JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ونصف هنا استخدام متغير البروتين الفلوري الأخضر الحساس ل درجة الحموضة، وهو pHluorin، لدراسة الديناميات الزمانية للبصق لمستقبلات توجيه المحور العصبي التي تتاجر على سطح الخلية. يتم التعبير عن مستقبلات pHluorin الموسومة في كل من زراعة الخلايا وفي الجسم الحي، باستخدام الكهرومporation من جنين الفرخ.

Abstract

أثناء التطوير ، تلعب مستقبلات التوجيه المحوري دورا حاسما في تنظيم حساسية المحاور للإشارات الجذابة والبغيضة على حد سواء. في الواقع ، تفعيل مستقبلات التوجيه هو الخطوة الأولى من آليات الإشارات التي تسمح نصائح المحور المحور ، والمخاريط النمو ، للرد على ligands. على هذا النحو، وتعديل توافرها على سطح الخلية هي واحدة من الآليات التي تشارك في وضع حساسية مخروط النمو. نحن نصف هنا طريقة لتصور بدقة ديناميات سطح الخلية الصدغية من مستقبلات التوجيه المحوري على حد سواء في المختبر وفي الجسم الحي في الحبل الشوكي الفرخ النامية. لقد استفدنا من خاصية الفلورية المعتمدة على الحموضة لمتغير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) للكشف على وجه التحديد عن جزء مستقبلات توجيه المحور الذي يتم توجيهه إلى غشاء البلازما. نحن أول وصف التحقق من صحة في المختبر من هذه البنى التي تعتمد على الحموضة ونحن مزيد من التفصيل استخدامها في الجسم الحي، في وتر العمود الفقري الفرخ ، لتقييم ديناميات spatio الزمنية لمستقبلات التوجيه المحورية من الفائدة.

Introduction

أثناء الملاحة، تدمج المحاور إشارات بيئية متعددة توجهها نحو هدفها. هذه الإشارات تنشيط مستقبلات التوجيه على سطح محطات المحور، والمخاريط النمو، والتي بدورها بدء مسار الإشارات المناسبة. وهكذا، فإن التنظيم الزمني والمكاني لتوزيع سطح الخلية من المستقبلات أمر بالغ الأهمية لضبطحساسية مخروطالنمو 1 . في هذا السياق، عبور خط الوسط بواسطة محاور المحور commissural هو نموذج ممتاز للتحقيق في تنظيم مستويات سطح الخلية مستقبلات. في الحبل الشوكي النامي ، تنجذب المحاور المفوضة في البداية نحو لوحة الأرضية البطنية حيث تعبر خط الوسط. بعد العبور ، يفقدون استجابتهم لمجذبات لوحة الأرضية ويكتسبون استجابة لطاردات لوحة الأرضية حتى يتمكنوا من الخروج من لوحة الأرضية والتنقل نحو وجهتهم النهائية في الجانب المقابل من الجهاز العصبي2،3. تنظيم توافر مستقبلات على سطح مخروط النمو هي واحدة من الآليات الكامنة وراء التحول من الاستجابة إلى العظة خط الوسط4,5. وهكذا، الرصد الانتقائي للمستقبلات الموجودة في غشاء البلازما من المخاريط النمو هو من الأهمية بمكان. نحن نصف هنا طريقة تستند إلى خاصية الفلورية المعتمدة على الرقم الحموضة لمتغير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) لتصور مستقبلات توجيه المحور المحوري التي يتم توجيهها إلى غشاء البلازما في المختبر وفي الجسم الحي، في الحبل الشوكي الفرخ النامي.

روثمان وزملاؤه هندستها نقطة الطفرات المتغيرات الحساسة لHP من GFP بما في ذلك pHluorin الكسوف6. PHluorin Ecliptic لديه خاصية كونها غير فلورية عندما تتعرض لhh الحمضية (<6)، في حين يجري الفلورسنت في درجة الحموضة محايدة. وهذا يسمح التمييز بين مستقبلات nonfluorescent المترجمة في المقصورات الحمضية داخل الخلايا(أي الاندوسومات، والاتجار الحويصلات) من مستقبلات الفلورسنت أدرجت في غشاء البلازما وبالتالي تتعرض لHH محايدة خارج الخلية7. لقد استفدنا من ذلك لمراقبة توطين غشاء البلازما من plexinA1 ، وهو مستقبل توجيه محور التوسط استجابة مخروط النمو لطارد خط الوسط سيمافورين 3B5 (الشكل 1A). نحن نصف هنا التوصيف المختبري لبناء pHluorin-plexinA1 ، جنبا إلى جنب مع في ovo electroporation8-10 من هذا البناء في الحبل الشوكي الفرخ النامية تليها التحليل المجهري للخلايا المبردة التي تمكن من اتباع ديناميات مستقبلات التوجيه المحوري في الجسم الحي مع كل من القرارات المكانية والزمنية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. استراتيجية الاستنساخ إلى علامة مستقبلات PlexinA1 مع pHluorin

  1. اختيار ناقل التعبير المناسب باعتباره العمود الفقري(على سبيل المثال مستقبلات الماوس plexinA1 التعبير عن ناقلات، هدية نوع من الدكتور أندرياس Puschel11).
    ملاحظة: تم تصميم هذا المتجه plexinA1 لتحقيق كفاءة HA- أو VSV الموسومة مستقبلات الإدراج في غشاء البلازما.
  2. تضخيم بواسطة PCR تسلسل الترميز pHluorin ecliptic باستخدام البلازميد كافية كقالب (على سبيل المثال pHluorin الموسومة GABA A مستقبلات, هدية نوع من الدكتور يعقوب2). إذا لزم الأمر، إضافة موقع تقييد إلى نهاية 5 من التمهيدي من أجل تسهيل خطوة الاستنساخ في العمود الفقري.
  3. إدراج تسلسل pHluorin في إطار بين الببتيد إشارة وتسلسل الترميز مستقبلات باستخدام مواقع تقييد(على سبيل المثال NruI/Kpn2I مواقع تقييد كما هو موضح في الشكل 1B).
    ملاحظة: لأن الببتيد إشارة يضمن هو مشقوق الاستهداف الصحيح للمستقبلات، وينبغي وضع pHluorin بعد ذلك. وهذا يبرر الاعتراف الببتيد إشارة ويمنع انشقاق من pHluorin من مستقبلات الفائدة.
  4. تسلسل البنى التي تم الحصول عليها لضمان عدم إدخال أي طفرة من قبل PCR.

2. توصيف مستقبلات pHluorin الموسومة في المختبر في خلايا COS7

يمكن تأكيد قدرة بروتين الانصهار للوصول إلى غشاء البلازما وفقدانه القابل للعكس للفلورسينس مع خفض درجة الحموضة باستخدام الإجراء التالي.

  1. اليوم الأول. لوحة 1.5 × 105 خلايا COS7 في طبق 35 ملم الزجاج القاع في 2 مل من كامل Dulbecco تعديل النسر المتوسط (DMEM - 10٪ مصل البقر الجنيني - 1 mM الصوديوم بيروفات - 25 U/ml البنسلين / السترومايسين - 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B - pH 7.4).
  2. اليوم الثاني. خلايا العدوى:
    ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا التقاء 70-80٪.
    1. إعداد 200 ميكرولتر NaCl 150 mM وإضافة 3 ميكروغرام DNA أي مستقبلات ترميز المتجهات الموسومة بالهلوورين. دوامة بلطف وتدور لفترة وجيزة.
      ملاحظة: تظهر خريطة لمتجه pHluorin-plexinA1 المستخدم في هذه التجارب في الشكل 1B.
    2. إضافة 10 ميكرولتر من كاشف العدوى (أو الكمية المناسبة من الكاشف المستخدم). دوامة على الفور.
    3. احتضان 10 دقيقة في RT.
    4. إضافة 200 ميكرولتر من خليط الكاشف/ الحمض النووي إلى الخلايا.
    5. حرك اللوحة برفق لتحقيق إعادة تقسيم المزيج ووضع الخلايا مرة أخرى إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
  3. اليوم الثالث. إزالة متوسطة transfection واستبداله 2 مل من DMEM كاملة جديدة.
  4. اليوم الرابع إجراء تصوير حي للخلايا من الخلايا المصابة COS7 pHluorin-plexinA1:
    1. إعداد اثنين من aliquots من متوسطة كاملة DMEM وضبط درجة الحموضة إلى 3.5 و 9.5، على التوالي.
      ملاحظة: بالنسبة إلى لوحة واحدة مقاس 35 مم، يلزم 1.5 مل من كل محلول لإجراء التجربة.
    2. إزالة الخلية المتوسطة واستبدالها 1 مل من DMEM كاملة متوسطة الحموضة 7.4.
    3. إعداد حقنة 5 مل مع نوع مناسب من الأنابيب من أجل حقن مكونات مختلفة مباشرة في وسط ثقافة الخلية دون فتح غرفة المجهر.
    4. استخدم وحدة تسمح بصيانة جو عمل رطب 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
      ملاحظة: هناك نهج بديل لاستخدامغرفة ثاني أكسيد الكربون هو استخدام وسيطة ذات تخزين مؤقت HEPES (عادة في نطاق 10-25 mM وفقا لنوع الخلية).
    5. ضع الخلايا في الحجرة وضبط الأنابيب والمحقنة.
      ملاحظة: يجب أن يكون المجهر متساويا قبل البدء في تجنب الانجراف الميكانيكي أثناء التسجيل.
    6. افتح برنامج التصوير وحدد برنامج الاستحواذ متعدد الأبعاد.
    7. العثور على خلايا COS7 المصابة مع الهدف 40X ووضع علامة في البرنامج لكل واحد منهم.
    8. تكوين مكدس Z من أجل الحصول على عمق 15 ميكرومتر (يمكن أن يتغير التركيز عند إضافة وسائط في اللوحة).
    9. إعداد التعريض الضوئي لمرشح GFP والمرحلة.
    10. تكوين توقيت الاستحواذ.
      ملاحظة: للتجربة بأكملها مع 5 مجالات الاهتمام، واقتناء كل 20 ثانية لمدة 10 دقيقة ينبغي أن تكون كافية.
    11. ابدأ عملية الاستحواذ واضبط 5 صور تحكم في درجة الحموضة DMEM 7.4 متوسطة.
    12. وقفة الاستحواذ، وحقن 1.25 مل من درجة الحموضة 3.5 DMEM كاملة لتحقيق درجة الحموضة من 5.5 في وسط الثقافة، بمناسبة الحدث في البرنامج واستئناف الاستحواذ على 5 نقاط زمنية أخرى.
      ملاحظة: يجب أن تختفي الفلورسينس الخضراء تدريجيا.
    13. وقفة اقتناء، وحقن 1.2 مل من درجة الحموضة 9.5 DMEM كاملة لتحقيق درجة الحموضة 7.4 في وسط الثقافة، بمناسبة الحدث في البرنامج واستئناف الاستحواذ على 5 نقاط زمنية أخرى.
      ملاحظة: يجب أن يظهر الفلورسينس الأخضر مرة أخرى في غشاء البلازما.
    14. تحليل الصور.
      ويبين الشكل 2 الصور التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول من هذا القبيل مع بناء pHluorin-plexinA1.

3. في أوفو الكهربائية من pHluorin-plexinA1 بناء

  1. التعامل مع البيض قبل الكهرومporation:
    1. تخزين البيض المخصب في الثلاجة في 14 درجة مئوية حتى أسبوع واحد قبل الحضانة.
    2. احتضان البويضات عند 38.5 درجة مئوية (101.3 درجة فهرنهايت) في حاضنة ذات رطوبة مشبعة لمدة 50-52 ساعة حتى تصل الأجنة إلى المرحلة HH1412.
      ملاحظة: يجب وضع البويضات أفقيا أثناء الحضانة بحيث يتم وضع الجنين بشكل صحيح للكهرومporation ، العائمة على الجزء العلوي من الصفار. HH14 المرحلة مناسبة للحصول على التعبير عن البلازميدات في الخلايا العصبية المتمايزة في الحبل الشوكي وفي العقدة الجذر الظهري مع معدل البقاء على قيد الحياة المناسبة.
  2. الأجنة الكهربائية8-10:
    1. إعداد الكهرومبورات:
      1. إعداد البلازميدات الحمض النووي خالية من السموم الداخلية مع تركيز متفوقة على 2 ميكروغرام / ميكرولتر، لتكون قادرة على تمييعه كما التركيز المطلوب.
      2. سحب ما يكفي من الشعيرات الدموية الزجاجية لحقن حلول الحمض النووي المختلفة.
      3. إعداد برنامج تلفزيوني معقم (-Ca2+؛ -Mg2+) - 100 U/ml البنسلين/الستربتومايسين والاعتدال عند 38.5 درجة مئوية.
      4. تعقيم غطاء محرك السيارة، مقص منحني والمملقط الدقيق.
      5. التحكم في تباعد القطب الكهربائي.
        ملاحظة: يتم استخدام مسافة 4 مم بين الأقطاب الكهربائية بشكل عام.
    2. نافذة البيض13 (الشكل 3A):
      1. استخدام مقص منحني لثقب قذيفة على الجانب الحاد من البيض.
      2. إزالة 2 مل من الألبومين باستخدام إبرة 0.9 ملم × 25 ملم وحقنة 5 مل. توجيه الإبرة عموديا من أجل تجنب إتلاف كيس صفار.
      3. تغطية الجزء العلوي من البيض مع الشريط للحفاظ على سلامة قذيفة.
      4. باستخدام مقص منحني، اخترق قذيفة في منتصف الشريط لتحقيق المساواة في الضغط عند إزالة 2 مل من الألبومين من البيض. ثم، قطع نافذة كبيرة بما يكفي لتصور الجنين وتكون قادرة على العمل على ذلك.
      5. إضافة ~ 2 مل عقيمة برنامج تلفزيوني دافئ (-Ca2+؛ -Mg2+) - 100 U/ml البنسلين / streptomycin لتجنب جفاف الجنين وجعله أكثر سهولة للمتلاعب.
    3. حقن الحمض النووي و electroporate الجنين
      1. تمييع البلازميد في برنامج تلفزيوني (-Ca2+; -Mg2+) إلى تركيز بين 0.5-2 ميكروغرام / ميكرول وإضافة صبغة خضراء سريعة للوصول إلى تركيز نهائي 0.025٪. قم بتحميل مزيج الحمض النووي في الشعرية. ينصح باستخدام حاقن.
        ملاحظة: تحقق من أن مقاومة الشعرية ليست كبيرة جدا (مما يعني أنه قد تكون هناك صعوبات عند حقن الأجنة) ولا صغيرة جدا (مما يعني أن الشعرية يمكن أن تكون كبيرة جدا ويمكن أن تلحق الضرر بالجنين). أيضا، تركيز الأحماض النووية أعلى من 2 ميكروغرام / ميكرولتر قد يسبب آثار غير محددة ويحتاج إلى السيطرة عليها.
      2. ثقب كيس الصفار والإنبوب العصبي في الجانب caudal مع الشعيرات الدموية المحملة. أدخل الأنبوب العصبي بزاوية ضحلة وملء التجويف من الذيل إلى الرأس بمزيج الحمض النووي(الشكل 3B).
        ملاحظة: يسمح اللون الأخضر السريع بالتحكم في دقة الحقن.
      3. بسرعة وضع أقطاب البلاتين 4 ملم على جانبي الأنبوب العصبي في المستوى الذي ترغب في electroporate وتطبيق 3 نبضات في 31 V لمدة 50 msec مع فترات 500 msec (الشكل 3C).
        ملاحظة: تجنب وضع الأقطاب الكهربائية على القلب أو على الأوعية الجنينية الإضافية الكبيرة لتجنب إتلاف الجنين النامي. يجب أن تتشكل الفقاعات على الأقطاب الكهربائية.
      4. مع الإبرة، وإزالة 2 مل من الألبومين لتقليل مستوى في قذيفة.
      5. ختم النافذة والجانب حادة بإحكام مع الشريط.
      6. ضع البيض مرة أخرى عند 38.5 درجة مئوية في الحاضنة حتى تصل إلى المرحلة المطلوبة.

4. تضمين الأجنة والتبريد

  1. 48 ساعة بعد الكهرومporation، حصاد الأجنة الكهربائية بعناية (مرحلة HH24). قطع الشريط ونصف من غشاء المشيمية. لمنع الأجنة من الغرق في صفار، وضع مصفاة تحت الجنين وقطع النصف الثاني من غشاء chorioallantoid.
  2. نقل الجنين إلى طبق تشريح مليئة الجليد البارد PBS.
  3. تحقق من كفاءة الكهرومporation من خلال البحث عن الفلورسينس في الأنبوب العصبي مع مجهر ستيريو مضان.
    ملاحظة: قد يساعد الكهروضوئية من بلازميد التحكم ترميز RFP لتصور المنطقة electroporated.
  4. تشريح الأجنة باستخدام ميكروسكالبيل من أجل تحديد المنطقة الكهربية من الحبل الشوكي.
  5. نقل الأجنة تشريح إلى لوحة 24 جيدا وإصلاح في درجة الحموضة 7.4٪ بارافورمالديهايد (PFA) - الفوسفات العازلة المالحة (PBS)، O / N في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: خطوة التثبيت أمر بالغ الأهمية للسماح بتثبيت pHluorin في تشكيل "العيش" ، وبالتالي لتكون قادرة على استخدام pHluorin في الأنسجة الثابتة / permeabilized. على الرغم من أن التثبيت يبطئ التغيير المعتمد على الرقم الهيدروجيني بشكل كبير في الفلورسينس ، يجب على المرء أن يأخذ في الاعتبار أن التغيرات التوافقية / البروتونات لا تزال تحدث بعد التثبيت. وهكذا، يجب تنفيذ البروتوكول التالي (تضمين و cryosections و المراقبة) في غضون 3 أيام بعد خطوة التثبيت، مع كافة المخازن المؤقتة في 7 pH. إذا لم يكن التثبيت مطلوبا ، يوصى بإجراء مراقبة على أقسام الأنسجة الحية.
  6. إزالة 4٪ PFA وغسل الأجنة في pH 7.4 PBS.
  7. احتضان الأجنة في برنامج تلفزيوني-15٪ السكروز والحفاظ على 4 درجة مئوية حتى تغرق الأجنة.
  8. احتضان الأجنة الثابتة في درجة الحموضة 7.4 7.5٪ الجيلاتين- 15٪ السكروز لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية حتى يتم تضمين الأجنة تماما.
  9. وضع قوالب تضمين على الجليد وإضافة 400 ميكروغرام من درجة الحموضة 7.4 7.5٪ الجيلاتين- 15٪ السكروز لتحقيق قاعدة صلبة 2 ملم.
  10. يستنشق الجنين المضمن بطرف مقطوع ووضع الجنين على قاعدة الجيلاتين الصلبة.
  11. تغطية مع pH 7.4 7.5٪ الجيلاتين- 15٪ السكروز ووضع الجنين مع ملقط قبل الجيلاتين يقوي.
  12. مرة واحدة الجيلاتين الصلبة، وإعداد -40 درجة مئوية حمام ايزوبروبانول (استخدام الثلج الجاف أو النيتروجين السائل) وتجميد كتلة الجيلاتين لمدة 5 دقائق.
  13. إبقاء الكتل المجمدة عند -80 درجة مئوية.
  14. ضع الكتلة المجمدة عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
  15. إزالة القالب وإصلاح كتلة على تشاك مع متوسط غليكول البولي ايثيلين.
  16. مرة واحدة يتم إصلاح كتلة بإحكام، ووضع تشاك في نظام cryostat.
    ملاحظة: استخدم الشرائح المغلفة لتجنب فقدان الأنسجة أثناء التلطيخ.
  17. إجراء عمليات بكاء تسلسلية (عادة ما يتم إجراء عمليات 20 ميكرومترا من عمليات التبريد).
  18. دع عمليات التبريد تجف لمدة 15 دقيقة في RT.
    ملاحظة: يجب حماية عمليات الشفط بالتبريد من التعرض للضوء غير الضروري لتجنب تبييض مضان GFP.

5. التحليل المجهري للكريوزات

  1. إعادة ترطيب cryosections في رقم الحموضة 7.4 برنامج تلفزيوني في RT لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن أن تكون ملطخة نواة مع Hoechst.
  2. استخدام محلول Hoechst 0.5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني واحتضان cryosections لمدة 15 دقيقة.
  3. شطف الشرائح 3x مع pH 7.4 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  4. انتقل إلى تصاعد الانزلاق. يمكن استخدام محلول تركيب الكحول البولي فينيل 7.4 (أو أكثر أساسية) الذي يصلب O / N: ضع غطاء الغطاء بعناية لتجنب تكوين فقاعات الهواء بين الشريحة والأغطية.
  5. السماح للتصاعد المتوسطة تصلب O / N في 4 درجة مئوية في الظلام.
  6. استخدم مجهرا كونفوكوكال مقلوبا لتصور بروتين الاندماج pHluorin-plexinA1 بدقة: قم بإجراء z-stack عند الثقب الأمثل والدقة البصرية واستخدم عدسات 20X (NA 0.75) أو 40X (NA 1.3).
    ملاحظة: يمكن اكتشاف الهولورين بنفس المعلمات المستخدمة للكشف عن GFP(أي ذروة الانبعاثات عند 509 نانومتر). يتم تعريف إعدادات الإثارة الموجية ومرشح الكشف بشكل مثالي من خلال برنامج التصوير. يتم الكشف عن Hoechst بين 425-460 نانومتر (الإثارة في 405 نانومتر), يتم الكشف عن GFP أو pHluorin بين 485-545 نانومتر (الإثارة في 473 نانومتر) ويتم الكشف عن RFP بين 575-675 نانومتر (الإثارة في 559 نانومتر).

وتظهر الصور التمثيلية لpHluorin-plexinA1 والتعبير eGFP في الحبل الشوكي الجنين فرخ في الشكل 4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

figure-results-63
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 أ. مخطط خصائص الفلورية pHluorin-plexinA1 في سياق خلوي. PHluorin غير فلوورسينت في المقصورات داخل الخلايا حيث درجة الحموضة حمضية (<6) مثل في الحويولات الاتجار ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لمتابعة ديناميكيات مستقبلات توجيه المحور في كل من زراعة الخلايا وفي السياق التنموي للنخاع الشوكي للجنين الفرخ.

لتصميم بروتين دي نوفو pHluorin الموسومة، هناك نقطتين تحتاج إلى النظر فيما يتعلق باستراتيجية الاستنساخ. أولا، يجب أن تتعرض ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

ونشكر هوميرا نوابي وفريدريك موريت وإيزابيل سانياس على مساعدتهم. ويدعم هذا العمل من قبل CNRS، جمعية فرانسيز contre ليه Myopathies (AFM)، ANR YADDLE، لابيكس DevWeCan، لابكس القشرة، ERC يودا إلى V.C. يتم دعم C.D-B و A.J من قبل La Ligue contre le cancer وزمالات Labex DevWeCan على التوالي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
COS7 cellsATCCCRL-1651
DMEM GlutaMAXGIBCO61965-026
Sodium pyruvateGIBCO11360-039
Amphotericin BSigmaA2942
Fetal bovine serumGIBCO10270-106
Penicillin/StreptomycinGIBCO15140-122
Exgen500 reagentEuromedex FermentasET0250
PBS -Ca2+ -Mg2+GIBCO14190-094
Fast green dyeSigmaF7252
32% Paraformaldehyde aqueous solutionElectron Microscopy15714-SDilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution
Gelatin from cold water fish skinSigmaG7041
SucroseSigmaS0389
CryomountHistolab00890
Hoechst 34580InvitrogenH21486
Mowiol 4-88Fluka81381
Consumables
Bottom-glass 35 mm dishMatTekP35G-1.5-14-C
5 ml SyringeTerumoSS-05S
Needles 0.9 mm x 25 mmTerumoNN-2025R
CapillariesCMLPP230POcapillaries are stretched manually in the flame
Superfrost Plus SlidesThermo Scientific4951PLUS
Material
Curved scissorsFST129-10
MicroscalpelFST10316-14
ForcepsFSTDumont #5 REF#11254
Equipment/software
Time lapse microscopeZeissObserver 1
Temp module SPECON for Zeiss
CO2 module SPECON for Zeiss
Metamorph softwareMetamorph
Eggs incubatorSanyoMIR154
Electroporator apparatusNepa Gene CO., LTDCUY21
ElectrodesNepa Gene CO., LTDCUY611P7-44 mm platinum electrodes
Fluorescence stereomicroscopeLEICAMZ10F
CryostatMICROMHM550
Confocal microscopeOlympusFV1000, X81
Fluoview softwareOlympus
CLC Main Workbench softwareCLC Bio

References

  1. Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
  2. Jacob, T. C., et al. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
  3. Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
  4. Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
  5. Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
  6. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  7. Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
  8. Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
  9. Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
  10. Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
  11. Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
  12. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
  13. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
  14. Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
  15. Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
  16. Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
  17. Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
  18. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
  19. Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
  20. Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
  21. Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
  22. Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
  23. Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
  24. Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
  25. Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
  26. Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
  27. Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).
  28. Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
  29. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
  30. de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

83 pHluorin commissural Plexin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved