على الفئران نموذج مثلي من سرطان البروستاتا البشرية الانبثاث

Summary

هذا النموذج مثلي من سرطان البروستاتا البشرية يسمح للالكمي لحجم الورم، وتعميم الخلايا السرطانية، وتشكيل ورم خبيث متميزة إلى الرئة. كما يجب أن الهروب خلايا الجهاز الرئيسي، تدخل مجرى الدم، وزرع في موقع ثانوي، وهذا النموذج يلخص بشكل فعال السيناريو في البشر.

Abstract

وقد وضعت لدينا مختبر نموذج زرع مثلي الرواية من سرطان البروستاتا البشرية (PCA). كالموت PCA ليس بسبب الورم الرئيسي، وإنما تشكيل ورم خبيث متميزة، والقدرة على تصميم نموذج فعال هذا التقدم قبل سريريا ذات قيمة عالية. في هذا النموذج، يتم زرع الخلايا مباشرة في الفص البطني من البروستاتا في BALB / ج athymic الفئران، وسمحت للتقدم لمدة 4-6 أسابيع. في إنهاء التجربة، العديد من نقاط النهاية متميزة يمكن قياسها، مثل حجم والتوصيف الجزيئي للورم الأولية، فإن وجود وتقدير من الخلايا السرطانية المنتشرة في الدم ونخاع العظام، وتكوين ورم خبيث في الرئة. بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من النتائج النهائية، ويقدم هذا النموذج صورة لقدرة الخلايا على غزو والهروب من الجهاز الرئيسي، أدخل والبقاء على قيد الحياة في الدورة الدموية، وزرع وتنمو في موقع ثانوي. وقد استخدم هذا النموذج على نحو فعال لقياس النقيليردا على كل من التغيرات في تعبير البروتين وكذلك استجابة لعلاجات جزيء صغير، في فترة زمنية قصيرة.

Introduction

سرطان البروستاتا (PCA) هو السرطان الأكثر تشخيصا لدى الرجال، والسبب الرئيسي الثاني للوفاة بالسرطان في الولايات المتحدة ^1. الموت من PCA لا يعود إلى تشكيل الورم الرئيسي، وإنما تشكيل ورم خبيث. وبالتالي، والوقاية من ورم خبيث في المرضى له أهمية كبيرة. نماذج الماوس من PCA تقديم تنوع من الخيارات للكشف عن المعلومات البيولوجية الهامة حول هذا المرض.

مجموعة متنوعة من نماذج الماوس من PCA موجودة، ولكل منها مزايا والقصور الكامنة. في حين تردد في البشر PCA عالية، طبيعيا PCA غير شائع للغاية في الفئران ^2، على الرغم من قابلية متساوية من الفئران الشاملة لمرض السرطان ^3. استثناء واحد القوارض هو تطوير الشراكة والتعاون في الفئران Lobund ويستار، والتي يمكن أن تحقق معدلات PCA من 90٪ لمدة 12 شهرا من العمر عن طريق تحريض methylnitrosourea والتستوستيرون ^4. لهذا السبب، بفعل أنظمة النموذج، مثل TRAMPوتستخدم (غدية المعدلة وراثيا من الفأرة البروستاتا) نموذج شائع. يمكن للنموذج TRAMP لحث على التعبير التحوير وتحديدا في البروستاتا، ويخضع لتطور طبيعي لمحكمة التحكيم الدائمة، من تضخم البروستاتا ل[إينتربيثليل (PIN) إلى اللمفاوية وورم خبيث الرئوي ^5-6. هذه النماذج توفير فوائد أن تكون قادرة على قياس مجموعة كاملة من تطور الورم، وكذلك تحتوي على جهاز المناعة سليما. ومع ذلك، يمكن للأحداث الجزيئية الكامنة وراء تطوير PCA تختلف بين الفئران والبشر، ولقد أظهرت الارتباطات بين الفئران والدراسات السريرية الإنسان تقلب. بالإضافة إلى ذلك، كل من هذه النماذج هي مضيعة للوقت، على سبيل المثال يتطلب نموذج TRAMP حوالي 28 أسبوعا من أجل تطوير الانبثاث.

في دراسة ورم خبيث، ويستخدم في كثير من الأحيان الذيل الوريد أو الأيسر البطين النموذجية الحقن. هذا النموذج يستفيد من فترة زمنية سريعة، وبالإضافة إلى ذلك يمكن قياس وجود metastas العظامهو استخدام خطوط الخلايا المحددة والظروف. وأفادت يانغ وآخرون أن الحقن تحت الجلد من خلايا PC3-GFP إيجابية يمكن أن يسبب نطاق واسع الانبثاث العظام ^7، والذيل الوريد وحقن intercardiac قد ولدت أيضا الانبثاث العظام التنمية ^8-9. القيود الرئيسية من هذه النماذج تتصل عدم وجود الورم الرئيسي المقيمين داخل غدة البروستاتا نفسها. أبعد من ذلك، لنماذج تعتمد على حقن الخلايا السرطانية في الدورة الدموية، وهذا يتجاوز النصف الأول بأكمله من تتالي النقيلي. فإنه بذلك يحول دون النظر في الخطوات الأولية، بما في ذلك الغزو من خلال الجهاز الرئيسي، والتي هي بيولوجيا تدابير حاسمة من التحول النقيلي. العديد من المنظمين التحول النقيلي تؤثر بشكل مباشر على غزو الخلايا في وقت مبكر. خطوات مبكرة في تتالي النقيلي تشكل المواقع ذات الأولوية العالية لاستهداف العلاجية، ومرة ​​واحدة الخلايا السرطانية نشر، ويوسع الاختلاف نسيلي إلى حد كبير، وبالتالي زيادة البيولوجيةتنوع القاعدة وتناقص استهداف علاجية فعالة.

في محاولة للرد على العديد من القيود المفروضة على هذه النماذج، وقد وضعت مختبرنا نموذج مثلي من PCA الإنسان الذي هو مزروع خط الخلية PCA PC3-M الإنسان مباشرة في البروستاتا من BALB / ج athymic الفئران. بعد 4-6 أسابيع، وحجم الورم، وجود الخلايا السرطانية المنتشرة (التدرجي)، والانبثاث إلى الرئتين والغدد الليمفاوية يمكن أن يكون كميا فقط. وقد استخدمنا هذا النموذج فعال لتقييم فعالية 4 '،5،7-trihydroxyisoflavone (الجينيستين) لمنع الإنسان PCA الانبثاث ^10. وقد تم ربط الاستهلاك الغذائي من الجينيستين إلى انخفاض في البروستاتا ورم خبيث من السرطان والموت ^11-12، ولكن في السابق أي دراسة قد يحدد ما إذا بالإدارة من الجينيستين يمكن أن يغير PCA الانبثاث في الحيوانات أو الرجال. في هذه الدراسة أثبتنا أن العلاج مع الجينيستين انخفاض كبير في عدد من ورم خبيث في الرئة. بالإضافة إلى ذلك، نحن مصممون الجينيستين آلtered تفعيل والتعبير عن العديد من البروتينات المؤيدة للالمنتشر هاما في الورم الرئيسي، بما في ذلك التنسيق كيناز التصاق (FAK)، P38-mitogen تنشيط بروتين كيناز (P38 MAPK)، والحرارة صدمة بروتين 27 (HSP27).

يتفق مع نتائج هذه الملاحظات في العيادة. باستخدام الدم تم الحصول عليها من الفئران، كنا قادرين على قياس دقيق لتركيزات الدم من الجينيستين، ولاحظ هذه لتكون مماثلة لمستويات في البشر مع الاستهلاك الغذائي العادي للالجينيستين. بالإضافة إلى ذلك، دراسة المرحلة الثانية التي يقوم بها مجموعتنا قررت أن على العلاج مع الجينيستين، والرجال من ذوي الخبرة انخفاض في البروستاتا مرنا الأنسجة التعبير عن الجينات المرتبطة غزو الخلوية وورم خبيث، وتحديدا نوع مصفوفة الفلزي 2 (MMP-2) ^13.

وقد استخدمنا أيضا هذا النموذج لتقييم تأثير تغير التعبير الجيني المنتج في الورم الرئيسي على الإنسان PCA الانبثاث ^14. وsuppr الورمESSOR endoglin هو عضو في الفصيلة TGFβ ويقمع الغزو PCA الإنسان الخلوية في المختبر عن طريق تغيير صماد يشير ^15. نحن تمديد هذه الدراسات لتحديد تأثير الإنسان على endoglin الانبثاث محكمة التحكيم الدائمة. تم زرع مستقرة ضربة قاضية endoglin، مكافحة ناقلات الأمراض أو endoglin على خطوط الخلايا التعبير في الفئران. أظهرت Endoglin خلايا ضربة قاضية على أعلى عدد من الانبثاث الرئة، وكذلك التدرجي في 38٪ من الفئران. وأظهرت الفئران مزروع مع مكافحة النواقل استجابة متوسطة، مع أقل الانبثاث الرئة في الماوس، والتدرجي في 18٪ فقط من الفئران. وأظهرت الفئران عالية endoglin مزروع قمع كاملة تقريبا من ورم خبيث في الرئة، وقمع كاملة من التدرجي.

هذه ليست سوى مثالين من مجموعة واسعة من تطبيقات هذه التقنية لديها. من اكتشاف المخدرات، إلى التغييرات النمذجة في البيولوجيا الجزيئية، وهذا النموذج يقدم طريقة إنتاجية عالية لتقييم آثار وظائف مختلفة على نمو الورم والخلدالتغييرات cular، ووجود التدرجي، وتشكيل ورم خبيث في الرئة متميزة والغدد الليمفاوية.

Protocol

لجميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات، تمت الموافقة على البروتوكولات من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية (IACUC) في جامعة نورث وسترن. وقد لوحظت التقنيات الجراحية وشروط الرعاية البيطرية الحيوانية الموظفين وتعديلها لتقليل الإجهاد الحيوان أو وفيات. قد يكون المؤسسات الفردية متطلبات مختلفة وأنه من المهم العمل مع IACUC الحيوانية والموظفين عند وضع وتنفيذ هذه التقنية الجراحية.

1. إعداد الخلايا لحقن

1. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة في أقرب وقت ممكن لبدء عملية جراحية. يعرض للتريبسين الخلايا المستخدمة للتجربة، وإزالة من لوحة، وتحييد مع وسائل الاعلام. خط الخلية PC3-M الإنسان PCA ستابلي مع GFP وقد استخدم بنجاح لهذه التجارب، وذلك بسبب ظروف النمو السريع للخلايا PC3-M. وأضاف GFP لسهولة إضافية من الكشف عن ورم خبيث في الرئة في عينات أنسجة الرئة، وعزم السريع لالخلايا السرطانية مقابل الخلايا المناعية في الثقافات التي تم الحصول عليها من الدم ونخاع العظام لتحديد الخلايا السرطانية المنتشرة. إذا تعديل جين معين من الفائدة، ثم يتم تنفيذ إنشاء خطوط الخلايا مستقرة مع هذا التغيير الجيني الأولى، تليها ترنسفكأيشن وGFP. إذا GFP سوف يغير وظيفة هذا الجين من الفائدة، GFP يمكن حذفها. وهذا سيجعل الكشف عن الانبثاث الرئة أكثر صعوبة، ولكن لا تزال قابلة للتحقيق. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان استخدام تكنولوجيا التصوير محددة باستخدام علامات الفلورسنت، مثل IVIS القائم على luciferase المراسل، البروتينات الفلورية أخرى يمكن استخدامها بدلا من ذلك.
2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز × 225.
3. عزل 2.5 × 10 ⁵ خلايا، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز × 225.
4. إزالة طاف والخلايا resuspend في 20 ميكرولتر من ملحي معقم.
5. نضح تعليق خلية في حقنة 0.5 مل مع دائمة 28 ½ G إبرة (مستحسن: كيندال Monojet، كما تسببت الماركات الأخرى قضايا)، وضمان عدم الهواء يدخل آل إبرةأونج مع تعليق.
6. التفاف حقنة في رقائق العقيمة وتخزينها على الجليد حتى استخدامها.

2. زرع مثلي من خلايا سرطان البروستاتا البشرية

1. وتستخدم الذكور BALB / ج الفئران athymic 6-8 الاسبوع القديمة. الماوس الوزن المثالي للجراحة الجسم هو 19-21 غرام، وينبغي أن يسمح الفئران ليصل إلى ما لا يقل عن 18 غرام قبل الجراحة. حيوانات أصغر حجما من الناحية الفنية أكثر صعوبة للعمل على. الحيوانات الكبيرة تميل إلى تجربة حركية أبطأ من نمو الورم والانبثاث. وينبغي أن يضم الحيوانات في منشأة الحيوان أسبوع واحد على الأقل قبل الجراحة لتقليل الإجهاد الحيوان. اعتمادا على التصميم التجريبي، العلاج من تعاطي المخدرات قد تبدأ قبل أسبوع من الجراحة.
2. حقن ما قبل الجراحة ألم الدواء وفقا لتعليمات منشأة الحيوان. ويقترح 0.1 ملغ / كغ من وزن الجسم تحت الجلد باستخدام إبرة Buprenex 30 ½ G تعلق على حقنة 1 مل.
3. وضع الحيوانات في غرفة isoflurane ووانتظر حتى الحيوانات بشكل كاملnesthetized. ينبغي أن تكون هناك منعكس أخمص القدمين من العضلات حاضرا في هذه النقطة. ينصح بهذا الأسلوب، ولكن إذا غير متوفرة، وسائل أخرى للتخدير يمكن استخدامها وفقا لتعليمات منشأة الحيوان.
4. نقل الحيوانات من غرفة isoflurane وإلى إجراء غطاء العقيمة. وضع الحيوان في جهاز مخروط الأنف، وإعادة ضمان، هذا الحيوان تحت التخدير الكامل قبل المتابعة.
5. تطهير منطقة أسفل البطن مع فرك بتدين مع كرات القطن المعقم، ويمسح مع الكحول يمسح، ورذاذ النهائي مع حل بتدين. السماح ليجف.
6. مصنوع باستخدام مشرط معقم أو شحذ مقص جراحي معقم، شق البطن خط الوسط منخفضة من حوالي 3-4 مم. رفع بلطف المثانة باستخدام ملقط وتحديد الفص البطني من البروستاتا. وتقع هذه الفصوص اثنين مباشرة تحت المثانة. فإن بعض الفئران لديها طبقة صغيرة من الدهون التي تغطي البروستاتا التي يمكن نقلها برفق جانبا باستخدام مسحة القطن المعقم. Minimizه كل حركة من الأجهزة والجهاز العضلي إن أمكن.
7. ضخ 20 شباط حل الخلية في حجم غدة البروستاتا، والتقليل من التسرب وضمان لوحظ فقاعة صغيرة.
8. استبدال المثانة وإغلاق طبقة العضلات باستخدام 4.0 امتصاص الغرز VICRYL حيدة في نمط توقف بسيطة.
9. إغلاق طبقة الجلد باستخدام العقيمة المواد الغذائية 9 ملم.
10. إزالة الحيوان من التخدير isoflurane ورصد وحتى مستيقظا ويتحرك بشكل طبيعي. وضع على لوحة التدفئة خلال فترة الانتعاش.
11. إذا كان يتم إجراء عملية جراحية متعددة، وبين العمليات الجراحية، جميع الأدوات نظيفة مع الايثانول 70٪، وتعقيم التعقيم باستخدام الزجاج حبة. تسمح أدوات لتبرد تماما قبل الحيوان المقبل. لا إعادة خياطة الجروح، وكرات من القطن، أو مسحات معقمة.

3. مراقبة الحيوانات

1. إدارة الألم الدواء بناء على تعليمات منشأة الحيوان. 4 ساعة بالإدارة ما بعد الجراحة من جرعة واحدة من تحت الجلد ميلوكسيكام في 1 ملغ / كغ من وزن الجسم يوالغناء إبرة 30 ½ G تعلق على حقنة 1 مل ويقترح، تليها جرعة إضافية كل 12-24 ساعة لمدة 48 ساعة القادمة.
2. يمكن إزالة المواد الغذائية من الحيوانات 7-10 أيام بعد الجراحة مرة واحدة الجرح قد تلتئم.
3. مراقبة وزن الحيوان، واستهلاك الغذاء، وجس للأورام الفئران مرتين في الأسبوع حتى انتهاء التجربة. زيادة تردد تصل إلى كل يوم عندما تصبح الأورام مرئية للتحقق من الحيوانات تحت عبء الورم كبيرا أو الإكراه. هو الموت المبكر من هذا الطراز نظرا لعبء الورم الرئيسي كبيرة، كما يمكن أن الأورام الأولية منع تدفق البول، لذلك أي حيوانات مع خسارة أكبر من 15٪ من وزن الجسم أو الورم الرئيسي التوصل إلى قطرها 1.5 سم وينبغي necropsied على الفور ل منع انسداد المسالك البولية وفاة الحيوان.
4. رصد لحاجة لتخصيب إضافية للبيئة الحيوان. الإجهاد يزيد من الجراحة الاقتتال الحيوان. إضافة اثنين من أكواخ بلاستيكية في القفص بدلا من واحد وسلوك إضافيةآل تخصيب يمكن أن تقلل هذه الحوادث. مناقشة مع خيارات الكوادر البيطرية المتاحة في المنشأة يتم إيواء الحيوانات في. نظرا لعدم وجود الرموش على هذه السلالة من الفئران، لا ينصح أكواخ وتخصيب مصنوعة من الورق لأنها يمكن أن تهيج العينين.

4. إجراءات التشريح

1. بعد 4-6 أسابيع، والأورام واضحة تماما والحيوانات تبدأ في فقدان الوزن نتيجة لزيادة عبء الورم. يمكن عادة أن الأورام متلمس و / أو واضحة بصريا. يجب أن يتم تنفيذ التشريح عند هذه النقطة. إجراء حقن داخل الصفاق من Nembutal في 260 ملغ / كغ من وزن الجسم باستخدام إبرة قياس 30 ½ تعلق على حقنة 1 مل، والسماح الحيوانات لتصبح فاقد الوعي تماما، مع عدم وجود منعكس أخمص القدمين أو العضلات الحاضر.
2. مرة واحدة يتم تخدير الحيوان، وذلك باستخدام مقص جراحي معقم أو مشرط، وقطع أفقيا عبر الجذع من الحيوان مباشرة تحت القفص الصدري، ثم عموديا إلى الإبط على طول الجانب من الحيوان، فضح القلب. إجراء ثقب في القلب الطرفية باستخدام إبرة 30 ½ G تعلق على حقنة 1 مل مسح مع 4٪ سيترات الصوديوم في DPBS لمنع تجلط الدم، والحصول على أكبر قدر ممكن من الدم الحيوان.
3. إزالة الرئتين من الحيوان عن طريق قطع القصبة الهوائية مع مقص جراحي أو مشرط ووضع على الفور في شريط زراعة الأنسجة وإلى 10٪ من الفورمالين.
4. إزالة ورم البروستاتا الأساسي من هذا الحيوان عن طريق قطع أي الأوعية الدموية بشكل فردي تعلق على الورم وضمان عدم أجهزة إضافية مثل الأسهر أو الحويصلات المنوية والمرفقة.
5. تسجيل وزن وحجم الورم. قياس وزن الورم في غرام على نطاق المختبر. باستخدام الفرجار، وقياس طول أطول قطر الورم في سم، ومحور عمودي المقابلة. تتضاعف هذه القيم للحصول على حجم الورم. اعتمادا على الاستخدام المقصود، والمفاجئة تجميد فورا في النيتروجين السائل، و / أو مكان فيإلى الكاسيت الأنسجة في 10٪ من الفورمالين.
6. فضح مفاصل الورك والركبة مع مقص جراحي أو مشرط، وقطع مفاصل الساق، والحرص على الحفاظ على عظم الفخذ سليمة. إزالة عظام الفخذ من الحيوان ووضعه في ملحي معقم.
7. الحصول على أي أجهزة أو مواد ذات أهمية أخرى، والتخلص من الحيوانات وفقا لتعليمات المعهد الخاص بك. على وجه الخصوص، الغدد الليمفاوية الإقليمية تميل إلى أن تكون ورم خبيث، وتميل إلى أن توسع إذا إيوائهم، ويمكن حصاده. ومع ذلك، يجب توخي الحذر لأن هذا يمكن أن تتأثر بالتغيرات في الضغط الهيدروليكي الناجمة عن إجراء العمليات الجراحية.

5. تجهيز والمناعية من الرئة الأنسجة عينات

1. في غضون 24-48 ساعة من وضع الأنسجة في الفورمالين 10٪ في برنامج تلفزيوني، تضمين الرئتين في البارافين.
2. قسم الرئتين في 45 ميكرومتر أقسام خطوة، مع الأخذ 2-3 المتاخمة 4 ميكرون الرئة أقسام الأنسجة.
3. إذا استخدمت الخلايا GFP إيجابية (مستحسن)، نفذ المناعيةلGFP. إن لم يكن، أداء الهيماتوكسيلين القياسية ويوزين (H & E) تلطيخ.

ملاحظة: تم استخدام داكو تصور + كيت جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة GFP من إينفيتروجن بنجاح وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، ولكن هذا يمكن تعديلها لأي إجراء المناعية.

4. يسجل الانبثاث بطريقة أعمى. إذا GFP إيجابية، وسوف الخلايا السرطانية وصمة عار البني بالإضافة إلى وجود نواة كبيرة ومميزة. عند أول تسجيل ثانوي لورم خبيث، يجب استشارة الطبيب الشرعي للتأكد من التهديف الصحيح، واستخدام H & E أنسجة الرئة الملون لتأكيد وجود الخلايا السرطانية، وليس تسلل الخلايا المناعية.

6. تحديد الخلايا السرطانية المنتشرة من الدم ونخاع العظام

1. إضافة كافة الدم التي تم جمعها من التشريح إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل. الطرد المركزي 5 دقائق في 800 × ز.
2. إزالة البلازما وإضافة 1 مل ACK الاحتياطي تحلل (154.95 ملي كلوريد الأمونيوم، 9.99 ملي البوتاسيوم Bicarboنيت، 0.0995 ملي EDTA،). تسمح الدم للجلوس في درجة حرارة الغرفة 3-5 دقيقة.
3. الطرد المركزي 5 دقائق في 800 × ز.
4. إزالة طاف وإضافة 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية تحتوي على مضادات حيوية. إضافة الخلايا إلى قارورة T75 تحتوي على 9 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
5. خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO ₂ لمدة 10 يوما، والتحقق من وجود التدرجي كل 2-3 أيام.
6. لنخاع العظم، وإزالة جميع الأنسجة العضلية من عظام الفخذ باستخدام زوج من مقص، شفرة حلاقة، أو مشرط. إزالة نهايات العظام، وأقرب إلى نهايات ممكن.
7. باستخدام إبرة 23 ¾ G، إخراج بلطف نخاع العظم من عظم الفخذ إلى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي.
8. إضافة إلى 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية وماصة بلطف جيدا لخلط.
9. إضافة الخلايا إلى قارورة T75 تحتوي على 9 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية.

7. توصيف الجزيئي للأورام

1. لالبلمرة سلسلة من ردود الفعل (PCR) مقايسةق، والمسحوق عينات الورم الذي كانت المفاجئة مجمدة في النيتروجين السائل أولا على الثلج الجاف ثم المتجانس باستخدام الخالط الأنسجة لمدة 3-5 دقيقة مع 1 مل TRIzol. يتم تنفيذ استخراج TRIzol فقا لتعليمات الشركة الصانعة. تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام طقم العزلة RNeasy RNA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أداء التوليف [كدنا] في الوقت الحقيقي PCR الكمي (QRT / PCR) باستخدام الكواشف TaqMan وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ينصح ولكن يمكن تعديلها لأي طريقة PCR المستخدمة حاليا.
2. لفحوصات لطخة غربية، التجانس الأنسجة باستخدام الخالط الأنسجة لمدة 3-5 دقيقة مع 1 مل من تحلل العازلة: برنامج تلفزيوني (137 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي نا الفوسفات، و 2.7 ملي بوكل)، و 0.5٪ تريتون X-100، 1 ملم EDTA، 2.5 ملي بيروفوسفات الصوديوم، 1 ملم β-جليسروفوسفات، مع اضافة كوكتيل مثبط البروتياز، الفوسفات الكوكتيلات المانع 2 و 3 و 10 ملي فلوريد الصوديوم، و 1 ملي orthovanadate الصوديوم. يوضع الخليط المحللة الخلية في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل.
3. سنتrifuge خليط المحللة خلية لمدة 10 دقيقة في 13،000 ز س.
4. إزالة طاف ومكان في جديد 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي وطرد مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 13،000 ز س. إذا الحطام الخلية لا تزال موجودة، وهي خطوة إضافية الطرد المركزي لا يمكن أن يؤديها.
5. إزالة طاف وأداء لطخة غربية وفقا لظروف المختبر العادية.

النتائج

لهذه التجربة، وتبين لنا مجموعة ممثلة من الفئران التي تم الحصول عليها خلال هذه العمليات الجراحية. تم زرع خمسة الفئران بخلايا PC3-M-GFP إيجابية تحتوي على مكافحة النواقل. سمح أورام لتنمو لمدة ستة أسابيع، وبعد ذلك تم تقييم معلمات متعددة. في أرقام 1A و 1B، نقدم لك مجموعة من تغير في وزن الجسم واستهلاك الطعام من الفئران، على التوالي. هناك تراجع صغير في وزن الجسم واستهلاك الأغذية في جميع أنحاء تاريخ الجراحة بسبب التخدير. أثناء التجربة، ووزن الجسم يزيد ببطء بعد الجراحة، ثم يبدأ في الانخفاض في نهاية التجربة كما يصل عبء الورم مستوى حرج. ويقابل ذلك من خلال استهلاك الأغذية في هذه الفئران.

في أرقام 2A و 2B، وتظهر أحجام الورم ممثل التي حصل عليها. أحجام الورم الفردية تختلف، ولكن في المتوسط ​​نحقق أورام حوالي 1 غرام، معالتباين الطبيعي بين 0.5-1.5 غرام، وحجم الورم من 1 سم ^2، مع تباين طبيعية من 0.5-1.5 سم ^2. على الرغم من أن حجم الأورام يختلف، وهذه لا تتطابق مع عدد من ورم خبيث الناتجة، كما هو موضح في كل من هذه الورقة ونحن المصنفات المنشورة سابقا ^10. ومع ذلك، من هذا النموذج، يمكن للمرء تحديد تأثير العلاج من تعاطي المخدرات أو التغيرات الجزيئية على وزن الورم وحجمه. أحد الاعتبارات الهامة في هذا النموذج هو عندما نقطة النهاية المناسبة للتجربة هو. في أرقام 2C و 2D، وتبين لنا التغيرات في وزن الورم وحجم الورم في واحد بعينه PC3-M خط الخلية ستابلي مع GFP ومكافحة النواقل في 4 أسابيع وحتى 6 أسابيع. في الأسبوعين الماضيين، ارتفع متوسط ​​وزن الورم 2.7 أضعاف، وحجم الورم 1.9 أضعاف. وهذا يدل على إضافة 1-2 أسابيع اضافية على التجربة يمكن أن تؤثر بشكل كبير النتائج. كما العديد من العوامل يمكن أن يغير من نمو الأورام، بما في ذلكسن وحجم الفئران، وعدد من المقاطع من الخلايا، وغيرها ونحن نوصي لا تنتهي التجارب حتى لوحظ الأورام مرئية في الغالبية العظمى من الفئران.

في أرقام 3A-3C، وكميا في عدد من الانبثاث ثلاث طرق مختلفة. في الشكل 3A، يتم تمثيل العدد الكلي للخلايا PCA الإنسان GFP إيجابية. في الشكل 3B، وعدد من مواضع الخلية، أو المواقع التي توجد فيها ودائع النقيلي، يظهر. أخيرا، في الشكل 3C، على النحو المحدد من قبل مجموعة من الخلايا ملزمة بشكل واضح تبين 5 أو أكثر من الخلايا PCA الإنسان GFP إيجابية، يتم عرض عدد من ورم خبيث متميزة. وتظهر الصور ممثل هذه الظروف مختلفة في أرقام 4A-4D. في الشكل 4A، يتم تمييز خلية فردية في حجم 40X مع سهم. ملاحظة تلطيخ البني ونوى كبيرة متميزة. قسم الرئة المتاخمة الملون باستخدام H & E تلطيخهو مبين في الشكل 4B، مؤكدا أنه بدون GFP، والكشف عن الخلايا السرطانية لا تزال قابلة للتحقيق بسهولة. إن هذه الصورة مأخوذة في 40X حجم ويتم تمييز الخلايا مع سهم. في الشكل 4C، يتم عرض عدة مواضع متفاوتة في عدد الخلايا 10X حجم وأبرزت كل مكان مع سهم. . أخيرا، في الشكل 4D، يظهر وديعة النقيلي من 10 خلايا. كيف تؤثر هذه الأساليب يتم عرض البيانات من خلال أوجه الاختلاف في ماوس ماوس 1 و 3. الماوس 1 لديها عدد أقل من مجموع الخلايا في الرئة، بمتوسط ​​21.5 في خلايا الرئة القسم، مقارنة مع الفأر (3) الذي لديه متوسط ​​من 700 خلية لكل قسم الرئة. ومع ذلك، لديها عدد أقل من الماوس 3 مواضع، أو المواقع التي توجد فيها من الفأر 1 الخلايا. الماوس 3 لديه عدد قليل نسبيا من المواقع من ورم خبيث، ولكن عدد الخلايا في منطقة مرتفعة جدا في 82 خلايا لكل مواضع يرجع إلى عدة الانبثاث عدد الخلايا كبيرة جدا. في المقابل، ماوس 1 أكثر مواضع فريدة من نوعها، ولكن بشكل ملحوظ وخلايا الإبريق لكل موقع في فقط في المتوسط ​​خليتين لكل موقع. ويمكن لهذه المعايير مختلفة تسلط الضوء على حركية من خلايا تهريب إلى الرئة وقدرتها على تبدأ في النمو والتكاثر.

بالإضافة إلى ذلك، في الشكل 3D، وتبين لنا التغييرات في مجموع الخلايا المنتشر في الرئة في الفئران necropsied في أربعة مقابل ستة أسابيع. كما هو موضح في الشكلين 2C و 2D، لوحظ تغييرات كبيرة في الوزن وحجم الورم في الأسبوعين النهائية للتجربة. ولخص هذا في الشكل 3D. وأظهرت الفئران necropsied في أربعة أسابيع أي تطور المتنقل، في حين أظهرت الفئران في 6 أسابيع الخلايا المنتشر في جميع الفئران تقييمها. هذا يدل كذلك على أهمية ضمان يتم تنفيذ necropsies الفئران في نقطة نهاية وقت متأخر من مرحلة لضمان وقوع تشكيل ورم خبيث.

على قياس وأضاف في هذا النموذج هو التغيرات الجزيئية التي تحدث داخل الورم الرئيسي. في أرقام 5A-5C نظهر ثلاثة سبيل المثال التجارب QRT / PCR قياس ثلاثة جينات ذات أهمية في تطور المتنقل، نوع مصفوفة الفلزي 2 (MMP-2)، نوع مصفوفة الفلزي 9 (MMP-9)، والحرارة صدمة بروتين 27 (HSP27) على التوالي. ويمكن الكشف عن أي الجينات في المصالح تقاس عبر QRT / PCR باستخدام هذه التقنية. بالإضافة إلى ذلك، فإن مستويات البروتين يمكن أن يكون كميا باستخدام إجراءات لطخة غربية.

الشكل 1. وزن الجسم المرصود واستهلاك الغذاء في الحيوانات. AB) وزن الجسم في غرام، أو متوسط ​​الاستهلاك الغذائي في الماوس يوميا في غرام، يتم تسجيل كافة مراحل التجربة ويظهر في A) و B) على التوالي.

fig2highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50873/50873fig2.jpg "/>
الشكل 2. حجم الورم والوزن الورم في الفردي ومجموعات من الفئران. وترد AB) الوزن ورم في غرام وحجم الورم في سم مربع من خمسة السيطرة على الفئران ممثل ومتوسط ​​من الفئران خمسة في نهاية ستة أسابيع في A) و B) على التوالي. CD) مقارنة بين وزن الورم في غرام و حجم الورم في سم مربع بين مجموعات من الفئران necropsied في أربعة وستة أسابيع. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 3. انتشار المنتشر في الفردي ومجموعات من الفئران. AC) متوسط ​​sprea النقيليد في القسم الرئة لمدة خمس الفئران الفرد ومتوسط ​​من الفئران خمسة في نهاية ستة أسابيع ممثلة إما العدد الكلي للخلايا (A)، مواقع الخلايا المتنقل (B)، أو ورم خبيث متميزة كما حددتها 5 + الخلايا في كتلة محددة بوضوح (C). د) مقارنة بين متوسط ​​عدد الخلايا المتنقل في قسم الرئة في الفئران الفأر بين necropsied في أربعة وستة أسابيع. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 4. صور ممثل الانبثاث الرئة. أ) يتم تمييز أحد GFP إيجابية الخلايا الفردية في الرئة 40X الهدف مع سهم. ب) الرئة المجاورةقسم من أ)، والتي تبين الخلية نفسها تحت H & E تلطيخ. C) واحد قسم الرئة في 10X الهدف مع سبعة مواضع الفردية التي تحتوي على أعداد متفاوتة من الخلايا. D) واحد الانبثاث متميزة في 10X الهدف تحتوي على 10 الخلايا السرطانية محددة بوضوح كمجموعة واحدة.

الرقم 5. . تم إجراء تحليل PCR من ثلاثة جينات المنتشر في المصالح QRT / PCR على عينات الورم الفردية التي تم جمعها من الفئران في ستة أسابيع. مستويات مرنا نسخة النسبية MMP-2 (A)، يتم قياس MMP-9 (B)، وHSP27 (C)، لتطبيع GAPDH. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Discussion

في هذه الورقة نقدم نموذجا الفئران رواية الإنسان الانبثاث محكمة التحكيم الدائمة. في هذا النموذج، يتم زرع الإنسان PCA خطوط الخلايا PC3-M orthotopically مباشرة في البروستاتا من BALB / ج athymic الفئران والأورام يسمح لتطوير لمدة 4-6 أسابيع. في المقطع نتائج ممثل، وتبين لنا أمثلة من البيانات التي يمكن جمعها، بما في ذلك وزن الماوس والاستهلاك الغذائي، حجم الورم والوزن، والخصائص الجزيئية للورم، وتشكيل ورم خبيث متميزة إلى الرئة. بالإضافة إلى ذلك، مجموعة متنوعة واسعة من نواتج إضافية يمكن دراستها اعتمادا على الاهتمامات البحثية معينة. أحد الأمثلة على ذلك هو وجود التدرجي إلى الدم ونخاع العظام. كما التدرجي هي الحدث نادرة نسبيا (نلاحظ التدرجي في حوالي 5-20٪ من الحيوانات السيطرة)، كنا لا يستغرب أن أيا من الفئران خمسة في هذه التجارب المتقدمة التدرجي. وقد استخدمت لدينا مختبر أيضا هذا النموذج لتحديد التغييرات في التصاق الخلوية عن طريق قياس مورفولوجيا الخلايا النووية فيالبروستاتا الأنسجة ^10. علينا أيضا أن تستخدم هذا النموذج لتقييم انتشار الورم والخلايا الأولية باستخدام الوضع Ki67 والنفق تلطيخ للورم البروستاتا ^14.

بالإضافة إلى تشكيلة واسعة من نواتج البيانات التي يمكن الحصول عليها، ويمكن استخدام هذا النموذج لتحديد الآثار المترتبة على كلا من التغيرات في تعبير البروتين وكذلك العلاجات جزيء صغير. بالمقارنة مع العديد من الموديلات العفوية والتي يسببها الإنسان من ورم خبيث PCA، وهناك فترة زمنية أكبر من 4-6 أسابيع فقط. نماذج أخرى مع تحديد فترة زمنية عالية، مثل الوريد الذيل أو نماذج حقن intercardiac، يكون لها حدود لا الورم الرئيسي، وبالتالي لا تلخص تماما العيادة تتالي النقيلي. في نموذجنا، يجب أن الخلايا السرطانية الهروب من الموقع الأساسي المنشأ، أدخل والبقاء على قيد الحياة الدورة الدموية، وزرع في موقع ثانوي. وهذا يوفر خطوات إضافية في أي تدخل علاجي أو تغيير في تعبير البروتين يمكن أن تقدم لها تأثير. عديtionally، ينبغي وجود الورم الرئيسي سماح لتطبيق سهلة من هذا النموذج لتقنيات التصوير الجديدة مثل القائم على luciferase المراسل IVIS ^16-17.

على الرغم من مجموعة واسعة من الفوائد لهذا النموذج، وهناك أيضا العديد من القيود للنظر فيها. عدد متزايد من الدراسات تظهر أهمية جهاز المناعة في المكروية الورم ونمو الانبثاث ^18. في هذا النموذج، وذلك بسبب استخدام حيوان قارض athymic، والقدرة على تقييم آثار نظام المناعة غير ممكن. والقيد الثاني هو عدم وجود استجابة الاندروجين في خلايا PC3-M. بناء على التشخيص الأولي لمحكمة التحكيم الدائمة، والمرضى في كثير من الأحيان سيخضع العلاج الاندروجين كعلاج الخط الأول. ومع ذلك، سوف تصبح في نهاية المطاف سوف تبدأ المرضى مقاومة للالاندروجين والأورام في النمو مرة أخرى. كما تفتقر خلايا PC3-M مستقبلات الاندروجين، وهذا النموذج يقيس فقط آثار العلاج من تعاطي المخدرات أو البروتين التشكيل على بعد الاندروجين ج مقاومةANCER. وإن كان هذا هو وجود قيود، الاندروجين استجابة PCA حاليا التعامل بشكل جيد ولديه مجموعة متنوعة من خيارات العلاج الفعال، وأصبحت بالتالي مقاومة السرطان الاندروجين أكثر بروزا دراستها. كما يستخدم هذا النموذج تحديدا سلالة من الفئران الفطرية، مما يقلل الماوس لتقلب الماوس. ومع ذلك، قد تكون هذه السلالة تستجيب بشكل خاص لبروتينات معينة أو جزيئات صغيرة، وبالتالي ينبغي الحرص عند استقراء هذه البيانات الى العيادة.

على الرغم من هذا النموذج يوفر القياس الفعال للنجاعة الأدوية في وقت التحول السريع من 4-6 أسابيع، وهذا قد لا تأخذ في الاعتبار آثار المخدرات الجرعات طويلة الأجل. بعد التعرض لفترة طويلة لكثير من العلاجات المتاحة حاليا، والمرضى قد تعود مع السرطان المقاوم للأدوية سنوات عديدة بعد العلاج. التحول السريع من هذه التقنية لا تسمح لنمذجة الفعال لقدرة الورم لتصبح مقاومة للعلاج. ولكن، مع هذا التشكيل السابقperiment، وخلايا سرطان البروستاتا البشرية مقاومة للعلاج يمكن زرعها، وفعالية علاجية من الجيل الثاني في منع PCA نمو الورم والانبثاث يمكن أن تكون على غرار. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان يحاول مجموعة لدراسة التغيرات الجزيئية في الورم الرئيسي مع مرور الوقت، وهذا نموذج على المدى الطويل مثل نموذج TRAMP من المرجح أن تكون أكثر فعالية لتلك الدراسات.

قيود أخرى من هذا النموذج هو نشر الانبثاث متميزة فقط إلى الغدد الليمفاوية والرئتين من الحيوانات. كل من هذه المواقع هي مواقع متكررة وذات الصلة سريريا من ورم خبيث، كما يتضح من دراسات تشريح الجثة دافئة الإنسان ^19. ومع ذلك، سريريا الانبثاث العظام يشكل سمة بارزة من سمات PCA الإنسان، وبالتالي تلخص هذه النماذج هي التي تهم. للأسف، وهذه هي من الصعب أن ألخص في نموذج الفأر، مع عدد قليل جدا من النماذج التي تبين الانبثاث العظام دون الوريد الذيل، وحقن intercardial، أو زرع المباشر فيحتى العظم ^20. وبالتالي إذا استهدفت حتى العظم هو من أهمية التجريبية الرئيسية، قد يكون نموذج آخر أكثر فعالية. ومع ذلك، وهذا النموذج لا توفر قدرا من حركة المرور حتى العظم في شكل نخاع العظم الخلايا السرطانية المنتشرة.

على الرغم من هذه القيود، وهذا الأسلوب هو نموذج قوي من PCA الإنسان. القدرة على قياس التأثيرات على كل من الورم الرئيسي وكذلك تشكيل المنتشر في فترة زمنية قصيرة يوفر تشكيلة واسعة من التطبيقات. في هذا النموذج، يجب الهروب خلايا الجهاز الرئيسي، أدخل والبقاء على قيد الحياة في مجرى الدم، وزرع في موقع ثانوي، تلخص هذه العملية في البشر. قياس إضافية من الخصائص الجزيئية للورم الابتدائي، التغييرات في مورفولوجية الخلية، وجود الخلايا السرطانية المنتشرة يوفر نفسا واسعة من المعلومات من نموذج واحد. ويمكن استخدام هذا الإجراء على حد سواء في سياق اكتشاف المخدرات وكذلك لدراسة التغيرات في البيولوجيا الورم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip	Becton Dickinson	309659
23 G 3/4 Precison Glide Needle	Becton Dickinson	305143
30 G 1/2 Precision Glide Needle	Becton Dickinson	305106
Alcohol Wipes	Triad	10-3001
Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel	Becton Dickinson	427630
Clips, 9mm	VWR	15431-673
Convertors Polyline Towel (Sterile)	Cardinal Health	3520
Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft	Fisher	23-400-125
Curad Sterile Cotton Balls	VWR	500043-544
Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4")	VWR	95039-192
Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves	Cardinal Health	2D72PN70
Germinator 500	Cell Point Scientific	SN 7030
Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle	Tyco	1180528012
Medium Heating Pad	VWR	100229-094
Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2")	VWR	94000-000
Metric/English Vernier Caliper	VWR	19155-057
PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27"	Ethicon	Z304H
VetEquip Inhalation Anesthesia System			Contact Your Animal Facility for Availability
VWR Premium Tissue Cassettes	VWR	18000-010
VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2")	VWR	82027-440
Reagents
Betadine Surgical Scrub	Fisher Healthcare	19-027132
Buprenex			Controlled Substance - Obtain from Animal Facility
Dako DAB + Chromagen	Dako	K3468
Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit	Dako	K4003
Dako Envision Kit Protein Block	Dako	X0909
Formalin	VWR	95042-908
GFP Antibody	Invitrogen	A11122
Hematoxylin	Mayer	MH580-2.5L
Meloxican			Obtain from Animal Facility
Nembutal			Controlled Substance - Obtain from Animal Facility
Rneasy RNA Isolation Kit	Qiagen	74104
Sterile Saline			Obtain from Animal Facility
Taqman Reverse Transcription Reagents	Life Technologies	N8080234
TaqMan Universal PCR Master Mix	Life Technologies	4304437
Trizol	Invitrogen	10296