Submillisecond بتكوين جزئي التغييرات في البروتينات حلها بواسطة شعاع ضوحراري الإمالة

Summary

نحن هنا الإبلاغ عن تطبيق تقنية انحراف شعاع حراري ضوئي؛ بالاشتراك مع مركب الكالسيوم في قفص، DM-nitrophen، لرصد ميكروثانية وميلي ثانية واحدة ديناميكية و طاقة من التغييرات الهيكلية المرتبطة ارتباط الكالسيوم إلى الخلايا العصبية جهاز استشعار الكالسيوم، العنصر التنظيمي المصب خصم المغير .

Abstract

ضوحراري شعاع انحراف معا مع الصورة الصوتية الكالوري وصريف الحرارية ينتمي إلى عائلة من أساليب حراري ضوئي؛ التي ترصد حجم والمحتوى الحراري تغييرات التوقيت الشخصى الضوء الناجم عن التغيرات متعلق بتكوين جزئي في البروتينات على ميكروثانية إلى ميلي ثانية واحدة وقت القشور التي لا يمكن الوصول إليها باستخدام محطة التقليدية أدوات التدفق. بالإضافة إلى ذلك، منذ يتم بحثها التغييرات الشاملة في حجم و / أو المحتوى الحراري، وهذه التقنيات يمكن تطبيقها على البروتينات والجزيئات الكبيرة الحيوية الأخرى التي تفتقر إلى fluorophore وأو تسمية حامل اللون. لرصد ديناميات وعلم الطاقة من التغييرات الهيكلية المرتبطة كا ^{2 +} ملزمة لمحولات الكالسيوم، مثل أجهزة الاستشعار الكالسيوم العصبية، وهو مركب الكالسيوم في قفص، DM-nitrophen، ويعمل على الصورة الزناد زيادة سريعة (τ <20 μsec) في الكالسيوم الحرة يتم بحثها تركيز وحجم والمحتوى الحراري المرتبطة التغييرات باستخدام شعاع حراري ضوئي؛ تقنية انحراف.

Introduction

أساليب الصورة الحرارية مثل الكالوري الضوئي، شعاع حراري ضوئي؛ انحراف (PDB)، وصريف عابرة إلى جانب الإثارة الليزر النانوسيكند تمثل بديلا قويا لعابرة spectroscopies البصرية للدراسات وقت حل وسيطة قصيرة الأجل ^1،2. وعلى النقيض من التقنيات البصرية، مثل امتصاص الأشعة تحت الحمراء الطيفي وعابرة، التي ترصد الشخصى الوقت من التغييرات في امتصاص حامل اللون المحيطة بها؛ تقنيات حراري ضوئي؛ كشف عن الاعتماد وقت التغييرات الحرارة / حجم، وبالتالي هي أدوات قيمة للتحقيق في وقت لمحات بصريا عمليات "الصامتة". حتى الآن، وقد تم تطبيق الكالوري الضوئي وصريف عابرة بنجاح لدراسة ديناميكية بتكوين جزئي للعمليات التي يسببها الصورة بما في ذلك الهجرة ثنائي الذرة يجند في globins ^3،4، تفاعلات البروتين يجند مع مستشعر الاوكسجين FixL ^5، والإلكترون والبروتون النقل في الهيم والنحاس oxidases ⁶ والثانية الضوئي الثاني وكذلك الصور المماكبة في رودوبسين ⁷ وديناميكية بتكوين جزئي في cryptochrome ^8.

إلى التوسع في تطبيق التقنيات حراري ضوئي؛ لالنظم البيولوجية التي تفتقر لحامل اللون الداخلي و / أو fluorophore، تم الجمع بين تقنية PBD مع استخدام مركب قفص على الصورة الزناد زيادة في تركيز يجند / الركيزة في غضون بضع ميكروثانية أو أسرع، وهذا يتوقف على مجمع في قفص. يسمح هذا النهج رصد ديناميات وعلم الطاقة من التغييرات الهيكلية المرتبطة يجند / الركيزة ملزمة للبروتينات التي تفتقر إلى fluorophore الداخلية أو حامل اللون وعلى الوقت النطاق التي لا يمكن الوصول إليها عن طريق الأدوات توقف تدفق التجارية. هنا طلب من PBD لرصد الديناميكا الحرارية للمجمع القفص، كا ^{2 +} DM-nitrophen، الصور الانقسام وكذلك حركية لكا ^{2 +} الجمعيات إلى المجال C-محطة للاستشعار الكالسيوم العصبية داونوتقدم تيار التنظيمية العنصر خصم المغير (DREAM). كا ^{2 +} هو من كا اطلاق سراحهم الصورة ^{2 +} DM-nitrophen في غضون 10 μsec وrebinds إلى قفص unphotolysed مع ثابت وقت ~ 300 μsec. من ناحية أخرى، في حضور apoDREAM لوحظ حدوث الحركية الإضافية التي تحدث على نطاق وميلي ثانية واحدة وقت ويعكس يجند ملزمة للبروتين. وقد تم تطبيق PBD للتحقيق التحولات متعلق بتكوين جزئي في النظم البيولوجية محدودة نوعا ما بسبب الصعوبات فعال؛ المحاذاة مثل شاقة لجنة التحقيق ومضخة شعاع لتحقيق PBD إشارة قوية وقابلة للتكرار. ومع ذلك، فإن تصميم دقيق من الأجهزة انشاء، ومراقبة دقيقة لدرجة الحرارة، والمحاذاة حذرا من لجنة التحقيق ومضخة شعاع توفير إشارة متسقة وقوية PBD التي تسمح رصد حجم الوقت حل والتغيرات في المحتوى الحراري على نطاق واسع المقياس الزمني من 10 μsec إلى ما يقرب من 200 ميللي ثانية. بالإضافة إلى ذلك، modifications من إجراء التجارب لضمان الكشف عن العينة ومرجعية آثار تحت درجة حرارة متطابقة، وتكوين العازلة، والتوجه الخلايا البصرية، وقوة الليزر، الخ يخفف كثيرا من الخطأ التجريبي في حجم رد الفعل قياس والمحتوى الحراري.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. عينة الاستعدادات

1. تنفيذ إعداد العينات وجميع التلاعب العينة في غرفة مظلمة لمنع حدوث uncaging غير المرغوب فيها.
2. ذوبان DM-nitrophen ((1 - (2-4-نيترو ،5-ديميثوكسي فنيل) - N، N، N '، N' tetrakis [(أوكسي كربونيل) الميثيل] -1،2-ethanediamine) في 50 ملي HEPES العازلة، 100 ملي بوكل، ودرجة الحموضة 7.0 إلى تركيز النهائي من 400 ميكرومتر (ε = _350nm 4330 M ^-1 سم ^{-1 9).}
3. إضافة و CaCl ₂ من محلول المخزون 0.1 M إلى تحقيق نسبة مرغوب فيه من [كا ^{2 +]:} [DM-nitrophen]. لبروتينات مع _د K لكا ^{2 +} جمعية أكبر من 10 ميكرومتر، نسبة [كا ^{2 +]:} [DM-nitrophen] 1:1 هو الأفضل لمنع ملزم من الكالسيوم اطلاق سراحهم الصورة ^{2 +} لuncaged DM-nitrophen . في الواقع، بالنظر إلى قيمة K _د للDM-nitrophen أن يكون 10 نانومتر والتركيز الكلي للDM-nitrophen وكا ^{2 +} لتكون 400 ملم، ~ 90٪ من الكالسيوم بروتين ملزمةمع _د K = 10 ميكرومتر سوف تكون في apoform. من ناحية أخرى، لدراسة كا ^{2 +} ملزمة للبروتينات مع K _د <10 ميكرومتر، فمن الأفضل أن تقلل من [كا ^{2 +]:} [DM-nitrophen] النسبة إلى 0.95 لمنع كا ^{2 +} complexation مع الاشتقاق البروتين قبل القفص الصور التفكك.
4. ذوبان مجمع المرجعية، K ₃ [الحديد (III) (CN) _6] أو نا ₂ CRO _4، في نفس المخزن المؤقت بالنسبة للعينة.

2. إعداد التجربة

1. ويظهر التكوين التجريبية الأساسية في الشكل 2.
2. استخدام ثقب دبوس (P ₂₎ لضبط قطر شعاع التحقيق (632 نانومتر خرج من قال ني الليزر، ~ 5 ميغاواط قوة الليزر) إلى 1 مم ونشر شعاع التحقيق من خلال مركز خلية وضعها في درجة حرارة تسيطر حامل الخلية باستخدام M ₁ المرآة.
3. استخدام المرآة (م ₂₎ وراء العينة إلى مركز شعاع التحقيقعلى مركزا للكشف عن موقف حساس.
4. تركيز شعاع التحقيق على مركز للكشف في مثل هذه الطريقة أن الفرق في الجهد بين أعلى اثنين من الثنائيات وأسفل اثنين من الثنائيات وكذلك الفرق في الجهد بين الثنائيات اثنين على الجانب الأيسر والأيمن من كاشف هو صفر.
5. في وقت لاحق، تشكيل قطر شعاع مضخة، وإخراج 355 نانومتر من Q-تحول الثانية: YAG الليزر، FWHM 5 NSEC) باستخدام 3 مم الثقب (P ₁₎ وضعت بين اثنين من المرايا ليزر 355 نانومتر.
6. Copropagate شعاع مضخة من خلال مركز كفيت كما هو موضح في الشكل 2. من المهم أن يتم نشر كل من أشعة الليزر من خلال مركز الخلية الضوئية بطريقة colinear تقريبا للحصول على زاوية انحراف قابلة للقياس، وبالتالي السعة العالية للإشارة PBD. تحت ظروف تجريبية، زاوية تقاطع التحقيق ومضخة الحزم هو أقل من 15 درجة.
7. استخدام مركب إشارة إلى محاذاة التحقيق ومضخةشعاع لتحقيق إشارة PBD مرضية، أي نسبة S / N جيدة ومستقرة PBD السعة على نطاقات زمنية أطول (~ 100 مللي ثانية).
8. ضبط الموقف من شعاع مضخة فيما يتعلق شعاع التحقيق قبل التعديل الإضافية من 355 نانومتر ليزر المرايا.
9. قياس السعة للإشارة المرجعية PBD باعتبارها الفرق بين اثنين من أعلى وأسفل فوتوديوديس على كاشف الحساسة الموقف. إشارة PBD ينبغي أن يحمل على الزيادة السريعة في السعة على النطاق وقت سريع (<10 μsec) وتظل مستقرة على 100 ​​ميللي ثانية الزمني كما هو موضح في الشكل 3. لقطة لتقلب النار من السعة PDB هو في حدود 5٪ من السعة إشارة ويتأثر أساسا استنساخ إشارة من الاهتزازات.
10. تحقق الخطي في إشارة السعة PBD فيما يتعلق الطاقة الحرارية الصادرة عن قياس الاعتماد الخطي للإشارة PBD على قوة الإثارة ليزر وعلى عدد من آينشتاين استيعابها، E _و= ^(1-10-A)، حيث A يتوافق مع الامتصاصية المرجعية في الطول الموجي الإثارة.
11. الحفاظ على قوة الليزر أدناه حوالي 1،000 μJ والامتصاصية للمجمع عينة / المرجع في الطول الموجي الإثارة أقل من 0.5 لمنع امتصاص multiphoton وانخفاض القوة مضخة شعاع، على التوالي، وضمان الخطي للإشارة PBD.

3. PBD القياسات

1. تبدأ مع قياس آثار PBD للمرجعية. وضع حل للمجمع الإشارة في 1.0 سم × 1.0 سم أو 1.0 سم خلية الكوارتز × 0.5 سم ووضع الخلايا في درجة حرارة حامل للرقابة. تقديم كل من أطوال مسار مشابه PBD السعة.
2. الكشف عن إشارة PBD المرجعية بوصفها وظيفة من درجة الحرارة في نطاق درجة حرارة 16-35 درجة مئوية مع الزيادة في درجة الحرارة 3 درجات مئوية.
3. عند كل تغير في درجة الحرارة، والتحقق من موقف شعاع التحقيق على كشف الحساسة الموقف وإعادةضبط الموقف إلى مركز للكشف إذا لزم الأمر.
4. تحقق الخطي للإشارة PBD بوصفها وظيفة من [(DN / دينارا) / C _ع ρ] المدى وفقا للمعادلة 2.
5. وضع محلول العينة في الخلية الضوئية نفسها بالنسبة للمجمع المرجعية الحفاظ على نفس التوجه للخلية الضوئية حيث لقياس مرجعية.
6. الكشف عن آثار PBD العينة في نطاق درجات الحرارة لنفس المرجع والتحقق من الخطي من السعة عينة PBD فيما يتعلق [(DN / دينارا) / C _ع ρ] المدى.

4. تحليل البيانات

حجم الانحراف يتناسب طرديا مع حجم التغيير بسبب التدفئة العينة (ΔV _عشر) وتغير حجم nonthermal (ΔV _nonth) وفقا للمعادلة 1:

اتساع العينة (A _Sيمكن وصفها) والمرجع (A _ص) إشارة PBD باستخدام معادلات 2 و 3، على التوالي.

إشارة PBD يتناسب طرديا مع المعلمة استجابة الصك (K) وعدد آينشتاين استيعابها (E _أ). الفصل الدراسي الأول في المعادلة 2، (DN / ت) (1/ρC _ع) س، يتوافق مع تغير إشارة بسبب الحرارة المنبعثة إلى المذيبات. يمثل DN / دينارا المدى التغيير التي تعتمد على درجة الحرارة في معامل الانكسار، ρ هي كثافة المذيب، C _p هو قدرة الحرارة. ومن المعروف أن جميع المعلمات من أجل الماء المقطر ويمكن تحديد لحل العازلة بمقارنة إشارة PBD لمجمع الإشارة في الماء المقطر وجود مخزن مؤقت المناسبة. س هو مقدار رجع الحرارةد للمذيب. وρ (DN / د ρ) المدى هو ثابت وحدة أقل وهذا هو درجات الحرارة مستقلة في نطاق درجة حرارة 10-40 درجة مئوية ^10. يقابل مصطلح _{القيمة المطلقة} Δn إلى تغيير في معامل الانكسار بسبب وجود امتصاص الأنواع في الحل وانها لا تذكر إذا ما تحولت الطول الموجي للشعاع التحقيق بالنسبة إلى أطياف امتصاص أي نوع من الأنواع في الحل. وأعرب عن إشارة الناشئة عن مجمع المرجعية _(ص) من خلال المعادلة 3 حيث E _{ح ν} هو طاقة الفوتون على طول موجة الإثارة، E _{ح ν} = 80.5 كيلو كالوري / مول ل355 نانومتر الإثارة.

1. اتخاذ اتساع إشارة مرجعية PBD بالفرق بين pretrigger وآخر إشارة الزناد PBD كما هو موضح في الشكل 3. بطريقة مماثلة، وتحديد السعة من الصيام (A _و ^سريع) ومرحلة بطيئة (A _ق ^بطيئة) للإشارة عينة PBD.
2. للقضاء على المعلمة استجابة الصك، K، قياس السعة للإشارة عينة PBD من السعة للإشارة PBD للمرجعية. نسبة الإشارة إلى عينة إشارة مرجعية يعطي المعادلة 4 ويمكن كتابة على النحو التالي:
   
   
3. باستخدام هذه المعادلة، وتحديد حرارة الافراج الحل (س) وnonthermal تغيير حجم (ΔV _nonth) المرتبطة رد فعل بمبادرة صورة من المنحدر واعتراض، على التوالي، من مؤامرة من [(A _ق / م _ص) E _{ح ν]} المدى مقابل درجة الحرارة على المدى تعتمد [(DN / ت) (1/ρCp)].
4. لتحديد حجم رد الفعل والتغيير في المحتوى الحراري لعملية سريعة وبطيئة، وقياس حجم وحظ وتغير المحتوى الحراري للعائد الكم المناسب وفقا لمعادلات 5-7.
   
   
   
   
   
   
   لعملية متعددة الخطوات مع حركية تحدث على مقياس الوقت بين 10 ~ 200 ميللي ثانية μsec، يمكن تحديد حجم والتغيرات في المحتوى الحراري المرتبطة الخطوات الفردية للتفاعل. يتم تحليل سعة وأعمار للخطوات الفردية عن طريق تركيب البيانات إلى الدالة F (ر) الذي يصف الشخصى الوقت من حجم والتغيرات في المحتوى الحراري.
   
   حيث α ₀ يناظر A ^سريع _{وα ط} يناظر A _و ^بطيئة لكل عملية فردية وτ _ط هي عمر خطوات التفاعل الفردية. من درجة الحرارة اعتماد معدل ثابت للص العمليات الفردية (ك _ط = 1 / τ _ط) المحتوى الحراري تفعيل والمعلمات الكون يمكن تحديده بسهولة باستخدام المؤامرات Eyring.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وهناك مثال ممثل PBD يتتبع لكا ^{2 +} الصور الإفراج عن كا ^{2 +} DM-nitrophen هو مبين في الشكل (3). المرحلة سريع يتوافق مع الصور الانقسام من كا ^{2 +} DM-nitrophen وكا ^{2 +} التحرر، في حين أن المرحلة بطيئة يعكس كا ^{2 +} ملزمة إلى القفص nonphotolysed. مؤامرة من PBD السعة العي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

مبدأ المادية وراء أساليب حراري ضوئي؛ هو أن جزيء الصورة متحمس تبدد الطاقة الزائدة عن طريق الاسترخاء الذبذبات الى ارض الدولة، مما أدى إلى التسخين الحراري من ^1،12 المذيب المحيطة بها. للمذيبات مثل الماء، وهذا ينتج توسع حجم السريع (ΔV _عشر). جزيئات الحالة المثارة...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid	Life Technologies	D-6814	DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)	Sigma Adrich	0909C	HEPES buffer
Potassium ferricyanide (III)	Sigma Aldrich	702587	reference compound for PBD measurements
Sodium chromate	Sigma Aldrich	307831	reference compound for PBD measurements
He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	use as a probe beam for PBD measurements
Oscilloscope,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz bandwith
Nd:YAG laser	Continuum	ML II	pump beam for PBD measurements
M355; Nd:YAG laser mirror	Edmund Optics	47-324	laser mirror for 355 nm laser line
M1 and M2; Laser diode mirror	Edmund Optics	43-532	visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm
P1 and P2; Iris Diaphragm	Edmund Optics	62-649	pin hole to shape the probe and pum beams
L1; bi-convex lens	Thorlabs	LB1844	a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm
DM, dichroic mirror	Thorlabs	DMLP505	a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm
F1; Edge filter	Andower	500FH90-25	a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm
Temperature-controlled cuvette holder	Quantum Northwest	FLASH 300