تقييم الكالسيوم سباركس السليمة في ألياف العضلات الهيكلية

Summary

الموصوفة هنا هو طريقة لقياس مباشرة الشرر الكالسيوم والوحدات الأولية للكا ^{2 +} الإفراج عن شبكية الهيولى العضلية في ألياف العضلات الهيكلية سليمة. يستخدم هذا الأسلوب الاسموزي-بوساطة التوتر اثار من كا ^{2 +} الإفراج عن مستقبلات ryanodine في ألياف العضلات المعزولة. ديناميات وقدرات التماثل الساكن داخل الخلايا كا ^{2 +} إشارات يمكن استخدامها لتقييم وظيفة عضلة في الصحة والمرض.

Abstract

الحفاظ على التماثل الساكن كا ^{2 +} إشارات عملية الفسيولوجية الأساسية في الخلايا الحية. كا ^{2 +} الشرر هي الوحدات الأساسية للكا ^{2 +} في اشارة ألياف العضلات المخططة التي تظهر المترجمة للغاية كما كا ^{2 +} الأحداث الإفراج بوساطة مستقبلات ryanodine (RYR) كا ^{2 +} الافراج عن القنوات على شبكية الهيولى العضلية (SR) الغشاء. يمكن أن التقييم السليم للعضلة كا ^{2 +} الشرر تقديم معلومات عن خصائص الخلايا كا ^{2 +} التعامل مع العضلات المخططة السليمة والمريضة. على الرغم من أن كا ^{2 +} الشرر وينظر عادة في الأحداث العضلية يستريح، ونادرا ما لوحظ أنهم في يستريح ألياف العضلات والهيكل العظمي، وبالتالي هناك حاجة لطرق لتوليد وتحليل الشرر في ألياف العضلات والهيكل العظمي.

مفصلة هنا هو بروتوكول التجريبية لقياس كا ^{2 +} الشرر في المثنية معزولة digitorm القصيرة (FDB) ألياف العضلات باستخدام وluorescent كا ^{2 +} المؤشرات والمسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهري. في هذا النهج، ويتعرض الألياف FDB معزولة للإجهاد hypoosmotic عابرة تليها العودة إلى الحل الفسيولوجية متساوي التوتر. في ظل هذه الظروف، قوية كا ^{2 +} الشرر يتم الكشف عن استجابة المجاورة للغشاء sarcolemmal في الشباب الأصحاء ألياف العضلات FDB. تغيير كا ^{2 +} الشرر يتم الكشف عن استجابة في التصنع أو الذين تتراوح أعمارهم بين ألياف العضلات والهيكل العظمي. وقد أثبت هذا النهج مؤخرا أن بعلامات غشاء إشارات تنطوي على عبر الحديث بين اينوزيتول (1،4،5) ثلاثي الفوسفات مستقبلات (IP ₃ R) وRYR يساهم في كا ^{2 +} تفعيل شرارة في العضلات والهيكل العظمي. باختصار، لدينا دراسات باستخدام الضغط الاسموزي يسببها كا ^{2 +} الشرر أظهرت أن هذا الرد يعكس داخل الخلايا العضلية مما يشير آلية في علم وظائف الأعضاء والشيخوخة / الحالات المرضية، بما في ذلك نماذج الماوس من ضمور العضلات (MDX الفئران) أو التصلب الوحشي الضموري (ALS نموذج).

Introduction

الخلايا الحرة كا ^{2 +} ([كا ^{2 +]} _ط) هو رسول الثانوية تنوعا والمهم الذي ينظم الوظائف الخلوية متعددة في الخلايا منفعل مثل الخلايا العصبية، القلب، والهيكل العظمي والعضلات الملساء (للمراجعة انظر Stutzmann وماتسون ^1). ينظم كا ^{2 +} تعبئة وعبر الحديث بين شبكية الهيولى العضلية (SR) وتي أنبوب صغير (تي تي) هي الأغشية المنظمين الأساسية للعلم وظائف الأعضاء العضلات. علاوة على ذلك، قد أظهرت تغيرات في كا ^{2 +} إشارات ليكون الآلية الكامنة وراء ضعف مقلص في أمراض العضلات المختلفة.

يتم ترجمة كا ^{2 +} الشرر الأحداث كا ^{2 +} الإفراج الابتدائية مصدرها افتتاح مستقبلات ryanodine (RYR) على قناة شبكية الهيولى العضلية (SR) غشاء ^2. في عضلة القلب، تحدث الشرر عفويا من خلال افتتاح قناة RyR2 من قبل كا ² يسببها ⁺ كا ^{2 +} RELEبورصة عمان (CICR) آلية ^3-5. في الهيكل العظمي والعضلات، ويتم التحكم بدقة RyR1 من قبل أجهزة الاستشعار الجهد في الغشاء ^6،7 ترينيداد وتوباغو. وبالتالي يتم منعها كا ^{2 +} الشرر ونادرا ما اكتشفت في ظروف يستريح في ألياف العضلات الهيكلية سليمة. حتى وقت قريب، الغشاء sarcolemmal اللازمة لأن تتعطل من قبل مختلف الطرق الكيميائية أو الميكانيكية "السلخ" إلى فك الارتباط بين قمع استشعار الجهد على RyR1 وسمح لكا ^{2 +} شرارة الأحداث إلى أن يتم الكشف في العضلات والهيكل العظمي ^8،9. أسلوب واحد هو موضح سابقا permeabilization المطلوبة للغشاء من الألياف العضلية قبل سابونين المنظفات ^10.

في عام 2003، اكتشفنا أن الإجهاد إما hypoosmotic عابرة أو إجهاد مفرط التناضح يمكن أن تحفز الطرفية كا ^{2 +} الشرر المجاورة للغشاء sarcolemmal في ألياف العضلات سليمة ^11. ومنذ ذلك الحين تم تعديل هذا الأسلوب لدراسة الآلية الجزيئية والتحوير من كا ^{2 +} إطلاق ديناميات ^و12-16. نحن هنا الخطوط العريضة لتفاصيل المنهج التجريبي لدينا لتحريض وكشف وتحليل كا ^{2 +} الشرر في الهيكل العظمي والعضلات سليمة. كما نقدم برنامج تحليلنا مبنية خصيصا الشرارة التي يمكن أن تستخدم لتحديد خصائص عنصر الفردية كا ^{2 +} الشرر في العضلات والهيكل العظمي، مثل التردد والسعة شرارة (Δ F/F0، مما يعكس احتمال فتح قنوات RYR و كا ^{2 +} الحمل داخل SR)؛ الوقت إلى الذروة (زمن الصعود) ومدة (FDHM، والمدة كاملة في نصف السعة القصوى) من الشرر، فضلا عن التوزيع المكاني للكا ^{2 +} الشرر. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم أدلة على أن الروابط تتغير كا ^{2 +} الشرر إلى مختلف الدول الفيزيولوجية المرضية في العضلات والهيكل العظمي، مثل ضمور العضلات والتصلب الوحشي الضموري.

وميزة هذا الأسلوب الذي ينطوي على القدرة على قياس كا ^{2 +} في undam نسبياخلايا العمر، بدلا من تجريد الألياف العضلية، مما يتيح تسجيل كا ^{2 +} الشرر في ظروف أقرب إلى الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، يوفر البرنامج مصمم خصيصا لدينا حسابات أكثر دقة من خصائص الشرارة فيما يتعلق ألياف العضلات.

Protocol

1. إنشاء التناضحي من الإجهاد نظام الإرواء

الرقم 1 هو بروتوكول التخطيطي من الكالسيوم الشرر التقييم في ألياف العضلات الهيكلية سليمة.

1. انشاء ثلاثة محاور (س ع ص) مياداة مجهرية قادرة على تحديد المواقع غيض مخرج نظام الارواء التي تحتوي على ما لا يقل عن اثنين من القنوات. وهذا يمكن أن يتم مع المتاح ليور-حقنة برميل مع إرفاق ثلاث - طريقة ليور - محبس لوك لتشغيل و / أو إيقاف تدفق حلول الارواء. وينبغي أن تكون هذه القنوات نضح القادرة على إيصال> 1 مل / دقيقة من الحل من خلال نضح طرف واحد مع> 0.2 مم.
2. تحميل قناتين للنظام الارواء، واحدة مع متساوي التوتر تايرود الحل والآخر مع منخفض التوتر تايرود الحل.

2. ألياف إعداد سليمة واحدة المثنية القصيرة للأصابع (FDB) من العضلات ماوس

1. إزالة القدم من الفأر الاتحاد الأوروبيthanized التالية المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة وIACUC باستخدام زوج من مقص تشريح الثقيلة من خلال قطع الساق فوق مفصل الكاحل.
2. دبوس القدم على غرفة تشريح مليئة الحد الأدنى كا ^{2 +} تايرود الحل مع السطح الأخمصي مواجهة.
3. تشريح FDB بقطع في وتر وسحب ما يصل على وتر لفصل العضلات من الأنسجة المحيطة بها بلطف.
4. الانتهاء من تشريح بقطع في وتر البعيدة حيث لها فروع في الأرقام الفردية في الطبقات العميقة من العضلات.
5. نقل العضلات FDB عن طريق التقاط بالملقط عبر الأوتار لتفادي أضرار إضافية إلى الألياف العضلية ووضع في أنبوب مع قسامة من إذابة كولاجيناز الهضم الحل prewarmed إلى 37 درجة مئوية.
6. احتضان الأنبوب الذي يحتوي FDB تستقيم على شاكر المداري في 37 درجة مئوية لمدة 60-90 دقيقة مع سرعة 160 دورة في الدقيقة. يحتاج هذا البروتوكول تفارق حزم العضلات لفحصها معمليا لسلالات مختلفة من الحيوانات، خصوصا بالنسبة لأولئك مرض / الألياف متحولة عرضة للضرر الغشاء.
7. نقل FDB هضمها في أنبوب مع 700 ميكرولتر من محلول متساوي التوتر تايرود ويسحن بلطف للافراج عن الألياف عن طريق رسم العضلات عدة مرات خلال سلسلة من 200 مل micropipette نصائح لتقليل قطرها تدريجيا عبر القطع مع شفرة حلاقة نظيفة لإزالة نصائح 200 مل micropipette. لتجنب إتلاف الألياف في عضلات ضعيفة لا سيما من المرض، تأكد من غيض هو مجرد كبيرة بما يكفي للسماح للحزمة الألياف بالمرور دون الالتصاق. لا قوة حزمة صغيرة جدا من خلال فتحة.
8. لوحة من الألياف FDB من خلال استغلال بلطف وإعادة التعليق الألياف FDB في الأنبوب ومن ثم استخلاص 70 مل (1/10 من مجموع الألياف) مع خفض 200 مل micropipette في وسط دلتا 35 مم TPG طبق يحتوي على 1 مل من متساوي التوتر تايرود الحل للحد من الانتشار في جميع أنحاء الطبق.
9. تحديد عدد من الألياف واحدة سليمة في دإيش باستخدام مجهر تشريح. إضافة مأخوذة إضافية من الألياف FDB الحصول 3-4 ألياف سليمة على الطبق.
10. تخزين ألياف إضافية العضلات المعزولة في 4 درجات مئوية وتستخدم في غضون 6 ساعة.

3. FLUO-04:00 صبغ التحميل وكا ^{2 +} التصوير (سباركس القياس)

1. نقل 500 مل من محلول متساوي التوتر تايرود من الطبق مع الألياف FDB في أنبوب مطلي مع 10 مل فلوو-4:00 الاسهم (1 ملم)، وخلط وإضافة إلى الطبق إلى النهائي فلوو-04:00 تركيز 10 ملي. بدلا من ذلك، يمكن استخدام حمض بلورونيك لزيادة كفاءة التحميل الصبغة.
2. تحميل لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
3. غسل الألياف عن طريق رسم بعناية 500 مل من فلوو-4-AM تحتوي متساوي التوتر تايرود الحل من الطبق مع 200 مل من البلاستيك المصقول، غيض micropipette واستبدالها مع حجم مساو من جديد متساوي التوتر تايرود الحل.
4. كرر هذه العملية 3 مرات أكثر.
5. لتصور وظيفة الميتوكوندريا، ونقل 500 مل من Isotoشركة الاستثمارات الوطنية تايرود الحل من الطبق مع الألياف FDB في أنبوب مع 5 مل TMRE الأسهم (1 ملم)، وخلط، وإضافة إلى طبق لتركيز النهائي من 50 نانومتر.
6. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
7. غسل الألياف عن طريق رسم بعناية 500 مل من TMRE المحتوية على متساوي التوتر تايرود الحل من الطبق مع تقطيعه 200 مل من البلاستيك micropipette غيض واستبدالها مع حجم مساو من جديد متساوي التوتر تايرود الحل.
8. كرر هذه العملية 3 مرات أكثر.
9. نقل الطبق إلى مجهر متحد البؤر وتحديد الألياف سليمة مع التصدعات واضحة وغشاء sarcolemmal السلس للتجريب.
10. ضع غيض من نظام نضح 400-500 ميكرون بعيدا عن الألياف العضلية المستهدفة وقبالة مركز التحكم باستخدام مياداة مجهرية.
11. بدء تدفق تايرود الحل متساوي التوتر لضمان يبقى الألياف FDB في المكان.
12. تسجيل إشارة مضان من فلوو-4:00 مع الهدف الغمر النفط 40X وتثير فلوو-4:00 معليزر الأرجون (الإثارة الطول الموجي 488 نانومتر) وانبعاث إشارات قياسية (الطول الموجي 510-580 نانومتر). شدة إشارة الفلورسنت يتناسب مع المستوى النسبي للتركيز الكالسيوم داخل الخلايا ^{2 +} ([كا ^{2 +]} _ط).
13. حمل كا ^{2 +} العابرين عن طريق تغيير الضغط الاسموزي من الحل خارج الخلية من أجل إنتاج التوتر الاسموزي على الألياف. في البداية يروي الألياف مع متساوي التوتر تايرود الحل (290 الميلي أسمول) (جمع الأساس لمدة 60 ثانية) ثم مع منخفض التوتر تايرود الحل (170 الميلي أسمول) لمدة 100 ثانية للحث على تورم. يروي الألياف FDB مرة أخرى مع حل متساوي التوتر تايرود. عموما، يتم تطبيق صدمة التناضحي واحد فقط إلى الألياف سليمة واحدة في واحدة دلتا TPG طبق والأحداث شرارة الماضي 10 دقيقة للحصول على البيانات.
14. سجل توطين المكاني للكا ^{2 +} الشرر (الشكل 2) باستخدام السلاسل الزمنية من س ص الصور ثنائية الأبعاد مع سرعة المسح الضوئي من 166 لبس] (خط في الثانية الواحدة، وعصامخط الفصل تتألف من 512 بكسل مما أدى إلى 3.08 ثانية / الإطار) لكل حالة متساوي التوتر (1 دقيقة)، والإجهاد ناقص التوتر (100 ثانية) وإجهاد ما بعد ناقص التوتر (5 دقائق). متجر إشارات للتحليل غير متصل لتقييم التوزيع وتواتر كا ^{2 +} الشرر بعد الانتهاء من التجربة.
15. العثور على الألياف الجديدة على طبق جديد واتبع نفس البروتوكول صدمة التناضحي للحث كا ^{2 +} العابرين. استخدام فحص خط متحد البؤر (XT) واسطة (512 بكسل في الطول، ومعدل العينة من 2 ميللي ثانية / خط مسح لتسجيل كا ^{2 +} العابرين لدقيقة واحدة (أي 30،000 خطوط) مع خط مسح متحد البؤر وضعها مباشرة تحت الغشاء sarcolemmal (الشكل 3 ). تغيير خط مسح لطائرات التنسيق المختلفة لتسجيل ثلاث مجموعات متسلسلة (على فترات 1 دقيقة) من linescans لتحليل حجم وحركية فردية كا ^{2 +} الشرر.

4. تحليل البيانات

1. جمع عدد كبير منخط XT مسح آثار لتقييم التشكل وحركية فردية كا ^{2 +} الشرر المعلمات، أي السعة (F / F _0؛ حيث F ₀ هو يستريح كا ^{2 +} مضان)، وارتفاع الوقت، والوقت إلى الذروة ومدتها (FDHM ومدة كاملة بنصف الحجم)، والعرض المكانية (FWHM، العرض الكامل بنصف حجم) من الشرر المسجلة. وتمثل هذه المعايير خصائص النابضة الأساسية للRYR كا ^{2 +} قنوات مثل كا ^{2 +} تدفق (السعة)، وحركية النابضة من RYRs (مدة).
2. تحليل بيانات الصور الرقمية مع، خوارزمية شبه التلقائي المطورة المخصصة التي تم إنشاؤها باستخدام لغة معالجة الصور IDL (التفاعلية اللغة البيانات)، كما هو موضح سابقا ^11،16. لأن حركية فريدة من كا ^{2 +} اطلاق سراح في قضية كا ^{2 +} الشرر الناجم في الألياف FDB عن الإجهاد ناضح، فمن الأفضل أن تجمع بين ميزات اليدوي والآلي من كا ^{2 +} شرارة الأحداثتحديد ومعالجة هذه البرامج مع تحليل صورة مخصصة والبناء ^11. هذه الخوارزمية مفيد جدا عندما يكون ضروريا لتحديد العائد على الاستثمار (منطقة الفائدة) يدويا في بعض النماذج مرض في العضلات. مرة واحدة يتم تعريف العائد على الاستثمار، يمكن أن خوارزمية اشتقاق المعلمات شرارة المذكورة أعلاه والتي يمكن بعد ذلك تصديرها إلى ملف Excel تلقائيا. بدلا من ذلك، تتوفر برامج معالجة الصورة العامة، على سبيل المثال SparkMaster في ImageJ، يمكن أن تستخدم لتحديد الخصائص الحركية للكا ^{2 +} الشرر وتوزيعها المكاني في الهيكل العظمي والعضلات ^17.

النتائج

وأظهرت دراسات سابقة أن الإجهاد الناجم عن hypoosmotic عابرة هامشية كا ^{2 +} شرارات مجاورة لغشاء sarcolemmal في ألياف العضلات سليمة يظهر ^11. الشكل 1 الصور من ألياف عضلة واحدة سليمة مع سلس غشاء sarcolemmal والتصدعات واضحة مميزة. يبين الشكل 2 نموذجي كا ^{2 +} وق...

Discussion

هذه الطريقة في تقييم كا ^{2 +} الشرر في الهيكل العظمي والعضلات سليمة هو أداة مفيدة لعلم وظائف الأعضاء والعضلات بحوث الأمراض. أظهرنا أن الاستجابة كا ^{2 +} شرارة تم تغيير في ظروف مختلفة، بما في ذلك ضمور العضلات ^11، والشيخوخة، ^{18، _19،} وكذلك في التصلب ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate.
60 mm glass Petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator	Narishige International	MHW-3
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation