغ والمصابيح الشمية الظهرية.
   6. الشريحة ملقط بين الجانب البطيني من المصابيح الشمية والجمجمة لتحرير أي التصاقات.
   7. إمالة الجمجمة مرة أخرى للسماح للدماغ أن يتراجع بحيث يتم الكشف عن الأعصاب البصرية وغيرها من الجمجمة. قطع الأعصاب القحفية لإطلاق الدماغ في طبق يحتوي على برنامج تلفزيوني معقم.
4. نقل الدماغ مع ملعقة وزنها إلى تقطيع مصفوفة وتوليد شرائح تاجية 2 ملم مع شفرات الحلاقة.
5. ترتيب شرائح التاجية في طبق يحتوي على برنامج تلفزيوني عقيم لمزيد من التفتيش البصري ومعالجة الأنسجة مزيد من.

7. إعادة تثبيت التبريد الورم

1. إعداد حل المخزون من متوسطة التبريد.
   1. إضافة 50 مل من الملحق الانتشار, 5 مل من 100x البنسلين والعقدية الحل, و 450 ميكرولتر من 0.2٪ الهيبارين إلى 450 مل من المتوسط القاعدي.
   2. تخزين الأسهم الحل في 4 °C محمية من الضوء.
2. إعداد حل عملي للوسط التبريد.
   1. الجمع بين 47.5 مل من متوسط التبريد و 2.5 مل من DMSO معقمة في أنبوب مخروطي البولي بروبلين 50 مل وتخلط جيدا.
   2. Aliquot 1.0 مل من حل العمل لكل cryovial وتخزينها في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
3. ضع شريحة إكليلية واحدة مقاس 2 مم من الدماغ الزينوغرافت في وسط التبريد الذي يحتوي على التبريد على الجليد.
4. غطاء بإحكام القارورة ووضعها في حاوية تجميد في -80 درجة مئوية. نقل cryovial في اليوم التالي إلى خزان النيتروجين السائل لتخزين أطول.

النتائج

يتم زرع خلايا الورم الدبقي المفككة مباشرة في أدمغة الفئران المنافرة المناعية للحصول على خطوط زينوغرافت تقويم العظام الأولية. يتم تعيين كل عينة ورم عدد عشوائي قبل زرعها، كجزء من عملية إلغاء تحديد هوية لإزالة المعلومات الصحية المحمية. نحن نستخدم رقم قاعدة بيانات REDcap مكون من 5 أرقام لهذا الغ...

Discussion

خطوط الخلايا المستزرعة، xenografts والفئران المعدلة وراثيا هي الطرق الأكثر شيوعا لنمذجة الأورام الدبقية، وهناك فوائد والقيود المتميزة لكل نظام نموذج^3،13،14. وتشمل الفوائد ذات الصلة من الأورام الدبقية العظام الأولية xenografts النمو المتسلل الذي يطبع الأورام الدبقية المنتشرة والاحتفاظ بالتغ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040-133
Papain dissociation system	Worthington Biochemical Corp.	LK003150
Trypan blue solution 0.4%	Life Technologies	15250061
Ketamine HCl	Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company
Xylazine HCl
Ketoprofen
Ophthalmic ointment
Povidone-iodine	Fisher Scientific	190061617
Cryopreservation medium and proliferation supplement	StemCell Technologies	05751
0.2% Heparin sodium salt in PBS	StemCell Technologies	07980
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D6250-5X10ML
NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice	The Jackson Laboratory	005557	NSG mice
Anti-human vimentin antibody	Dako	M7020	Use 1:200 to 1:800
Anti-human IDH1 R132H antibody	Dianova	DIA-H09	Use 1:100 to 1:400
Centrifuge with swinging bucket rotor
Pipetter with dispensing speed control
Disposable hemocytometer	Fisher Scientific	22-600-100
Sterile surgical gloves	Fisher Scientific	11-388128
Disposable gown	Fisher Scientific	18-567
Surgical mask	Fisher Scientific	19-120-1256
Tuberculin syringe	BD	305620
Alcohol pads	Fisher Scientific	22-246-073
Portable electronic scale	Fisher Scientific	01-919-33
Zoom stereomicroscope
Surgical clipper	Stoelting	51465
Scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blades, #10
Stereotaxic instrument	Stoelting	51730
High-speed drill	Stoelting	51449
Drill bit, 0.6 mm	Stoelting	514552
Hamilton syringe	Hamilton	80336
Autoclip, 9 mm	BD	427630
Circulating water warming pad	Kent Scientific	TP-700 TP-1215EA
Hot bead dry sterilizer	Kent Scientific	INS300850
Surgical scissors	Fine Science Tools	14101-14
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11
Spring scissors	Fine Science Tools	15018-10
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-30
Semimicro spatulas	Fisher Scientific	14374
Mouse brain slicer matrix	Zivic Instruments	BSMAS002-1
Cryogenic storage vials	Fisher Scientific	12-567-501