بروتوكول الاستجابة ململة الإرشاد للتحقيق اللدونة السلوكية في الحشرات: تطبيق لالأساسية، الطبية الحيوية، والبحوث الزراعية

Summary

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Abstract

الحشرات تعديل ردودها على محفزات من خلال تجربة ربط تلك المحفزات مع الأحداث الهامة من أجل البقاء (مثل الغذاء والاصحاب والتهديدات). هناك العديد من الآليات السلوكية التي من خلالها يتعلم حشرة الجمعيات البارزة وتتعلق بها إلى هذه الأحداث. من المهم أن نفهم هذا اللدونة السلوكية لبرامج تهدف نحو مساعدة الحشرات التي تعود بالفائدة للزراعة. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا الفهم لاكتشاف حلول للمشاكل الطبية الحيوية والزراعية التي تم إنشاؤها عن طريق الحشرات التي تكون بمثابة نواقل الأمراض والآفات. تم تطوير الاستجابة تمديد ململة (PER) بروتوكول تكييف للنحل العسل (mellifera أبيس) قبل أكثر من 50 عاما لدراسة كيف يرون والتعرف على الروائح الزهرية، التي تشير الرحيق وحبوب اللقاح الموارد والاحتياجات مستعمرة من أجل البقاء. يوفر الإجراء PER إطار قوي وسهل توظيف لدراسة العديد من مختلف ميكا ذات الصلة من الناحية البيئيةالآليات الوطنية لتبادل اللدونة السلوكية. فمن تكيف بسهولة للاستخدام مع العديد من أنواع الحشرات الأخرى، وردود الفعل السلوكية الأخرى. هذه البروتوكولات يمكن استخدامها بسهولة في بالاشتراك مع وسائل مختلفة لرصد النشاط العصبي في الجهاز العصبي المركزي عبر الكهربية أو bioimaging، أو لمعالجة مسارات neuromodulatory المستهدفة. هو فحص قوي للكشف عن الآثار بسرعة شبه قاتلة على السلوك الناجم عن الضغوطات البيئية، والسموم أو المبيدات.

وتبين لنا كيف أن بروتوكول PER واضح ومباشر لتنفيذ باستخدام اثنين من الإجراءات. واحد هو مناسبة كعملية المختبر للطلاب أو لفحوصات سريعة للتأثير علاجا تجريبيا. الآخر يوفر المزيد من السيطرة وافية من المتغيرات، وهو أمر مهم للدراسات في الإشراط السلوكي. وتبين لنا كيف عدة تدابير للاستجابة السلوكية التي تتراوح بين ثنائي نعم / لا إلى مزيد من المتغير المستمر مثل الكمون ومدة تمديد خرطوم يمكن استخدامها لاختبار hypotheseق. و، نناقش بعض العثرات التي تواجه الباحثين عادة عندما استخدم الإجراء لأول مرة.

Introduction

الكثير من الحشرات تتعلم حول المحفزات ذات الصلة من الناحية البيئية، وأنها ثم تغيير ردودهم السلوكية لتلك المحفزات من أجل التكيف مع العلاقات التنبؤية الجديدة في بيئتهم. يمكن أن عدة آليات مختلفة تكمن وراء هذا اللدونة السلوكية (مثل اترابطي، النقابي / بافلوف، واستثابي / دور فعال ^1). هذه الأنواع من اللدونة تختلف في كيفية ترتبط المنبهات أو السلوكيات مع الأحداث الهامة، مثل وقوع الطعام، رفيقة، أو خطرا. فهم هذه الأشكال من اللدونة المهم جدا للبحوث الأساسية في كيفية تغير الجهاز العصبي لترميز الذكريات الجديدة ^2. ومن المهم أيضا لفهم السلوكيات التكيفية من الحشرات التي هي نواقل المرض الهامة (على سبيل المثال، التسي تسي والبعوض) والحشرات التي تعتبر مهمة زراعيا، سواء في إنتاج المحاصيل (نحل العسل) أو الآفات.

دراسة اللدونة السلوكية في أي أنيميتطلب آل مستوى من الرقابة التجريبية على عدد من المتغيرات التي لا يمكن تحقيقها في مجال ^1. فإنه يتطلب وضع بروتوكول تكييف قوي التي يمكن استخدامها في ظل ظروف أكثر سيطرة، ولكن التي لا تزال قائمة إلى السلوك تحت الظروف الطبيعية. عسل النحل (mellifera أبيس) هو نموذج ممتاز لكيفية وضع بروتوكول لإجراء التحليلات السلوكية التي تسيطر عليها من اللدونة ^3،4. رد تمديد ململة (PER) في العسل النحل هو رد الفعل السلوكي الطبيعي الذي عسل النحل يمتد خرطوم في الاستجابة لتحفيز antennal بمحلول السكر. السلوك أثناء البحث عن الطعام العادي، ويحدث عندما يجد PER عسل النحل الرحيق في الزهور. لحسن الحظ، سوف نحل العسل تظهر بسهولة على هذه المشكلة بسيطة وقابلة للقياس بسهولة في المختبر. هذا يجعل من الممكن للدراسة، في الإعداد للرقابة، والآليات التي تؤثر في هذا السلوك من الناحية الإيكولوجية ذات الصلة ^5. PER كاليفورنيان أن تستخدم أيضا ضمن بروتوكول تكييف للتحقيق التصور التحفيز والتعلم والذاكرة تحت ظروف معالجة مختلفة، والتي صممت للكشف عن الآليات السلوكية والعصبية التي تكمن وراء اللدونة ^6.

منذ أولى الدراسات التي كوابارا ^7، تم تكييف PER تستخدم على نطاق واسع للكشف عن اترابطي، النقابي وآليات استثابي التي تكمن وراء اللدونة السلوكية في نحلات العسل ^8. هذه الآليات هي مماثلة لتلك التي كشفت في دراسات الطيران بحرية عسل النحل ^9. خلافا لدراسات الطيران بحرية عسل النحل، PER بروتوكولات تكييف يمكن أن يقترن مع ^10،11 الكهربية أو الخلية الحية التصوير مضان ^12-14 من الدماغ. وعلاوة على ذلك، بروتوكولات PER تسمح للتلاعب التجريبية من المسارات العصبية عبر العلاجات الدوائية أو الوراثية الجزيئية لاختبار الفرضيات حول دور كل من مكونات محددة من مكونات الشبكة، مثل neuromodulators ^15،16. وقد وفرت بروتوكولات PER أيضا وسيلة هامة لتقييم آثار مميتة من الظروف البيئية وكذلك السموم على صحة وكفاءة تستخدم علفا للنحل العسل ^17.

يصف هذا الإجراء طريقتين تسليم رائحة بالتوازي. طريقة 1 هو نسخة من رائحة والتحفيز دون شروط (السكروز) التسليم التي توفر طريقة غير مكلفة وبسيطة من الناحية الفنية لتقديم ورائحة مكافأة السكروز. هذه الطريقة جيدة للتدريب الأساسي وعندما أتمتة غير ممكن. هو وسيلة ممتازة لإدخال هذه التقنية إلى مختبر الفصول الدراسية أو التدريس. خلال تكييف للتجارب التي تنطوي على مهام أكثر صعوبة والتقييمات الفسيولوجية جانب الإدراك رائحة، والتعلم، أو ذاكرة، من المهم جدا بدقة وعلى وجه التحديد لتنظيم بداية، توقيت تسليم مدة المحفزات. لتقديم التحفيز الأكثر موثوقية، واستخدام وسيلة لأتمتة تسليم رائحة والثانية طريقة دقيقة لتسليم المكافأة. 2 توظف طريقة مؤتمتة تسليم رائحة والتسليم السكروز أكثر دقة. فمن الناحية التقنية أكثر تعقيدا ويتطلب المزيد من أجل الإعداد الأولي من الأسلوب 1، لكنه يزيد بشكل كبير من الاتساق في توقيت وكمية من المحفزات المستخدمة لتكييف وينبغي أن تستخدم كلما أمكن ذلك.

Protocol

1. رائحة (مكيفة التحفيز) إعداد خرطوشة

1. في بداية التجربة، والإعداد خراطيش رائحة متعددة لجميع الروائح المختلفة اللازمة للمحاكمات تكييف.
   1. استخدام غطاء الدخان لتخفيف الرائحة وإعداد خرطوشة رائحة. أبدا زجاجات مفتوحة الروائح خارج هذا غطاء الدخان، لأن الروائح سوف تنتشر بسرعة في جميع أنحاء المختبر وربما تعرض النحل العسل لرائحة قبل تكييف. أيضا، وارتداء القفازات أثناء إعداد خراطيش رائحة ويغسل جيدا بعد ذلك لتجنب تعريض عسل النحل لروائح حين التعامل معها.
   2. تأكد من وصفت كل خرطوشة رائحة بوضوح مع تسمية مرمزة من الرائحة التي يتم استخدامها لأول مرة. أبدا استخدام خرطوشة رائحة (حقنة برميل أو الغطاس) لرائحة أكثر من واحد، منذ قد يكون هناك رائحة المتبقية في الخرطوشة.
2. إعداد والروائح رائحة مخاليط
   1. تخفيف الروائح في أي الهكسان أو الزيوت المعدنية لدتركيز esired.
      ملاحظة: تغيير تركيز الرائحة أو تقديم خليط من اثنين أو أكثر من عطر يمكن أن نسمح للتحقيق في جوانب إضافية من النحل كيف تستشعر الروائح وتعلم الجمعية مكيفة. يمكن خليط رائحة تكون بسيطة مثل 50:50 خليط ثنائي أو معقدة مثل الروائح التي تحاكي عدة محفزات حاسة الشم الطبيعية. خفض تركيز الرائحة أيضا يزيد من صعوبة المهمة.
      1. سوف تصبح الروائح المنضب مع إعادة استخدام خرطوشة (الشكل 2). لتجنب المشاكل من استنزاف تجعل ما يكفي من خراطيش لتكون قادرة على التحول إلى خرطوشة جديدة كل 10-12 يستخدم.
3. إعداد خراطيش الرائحة
   1. طريقة 1
      1. لهذا الأسلوب، استخدم 20 مل المحاقن البلاستيكية مع دائرة قطرها 15 مم من ورق الترشيح معلقة على نهاية المطاط من المكبس لخراطيش رائحة.
      2. إزالة المكبس من الحقنة واستخدام الدبوس لنعلق قطعة من filteورقة ص إلى نهاية المكبس.
      3. استخدام micropipette لوضع 10 ميكرولتر من رائحة على ورقة الترشيح، وأعد المكبس في برميل حقنة. دفع المكبس إلى علامة 15 مل على برميل حقنة.
   2. طريقة 2
      1. لهذا الأسلوب، واستخدام الزجاج 1 سم مكعب أو المحاقن البلاستيكية السلين (أو الماصات تعديل حجم وشكل مماثل) مع شريط من ورق الترشيح داخل والمطاط أو السيليكون مقيد في نهاية واسعة من حقنة للبرميل خراطيش رائحة.
      2. إزالة المكبس من 1 سم مكعب حقنة السلين برميل. سوف برميل حقنة يكون الجسم من خرطوشة رائحة.
      3. إزالة غيض من المطاط الأسود المكبس حقنة وقطع نهاية مغلقة من طرف المطاط.
         ملاحظة: هذه حلقة مطاطية بمثابة مقيد للحد من السحب من تدفق الهواء في الساحة، التي ستستند قبل الأوان رائحة من خرطوشة وعلى عسل النحل ضبط النفس. بالتناوب، أنابيب السيليكون (4.8 ملم outeقطر ص) مقطعة إلى 5 أقسام ملم تعمل بشكل مقيد.
   3. شطف داخل برميل حقنة ومقيد المطاط / سيليكون مع الايثانول 70٪ (لإزالة الكثير من رائحة المتبقية من الاستخدام السابق) والسماح لهم الهواء الجاف.
   4. وضع 0.2 × 4 سم شريط من ورق الترشيح في فتحة واسعة للبرميل حتى ورقة تمتد 1-2 سم إلى ما بعد الافتتاح.
   5. استخدام micropipette لوضع 3-10 ميكرولتر من رائحة على ورقة الترشيح دون السماح رائحة تلمس نهاية برميل حقنة. يمكن إعادة استخدامها غيض ماصة لنفس الرائحة، ولكن تأكد لاستخدام طرف الطازجة لإعداد رائحة المقبلة.
   6. تحويل فتحة واسعة للبرميل حقنة صعودا حتى تنزلق بسرعة ورقة الترشيح في أنبوب. إدراج مقيد في فتحة واسعة للبرميل حقنة.
      1. تأكد من وصفت كل خرطوشة رائحة بوضوح مع تسمية مرمزة من الرائحة يستخدم لأول مرة. أبدا استخدام خرطوشة رائحة (حقنة برميل أو restrictor) لرائحة أكثر من واحد، منذ قد يكون هناك رائحة المتبقية عليه.
   7. الكرة نهاية الأنسجة خالية من الوبر، نقع مع الايثانول 70٪، واستخدامها للقضاء تماما على السطح الخارجي للخرطوشة لإزالة أي رائحة المتبقية على السطح الخارجي للخرطوشة.

2. التجميع و الزجرية، وتغذية النحل

1. إعداد النحل الزجرية يسخر
   1. جعل يسخر الزجرية بسيطة لنحل العسل من القش الصودا البلاستيكية، وأنابيب من البلاستيك الصلب، أو تشكيله أنابيب معدنية (كلها تقريبا 0.9 سم وقطرها الداخلي يكون 1-2 مم سمك الجدار). استخدام يسخر أكثر ثباتا لإجراءات تنطوي الجراحة.
   2. قطع 3 سم قطاعات من الأنابيب. ثم، وتقليم جزئيا بعيدا ما يقرب من نصف العلوي 1 سم من تسخير لجعله أسهل لعقد النحل في المكان في حين إبزيم حزام.
   3. قطع 0.2 × 6 سم شريط من شريط لاصق ونعلق نهاية واحدة إلى جانب واحد من تسخير النحل وليافينج الطرف الآخر مجانا.
2. جمع النحل العمال
   1. جمع العمال من مدخل مستعمرة لأنها وقفة قبل الرحيل من مستعمرة أو بعد عودتهم من العلف.
      ملاحظة: وضع قطعة من شبكة سلكية، مع فتحات فقط كبيرة بما يكفي لالشغالات على الزحف من خلال، على مدخل تباطؤ العمال العائدين إلى أسفل ويجعل من السهل للقبض عليهم قبل دخولهم المستعمرة.
   2. ضع قارورة التلألؤ على النحل حتى الذباب يصل الى ذلك. عقد القارورة مع افتتاحه أفقيا أو أسفل بينما يتم تثبيتها على الغطاء حتى لا تطير النحل للخروج من القارورة. وضع نحلة واحدة فقط في كل قارورة. تأكد من أن غطاء لديه ثقب في ذلك لإتاحة الفرصة لتبادل الغازات الكافية.
   3. جمع النحل بسرعة لتقليل الوقت الذي يقضونه في قارورة. الحفاظ على قارورة مع النحل في لهم في مربع صغير في الظل.
   4. نقل مربع مع قارورة والنحل إلى المختبر، ووضع قارورة إلى SL-الماء المثلجأوري حتى النحل يتوقف عن الحركة. مرة واحدة في النحل غير متحرك، وإزالة قارورة من الجليد على الفور لتجنب التعرض المفرط للبرد، ووضع النحل في تسخير الزجرية.
      ملاحظة: نحن لا ننصح بوضع النحل في الثلاجة أو الفريزر لأنه من الصعب مراقبة عندما تصبح جامدة النحل، مما يؤدي إلى الإفراط في التعرض للبرد. عندما تسخير أكثر من 10 النحل، ونقل سوى عدد قليل من النحل إلى الطين في الماء الجليد في وقت واحد.
3. تقييد النحل
   1. وضع النحل في تسخير مع الظهرية في القفص الصدري التي تواجه جزء قطع بعيدا من الأنابيب ورئيسها فقط فوق الجزء العلوي من الأنبوب. اضغط بلطف النحل قريب من أنابيب بحيث تمتد إلى ما وراء فمها حافة الأنبوب. حرك شريط من شريط لاصق بين الرأس والصدر على الجانب الظهري من النحل ونعلق بحزم نهاية المجانية إلى جانب تسخير.
      1. تأكد من أن الشريط على تسخير ناعم ومشدود. يجب أن يكون هناك NOTIيجب أن الفجوات بين ceable أمام تسخير النحل والشريط، والشريط وضع مسطح على الجزء العلوي من تسخير. إذا كانت هناك ثغرات النحلة قد لا تكون قادرة على تمديد خرطوم لها بشكل صحيح أو أنه قد هرب. أيضا، تأكد من أن النحل الأرجل الأمامية لا جاحظ بين الجزء الأمامي من تسخير وشريط لاصق.
4. تغذية النحل والتغذية لتكييف الفاصل
   1. حوالي 30 دقيقة التالية تسخير - بعد أن تعافى النحل من الإعداد الأولي - تغذية النحل 3-4 ميكرولتر 0.5 M السكروز (في الماء). وهذا المبلغ سيكون كافيا لفترة الرضاعة إلى تكييف من 3-4 ساعة.
      1. بشكل عام، وإطعام 1 ميكرولتر 0.5 M السكروز حوالي كل ساعة من وقت الانتظار بين التغذية وتكييف لضمان النحل البقاء على قيد الحياة بعد فترة من الجوع بما فيه الكفاية في بداية تكييف ليكون الدافع لتعلم جمعية مكيفة. في المختبر تحفظ في درجة حرارة دافئة أو إذا شيغني تركيز مختلفة من السكروز، وضبط كمية تغذية أو الفاصل الزمني وفقا لذلك.
         ملاحظة: مع التغذية لفترة 24 ساعة من تكييف، تأكد من يتم تغذية كل النحل لشبع مع 0.5 أو 1 M السكروز لا يقل عن 24 ساعة قبل أن تبدأ تكييف. في درجة حرارة الغرفة، والنحل تتطلب ما يقرب من 24 ساعة قبل أن يتم بدافع أنها تستجيب بشكل جيد بما فيه الكفاية لفي بروتوكول تكييف.
         ملاحظة: استخدام تركيز أقل من السكروز حل لتغذية النحل من التركيز المستخدم كمكافأة خلال تكييف لمنع النحل من أن تصبح أقل حساسية لتركيز السكروز المستخدمة خلال تكييف، الأمر الذي قد يقلل أداء التعلم ^18.
      2. تغذية النحل في منطقة بعيدة عن منطقة التدريب. التعرض لحافز غير المشروط (السكروز) في سياق تكييف قبل تكييف تكييف قد تؤثر لاحقا على رائحة.
   2. خلال الفترة الفاصلة بين التغذية وجonditioning وضع النحل على كونترتوب في منطقة هادئة في المختبر لتجنب إزعاج غير ضروري. إذا كان لديه مختبر المنخفضة المحيطة الرطوبة، وضع النحل في وعاء من البلاستيك مع مناشف ورقية مبللة أثناء الفاصل الزمني. هذا يمنع جفاف، لأن النحل قد يموت إذا تعرضوا للرطوبة منخفضة لفترات زمنية طويلة.
      ملاحظة: لا تغيير بروتوكول تسخير والتغذية ضمن تجربة! استخدام فاصل زمني معين واحد فقط بين إقامة وتغذية النحل وتبدأ تكييف لكل تجربة بحيث يتم معاملة جميع النحل بنفس الطريقة تماما.

3. تكييف

1. اختبار للحساسية السكروز
   1. دقائق قليلة قبل بداية تكييف، اختبار الدافع النحل "لتغذية عن طريق لمس الهوائيات مع قطرات صغيرة من 0.5 M الحل السكروز (نفس التركيز المستخدم أثناء الرضاعة). لا تسمح لهم لتغذية خلال هذا الاختبار. إذا كانت الاستجابة من قبل EXTEالاكتشاف خرطوم، فإنها على الأرجح بما فيه الكفاية لمعرفة دوافع ويمكن استخدامها للبروتوكول.
2. تصميم التجربة
   ملاحظة: يمكن تعديل هذا البروتوكول لتناسب مجموعة واسعة من بروتوكولات التعلم من أجل تحقيق العديد من جوانب التعلم والذاكرة قدرات نحل العسل. من بين العديد من المعلمات التي يمكن تعديلها هي: الفاصلة بين المحاكمة، عدد من النحل المدربة في وقت معين، فاصل بين التحفيز ونوع وتركيز وعدد من الروائح، ونوع وتركيز التحفيز دون شروط، وعدد وتسلسل التجارب (الشكل 1، الجدول 1) ^19-21. عند تصميم البروتوكول المحدد لكل محاكمة تكييف، من المهم جدا للحفاظ على فاصل زمني بين المحاكمة متناسقة عبر الأفراد. فاصل محاكمة أمور التي هي قصيرة جدا، طويلة جدا أو لا يتعارض سوف يضعف أداء النحل. انظر مناقشة لعلاج الكاملة لهذا الموضوع.
   ملاحظة: نحلةق سوف تتعلم هذه المهمة بسرعة أكبر إذا كانوا في بيئة دافئة. لذا، والحفاظ على درجة حرارة بيئة التدريب بما يتفق والدافئة (29-30 درجة مئوية إن أمكن).
3. تسليم رائحة (مكيفة التحفيز)
   1. طريقة 1
      1. إنشاء نظام رائحة التسليم
         1. تركيب 20 مل حقنة بلاستيكية محملة ورقة الترشيح المعالجة رائحة لذلك هو مستقر ويواجه نهاية صغيرة مباشرة في هوائيات النحلة. تعيين الغطاس عند علامة 15 مل ووضع حقنة حتى المكبس يمكن الوصول إليه بسهولة.
      2. تقديم التحفيز الرائحة
         1. في بداية كل محاكمة، ضع النحل في تسخير على شماعة في الساحة مع تكييف وأشارت الهوائيات بشكل مباشر نحو خرطوشة رائحة. السماح للتأقلم النحل إلى الساحة ل15-25 ثانية قبل بدء التحفيز رائحة للحد من الفوضى التي يسببها التغير المفاجئ في محيطها البصرية خلال التحفيز الرائحة.
            1. إذا يبدأ النحل للرد على خرطوشة رائحة مباشرة بعد وضعها في الساحة تكييف، قد يكون هناك رائحة على معلومات سرية للخرطوشة. إزالة رائحة تلويث بغسل خرطوشة قبالة مع الأنسجة خالية من الوبر غارقة في الايثانول 70٪. إذا كان هذا لا يحل المشكلة، استبدل الخرطوشة.
         2. اضغط على المكبس من حقنة بمعدل ثابت بحيث يتم الاكتئاب المكبس تماما في غضون 4 ثانية. مراقبة استجابة النحل لرائحة قبل تقديم المثير غير الشرطي.
         3. بعد كل محاكمة، والسماح للنحل للراحة في الساحة تكييف لل15-25 ثانية أخرى. سوف تتحرك النحلة في وقت قريب جدا بعد محاكمة الحد بشكل كبير من فعالية كل محاكمة تكييف.
   2. طريقة 2
      1. إنشاء نظام رائحة التسليم
         1. المصدر تدفق الهواء ومعدل التدفق
            1. كما تدفق الهواء مصدر للتسليم رائحةاستخدام مضخة ماء أو تهوية التربة مختبر مقاعد البدلاء إمدادات الهواء المضغوط، إذا تم تجهيز المختبر معها.
               ملاحظة: نموذجي مضخة ماء لتهوية التربة سوف يكون لها معدل تدفق الهواء قرب 400 مل / دقيقة (7 مل / ثانية). على مدى 4 ثانية رائحة التحفيز، و28 مل من تدفق الهواء من خلال خرطوشة 1 مل.
            2. استخدام مقياس الجريان في خط أنابيب مع الجهاز. الهواء لتنظيم معدل تدفق لتوريد الهواء. ضبط تدفق متر حتى معدل التدفق 400 مل / دقيقة. تحقق معدل التدفق في افتتاح خرطوشة رائحة مع مقياس الجريان منفصل.
            3. ربط تدفق الهواء إلى خرطوشة رائحة من خلال نظام من الأنابيب البلاستيكية والصمامات.
               ملاحظة: جهاز توقيت مناقشتها أدناه يفتح الصمامات في الوقت المناسب في المحاكمة. الموصلات البلاستيكية نعلق نظام تدفق الهواء إلى خرطوشة رائحة من خلال نوع المرفق يور إلى خرطوشة حقنة برميل.
            4. بغض النظر عن مصدر تدفق الهواء، والتحقق من معدل تدفق دوري لأماهكه من أن خط سليم والمحافظة على معدل التدفق بالمعدل المطلوب.
      2. رائحة الآلي التسليم
         1. استخدام وحدة تحكم منطق برمجة (PLC) لأتمتة تسليم رائحة.
            ملاحظة: يتم برمجة PLC لفتح الصمامات لتسليم رائحة تدفق الهواء 6 ثانية بعد بدء برنامج (بادر بالضغط على زر)، والحفاظ على الصمامات مفتوحة لمدة 4 ثانية، وإشارة مسموعة التغذية السليمة، عبر مكبر صوت صغير، 3 ثانية بعد ظهور رائحة التحفيز للإشارة المجرب لتقديم السكروز.
         2. استخدام LED صغير للإشارة إلى توقيت التحفيز رائحة أثناء كل محاكمة. إذا أمكن استخدام LED الأحمر، حيث يتم تحول المستقبلات الضوئية النحل بعيدا عن أطول [الأحمر] ونحو الأطوال الموجية الأقصر [الأشعة فوق البنفسجية] الأطوال الموجية بحيث لا يمكن رؤيتها جيدا. وضع الصمام وراء وتحت النحل، خارج مجالهم البصري، وبالتالي فإن الضوء لا يصبح غير مقصود مكيفة التحفيز.
            ملاحظة: التركي الممتازHT يساعد أيضا التحقق من أن PLC تعمل بشكل صحيح ومفيد في تحليل تسجيلات الفيديو لاستجابات النحل خلال التجارب الاختبار.
      3. نظام العادم
         1. إنشاء نظام العادم وراء النحل للمساعدة على سحب الهواء الماضي النحل وإخلاء رائحة الهواء المحملة من الساحة تكييف للحفاظ على فترة زمنية منفصلة لكل عرض الرائحة.
            ملاحظة: إذا كان هناك نظام فراغ في المختبر، تعديل ميناء التفريغ وإرفاق قناة مجفف أنابيب لتوفير تدفق الهواء اللازم لإخلاء الساحة تكييف. إذا لم يكن هناك نظام فراغ، مروحة كهربائية صغيرة مقرها في خط أنابيب مع مجفف أدت إلى غطاء الدخان أو من خلال نافذة سوف يكون كافيا.
      4. في بداية كل يوم، والتحقق من التوصيلات الكهربائية والهواء من نظام التسليم رائحة ونظام العادم. اضغط على زر البداية على نظام التسليم رائحة وتتبع الوقت بين الضغط علىزر وعندما الصمامات مفتوحة (بنقرة وهادئ وضوء LED يأتي على) وعندما جديلة لتقديم التحفيز غير المشروط (لهجة مسموعة) أصوات. تحقق إيصال الهواء من خلال وضع الإصبع رطبة أمام الرابط الذي سيتم تعلق على خرطوشة رائحة. يجب أن يكون هناك تيار الهواء القوي فقط عندما تكون الصمامات مفتوحة. تحقق من نظام العادم من خلال عقد الأنسجة تصل خالية من الوبر لافتتاح نظام العادم للتأكد من تدفق الهواء قوي بما فيه الكفاية لإخلاء الهواء بشكل صحيح من الساحة تكييف.
   3. تركيب خرطوشة رائحة
      1. وضع بعض الطين النمذجة إما على كونترتوب أو على زجاجي صغيرة تقف لوضع النحل ورائحة خرطوشة مباشرة أمام نظام العادم. وضع الحقنة الزجاج في رائحة الطين وتعديله بحيث يتم أشار افتتاح في نهاية واسعة في رأس النحلة. يجب أن تكون نهاية حقنة 1-2 سم من النحل. اختيار مسافة ضمن هذا النطاق ويكون ثابتا.
      2. وضع آمن تركيب خرطوشة لربط أنابيب الهواء ونظام الصمامات خلال نهاية الضيقة الزجاج الأرضي من حقنة.
   4. تقديم التحفيز الرائحة
      1. في بداية كل محاكمة، ضع النحل تسخيرها على شماعة في الساحة مع تكييف وأشارت الهوائيات بشكل مباشر نحو خرطوشة رائحة. السماح للبقية النحل في الساحة ل15-25 ثانية قبل بدء التحفيز رائحة السماح لها بأن تصبح معتادا على محيطه الجديد.
         ملاحظة: إذا يبدأ النحل للرد على خرطوشة رائحة فورا بعد وضعه في الساحة تكييف، قد يكون هناك رائحة على معلومات سرية للخرطوشة. إزالة رائحة تلويث بغسل خرطوشة قبالة مع الأنسجة خالية من الوبر غارقة في الايثانول 70٪. إذا كان هذا لا يحل المشكلة، استبدل الخرطوشة.
      2. اضغط على زر البداية للشروع في آلية توقيت لتسليم رائحة. مراقبة استجابة النحل لرائحة بعد التحفيزبداية وقبل تقديم المثير غير الشرطي.
      3. بعد كل محاكمة، والسماح للنحل للراحة في الساحة تكييف لل15-25 ثانية أخرى للسماح لتشكيل الذاكرة الأولي. سوف تتحرك النحلة في وقت قريب جدا بعد محاكمة الحد بشكل كبير من فعالية كل محاكمة تكييف.
4. تقديم السكروز (دون شروط التحفيز)
   1. طريقة 1
      1. لهذا الأسلوب، استخدام المسواك لتقديم السكروز.
         ملاحظة: فمن الأفضل لاستخدام المسواك البلاستيك منذ المسواك خشبية يمكن أن يكون لها رائحة من شأنها أن تؤثر على استجابات النحل لالمثير الشرطي.
      2. تراجع غيض من المسواك في حل السكروز، وعندما حان الوقت لتقديم التحفيز غير المشروط، مع الاستمرار على المسواك أمام النحل والسماح للنحل للعق السكروز من المسواك لحوالي 1 ثانية.
      3. استبدال المسواك بشكل منتظم لتجنب تراكم سوكروز.
   2. طريقة 2
      1. السكروز نظام التسليم
         ملاحظة: وهناك طريقة أكثر دقة لتقديم المثير غير الشرطي هو من خلال استخدام المحاقن ميكرومتر، والتي يمكن أن تحقق بدقة كميات صغيرة (أعشار من ميكروليتر) من مكافأة السكروز.
         1. الرياح ميكرومتر من حقنة الظهر قدر الإمكان. تحميل برميل ميكرومتر المحاقن مع الحل السكروز. تأكد من عدم وجود فقاعات في الجزء الزجاج وتجميع الحقنة. ملء محور الإبرة مع الحل السكروز قبل وضعها على نهاية الضيقة للبرميل حقنة. للتأكد من أن السائل في الإبرة هو في الواقع السكروز وليس الماء من غسل الإبرة، والرياح ميكرومتر إلى الأمام 1-2 ميكرولتر قبل البدء في التجربة.
   3. عرض السكروز
      1. عقد رأس الإبرة حوالي 2 سم من النحل بينما قدم رائحة. استخدام حافة الساحة التدريب لمنعيمكن أن تهز حقنة باسم حركة إلهاء النحل. لا تحصل الإبرة قريبة جدا تحسبا للإشارة التغذية، لأن من شأنها أن تحول أيضا قبل الأوان انتباه النحل من الرائحة إلى السكروز.
      2. بمجرد سماع أصوات إشارة التغذية، لمسة طفيفة هوائيات حتى النحل يمتد خرطوم لها، ثم تغذية النحل. هذا الامر يتطلب فقط لمسة خفيفة جدا أو اثنين للهوائيات.
         1. استخدام كمية المكافأة بين 0.2 و 0.8 ميكرولتر. النحلة يجب أن تستهلك بسهولة الحبرية كامل في غضون الفترة الزمنية المخصصة للالمثير غير الشرطي (~ 1-2 ثانية). لا تستخدم "libitum الإعلانية" التغذية من قطرات كبيرة، والتي يتغذى النحل على لعدة ثوان ولكن لا يمكن أن تستهلك تماما.
         2. مشاهدة لالسكروز بناء على هوائي، الأمر الذي سيقلل استجابة النحل لعروض لاحقة للمكافأة. تعديل الإجراء التغذية إذا حدث هذا.
         3. لضمان الاقتران دقيق للرائحةجديلة والثواب السكروز، للتأكد من تقديم قطرة من محلول السكروز إلى النحل في أقرب وقت ممكن بعد لهجة.
            ملاحظة: التوقيت بين بداية CS (رائحة) والولايات المتحدة (السكروز) أمر بالغ الأهمية. من الناحية المثالية، ينبغي أن رائحة العرض والتقديم السكروز تتداخل فترة وجيزة. إذا كان أكثر من بضع ثوان تنقضي بين نهاية CS وتسليم الولايات المتحدة، سوف يقلل من أداء تكييف.

4. اختبار

1. بعد استخدام تكييف محاكمات غير المدعومة اختبار لتقييم مدى المستفادة النحل و / أو تذكر الجمعية مكيفة.
   ملاحظة: انظر مناقشة للحصول على شرح مفصل لأهمية تحليل "الردود على تجارب اختبار غير المدعومة بالإضافة إلى النحل النحل الأداء في التجارب تكييف وشرح الغرض من عدد من التجارب اختبار والروائح الاختبار.
2. توحيد التوقيت
   1. التاليةتكييف، إما إدارة اختبار محاكمة الفورية أو السماح النحل للراحة خلال فترة التوحيد.
      ملاحظة: طول فترة التوحيد، الفاصل الزمني بين تكييف والاختبار، وسوف يعتمد على الهدف من التجربة. إذا كان الغرض من ذلك هو التحقيق في الخلافات التعلم أو الذاكرة على المدى القصير، يمكن تقييم أداء النحل على تجارب الاختبار التالي على الفور أو بعد عدة ساعات من تكييف. إذا كانت تجربة تنطوي على التحقيق الذاكرة طويلة المدى، ينبغي إيلاء المحاكمات اختبار لا يقل عن 24 ساعة بعد نهاية تكييف.
   2. إذا كانت التجارب هي اختبار أكثر من 24 ساعة التالية تكييف، تغذية النحل لشبع مع السكروز 0.5 M التالية تكييف ومرة ​​واحدة على الأقل كل يوم بعد ذلك حتى 12-24 ساعة قبل المحاكمات الاختبار.
      1. للتأكد من وصلت النحل شبع، وإطعام كل منها عدة أوقات مختلفة حتى أنها لم تعد تمديد خرطوم في الاستجابة للمس الهوائي علىالبريد مع السكروز. يمكن أن تستهلك ما يصل إلى 40 ميكرولتر للوصول شبع.
   3. الحفاظ على النحل في وعاء ترطيب لمنع تجفيف والموت خلال فترة التوحيد.
3. تجارب الاختبار
   1. استخدام خراطيش رائحة فقط أعد حديثا للاختبار.
      ملاحظة: الخراطيش المستخدمة للحصول على قد استنزفت بشكل مختلف، وبالتالي فإن اختبار التحفيز لا تكون متناسقة عبر المحاكمات، والروائح، والفردية النحل، وبالتالي، يمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على تماسك ومتانة النتائج.
   2. أثناء الاختبار، والحفاظ على نفس الفاصل الزمني بين المحاكمة وغيرها من المعالم كما هو مستخدم في المرحلة تكييف التجربة.
   3. لا تقديم المثير غير الشرطي أثناء المحاكمات الاختبار، حيث إن وجود مكافأة سوف يغير استجابة النحل لالمثير الشرطي، ويحتمل أن تخفي آثار أكثر دهاء من البروتوكول تكييف أو العلاج.
   4. تسجيل الفيديو من جميع سو المحاكمات اختبار لتكون قادرة على قياس جوانب متعددة في وقت لاحق استجابات النحل لرائحة (ق).

5. تسجيل الردود النحل "

1. ثنائي (حضور / غياب) التهديف من PER
   1. استخدام نظام التسجيل الثنائي من خلال التجارب PER تكييف وخلال المحاكمات الاختبار. تسجيل استجابات إما إيجابية أو سلبية. هذا هو مرض لأنواع كثيرة من التحليلات مع حجم عينة من 20-40 النحل في مجموعة العلاج. طوبولوجيا الدقيق للاستجابات يمكن أن تكون معقدة ^22. من المهم إنشاء السهل أن نرى ويسجل معيار ردا ايجابيا.
      1. يسجل استجابة نحلة كما الموجب (+) عند النحل خرطوم يمتد إلى ما وراء الخط عن طريق توصيل نصائح من فتح الفك السفلي. يسجل فقط ردا إيجابيا عندما يكون النحل يمتد خرطوم لها رائحة بعد بداية ولكن قبل رائحة الإزاحة.
      2. يسجل استجابة نحلة كما السالب (-) عندما لا يكون هناك هxtension للخرطوم أثناء المحاكمة أو إذا تم تمديد خرطوم بعد إزاحة الرائحة.
      3. تجنب محاولة لتسجيل استجابات جزئية. لجعل الفروق الدقيقة في سلوك النحل، استخدام تقنية تحليل الفيديو المذكورة أدناه.
2. تحليل الفيديو من القياسات PER إضافية (فيلم 1)
   1. جمع معلومات إضافية من اختبارات السلوك من خلال تحليل أشرطة الفيديو من الردود على النحل لرائحة.
      ملاحظة: يمكن لهذه القياسات توفر أيضا القرار الزماني أعلى للفحص استجابات النحل للروائح، وخاصة عندما لم يكن هناك فرق في سجل حضور / غياب PER بين مجموعات العلاج.
   2. تسجيل الفيديو
      1. دائما استخدام اختبار غير المدعومة أو الانقراض محاكمات لتسجيلات الفيديو. فإن وجود مكافأة يغير استجابة النحل لرائحة، وتعديل مدة التمديد خرطوم.
      2. وضع كاميرا الفيديو على حامل ثلاثي الأرجل فوق الساحة تدريب وتركيز الكاميرا على الجزء الأمامي من رأس النحلة، وبالتالي فإن الهوائيات وخرطوم هم في التركيز الشديد.
      3. وضع ضوء LED صغيرة، مما يدل على عرض الحوافز رائحة، في منطقة وراء النحل التي مرئيا في الفيديو من أجل استخدامها لتحديد بداية الرائحة وتعويض خلال التحليل.
      4. بدء تسجيل 20 ثانية قبل ظهور رائحة ويستمر تسجيل لمدة 20 ثانية على الأقل بعد رائحة تعويض قبل إزعاج النحل.
   3. تحليل الفيديو
      1. تحميل أشرطة الفيديو إلى برامج تحرير الفيديو مثل موفي أو قص النهائي برو، لديها القدرة على قياس فترات زمنية محددة بين الإطارات في شريط الفيديو.
      2. تحليل استجابة النحل لرائحة لفترة زمنية منفصلة ابتداء من بداية التحفيز رائحة (مثل 10 أو 20 ثانية).
      3. استخدام القياسات المشتركة التالية لتقييم PER:
         1. قياسمدة تمديد خرطوم، وهي المرة الإجمالي الذي خرطوم يمتد إلى أبعد من خط الفك السفلي، إلى الفك السفلي (المذكورة أعلاه).
            ملاحظة: نحلة قد يمتد ويتقلص خرطوم لها عدة مرات خلال نافذة زمنية 10-20 ثانية. قياس كل ملحق خرطوم بشكل فردي، وحساب المدة الإجمالية. يمكن تحليل عدد ومدة كل تمديد خرطوم الفردي أيضا تقديم معلومات قيمة.
         2. قياس كمون تمديد خرطوم، وهو الوقت بين ظهور الرائحة، وعندما يأتي ضوء LED على، وتمديد خرطوم الأول.
         3. العد وملحقات الوقت لساني النسبية لظهور الرائحة، التمديد الاول، أو توقيت المعلمات الأخرى.
         4. تتبع حركات Antennal ^23، والتي تظهر أيضا التغييرات الموجهة رائحة مميزة.
            ملاحظة: في الفيلم 1، وقد تم تتبع تحركات antennal مع برنامج تتبع الفيديو لتوضيح التغير في الحركات antennal طن استجابة لحافز الرائحة.

النتائج

نقدم مثالين من استخدام البروتوكولات PER المذكورة أعلاه. أول مثال استخدام مصنوعة من الطريقة 2 لدراسة كيف ترى نحل العسل الروائح المختلفة بوصفها وظيفة من التشابه الجزيئي لرائحة تستخدم للCS ^5،24،25. والثاني هو مثال على استخدام أسلوب 1 وبعض الاحتياطات التي يجب اتخاذها عند بداية استخدام PER تكييف التجارب في المختبرات البحثية.

دراسات كهذه قد استخدمت لوصف "مساحة الإدراك الحسي" حاسة الشم من عسل النحل والعث بالتزامن مع bioimaging ¹³ أو يحلل الكهربية ^26. تم مكيفة نحل العسل (ن = 20) لربط decanal الرائحة مع تعزيز السكروز أكثر من 12 قدما الاقتران محاكمات تكييف (الشكل 3A). حوالي 10٪ من عسل النحل وردت "عفويا" في المحاكمة الأولى، وهو أمر طبيعي. بعد ذلك النسبة المئوية التي ريسبونديد زيادة خلال التجارب القليلة المقبلة حتى 100٪ من عسل النحل وردت على المحاكمة الخامسة وكل محاكمة لاحقة. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن هذه الزيادة في الاستجابة إلى حالة محددة إلى الأمام الاقتران (الشكل 1) نسبة إلى عدة إجراءات مراقبة مهمة ^3. بعد مرحلة الاستحواذ، تعرض كل نحلة العسل لسلسلة من المحاكمات غير المدعومة اختبار (الشكل 3B)، الذي ينطوي على التعرض للرائحة CS وعدة عطر الأخرى التي تختلف بشكل منهجي من CS في الهياكل الجزيئية. ردت نحل العسل بشدة إلى CS. انخفضت ردودها على عطر أخرى بوصفها وظيفة من التغييرات المنهجية في الهيكل، مع أدنى الردود على عطر أقل مثل CS.

في الشكل 4، والنتائج من ورشة الأخيرة التي تعلمها الطلاب، لأول مرة، كيفية تكيف نحل العسل باستخدام أسلوب 1 موضحة. التنوب الطلاب ر مكيفة النحل العسل المهاجم الاقتران methycyclohexanone (صحة الأم والطفل) أو الأوكتانول (أكتوبر) مع تعزيز السكروز (الشكل 4A). وكانت الردود في المئة أقل على المحاكمة الأولى وزادت على التجارب اللاحقة، مشيرا إلى أن النحل المستفادة جمعية رائحة السكروز. كانت هناك اختلافات في درجة أن النحل المستفادة جمعية مشروطة عبر مجموعات مختلفة من الطلاب. في تجربتنا، ويمكن لهذه الأنواع من الاختلافات يكون بسبب الرائحة التي تم استخدامها باعتبارها CS، إلى عناصر غير دقيقة في الأسلوب (أسلوب 1)، أو على مستوى تدريب المجربون. في الحالة الثالثة، والأداء سرعان ما تصبح أكثر اتساقا مع الخبرة المجربون "زيادة. بعد تكييف، تم اختبار كل نحلة العسل مرتين مع كل رائحة. في مجموعات من نحل العسل الذي تم مكيفة مع الاقتران إلى الأمام من أكتوبر أو صحة الأم والطفل، والاستجابة، كما هو متوقع، إلى أقوى رائحة مكيفة (الشكل 4B).

كانت مشروطة والأنف والحنجرة "> المجموعة الثانية من نحل العسل التي شهدت قدما إلى الاقتران أكتوبر بالتوازي مع مجموعة أخرى فيها رائحة أكتوبر تم إقران الخلف مع السكروز. الاقتران الوراء هو واحد من عدة أنواع من إجراءات الرقابة لإثبات أن الزيادة في استجابة وتحديدا إلى الأمام الاقتران وليس بسبب عملية أخرى، مثل الاستثارة غير محددة من التوعية. لالاقتران الوراء، تعرض الولايات المتحدة السكروز ورائحة CS بترتيب عكسي لما هو مبين في الشكل 1. البيانات اقتناء من الاقتران متخلف هي لا يظهر لأن CR لا يمكن وسجل نظرا لعرض رائحة CS بعد تقديم السكروز. كما يمكن توقعها للتكييف النقابي، كانت مستويات ردا على OCT أعلى في الأمام تقرن مجموعة نسبة إلى مجموعة المتخلفة (الشكل 4C).

7fig1highres.jpg "العرض =" 500 "/>
يسبق الرقم 1. مخططات التصميم التجريبي للتكييف باستخدام الاقتران الأمام. انظر الجدول 1 للحصول على تعريفات للمصطلحات المستخدمة في هذا الرقم. (A) وCS (رائحة) ويتداخل مع الولايات المتحدة (محلول السكروز / الماء). العلاقة بين الولايات المتحدة وCS المعروضة المثلى لتكييف النحل العسل والعث. لكن ISI الأمثل يمكن أن تعتمد على بروتوكول تكييف والأنواع الحيوانية ^1. (B) إصلاح وتوقيت النسبي للCS، CR، US، وUR. وCR الذي يحدث إما قبل عرض الولايات المتحدة أو أثناء المحاكمات غير المدعومة 'اختبار' هو مقياس يعتمد على البروتوكولات التجريبية.

الشكل 2. استنزاف الرائحة مع إعادة استخدام الخراطيش. لهذه البيانات، كانت رائحة خراطيشانشاء مع HEXANOL كما هو موضح في النص. ويشيع استخدام HEXANOL باعتبارها CS في الدراسات PER. ومع ذلك، فإن المعدل الفعلي للاستنزاف تعتمد على رائحة والمذيبات. ثم استخدمت خراطيش مرة واحدة لمدة 4 ثانية كل دقيقة أكثر من 8 تجارب (على افتراض 5 عسل النحل / محاكمة في تجربة القياسية التي تساوى 40 الاستخدامات). كانت التخفيفات في المذيب المشار إليه، والتي كانت المعيار نسبيا للتجارب PER، 2.0 M (A) و 0.2 M (B). (A، B) تم أخذ عينات رائحة بعد أول والمحاكمات الثامنة عن طريق الامتزاز في الصعود إلى المرحلة الصلبة Microextraction (SPME) الألياف التي كانت ثم المستوعبة في الصعود إلى الكروماتوجرافي الغاز. كانت المناطق النسبية تحت قمم أعلى بعد أول تجربة بالنسبة إلى الثامنة لكل من المذيبات ولكل من تركيزات (يلكوكسن مطابقة أزواج قعت اختبار رتبة P <0.05 [*] أو أكبر)، مما يدل على أنه تم تسليم أقل رائحة من خرطوشة بعد خرطوشة قد استخدمت عدة مرات. (C، D) نفس بيانات تظهر فقط TR الثامن يمه مع المحور ص الموسعة. فإنه يدل على أن نضوب كان أكبر قليلا لالهكسان بالنسبة إلى الزيوت المعدنية، ولكن فقط فى انخفاض التركيز.

الرقم 3. اقتناء واستخدام اختبار decanal باسم CS وطريقة 2 إلى تكييف. (A) محاكمة تلو محاكمة استجابة (CR) أكثر من 12 محاكمات الاقتران إلى الأمام (الشكل 1). البيانات هي من النحل ن = 20 العسل مكيفة في أربع مجموعات من 5 العسل كل النحل. كان ISI 3 ثانية وكان ITI 6 دقائق (B) اختبارات غير المدعومة باستخدام الروائح التي تختلف عن decanal بطول سلسلة الكربون و / أو موقف الكربون الكربونيل. عرضت الروائح في سلسلة العشوائية عبر المجموعات الأربع وكانت تتخللها تجارب معززة decanal (كل سنتين أو ثلاث تجارب) من أجل تجنب انقراض CR.

e_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" دائما ">
خلالها تم تدريب الطلاب يتخرجون الشكل 4. بيانات من ورشة عمل لشرط نحل العسل باستخدام PER أسلوب 1. البيانات (A) من اقتناء ثلاث مجموعات من النحل العسل مكيفة ل-أوكتانول (ن = 23 و 15 لتحديد المواقع 1 و 2، على التوالي) وmethylcyclohexanone (ن = 10) (B) CRS خلال الاختبارات غير المدعومة مع كل من الروائح؛ أربع محاكمات المقدمة في سلسلة عشوائية عبر مجموعات (C) الاختبارات غير مدعوم مع كل الروائح في مجموعتين من نحل العسل، واحدة إلى الأمام تقرن (GP 1، ن = 23) واحد إقران الخلف (ن = 25).

مصطلح (اختصار)	تعريف	مثال ذات الصلة
التحفيز مكيفة (CS)	والتحفيز الذي يتسبب استجابة قليلة أو معدومة في البداية، ويشير الولايات المتحدة	ODOR
استجابة مشروطة (CR) و	الرد على CS بعد بالتعاون مع الولايات المتحدة	خرطوم تمديد
المثير غير الشرطي (US)	والتحفيز الكبير بيولوجيا الذي يتسبب استجابة	السكروز / محلول مائي
الاستجابة غير المشروطة (UR) و	استجابة إلى الولايات المتحدة	خرطوم تمديد
بين التحفيز الفاصل الزمني (ISI)	الوقت بين بداية CS وظهور الولايات المتحدة	الرائحة لفترة السكروز
بين المحاكمة الفاصل الزمني (ITI)	الوقت بين أزواج متتالية CS-الولايات المتحدة لحيوان واحد	ODOR (محاكمة ن) لODOR (محاكمة ن + 1) الفاصلة

الجدول 1. ايمبالغ الأهمية بالنسبة المصطلحات. راجع الشكل 1 لتوضيح هذه المصطلحات. ^للPER تكييف وCR وUR هي نفسها، على الرغم من أن لأنواع أخرى من الجمعيات وردود الفعل على CR وUR قد تختلف.

فيلم 1. شريط فيديو من عسل النحل أداء PER بعد أن تم تكييف للرد على رائحة. لاحظ استجابة PER من النحل حوالي 1.5 ثانية عقب ظهور رائحة. برنامج تتبع تعيين الحركات antennal ردا على عرض الرائحة. الخطوط المرسومة في الزاوية اليمنى العليا للفيديو تصور حركات antennal الفعلية. الرسوم البيانية اثنين على الجزء السفلي من الشاشة تظهر حركات antennal على X (يسار) وY (يمين) الإحداثيات. الخطوط الرأسية في الرسم البياني يظهر في شريط الفيديو تشير، من اليسار إلى اليمين، وعلى ضوء ON، PER، وعلى ضوء قبالة وخرطوم التراجع.

Discussion

قدم هذا البروتوكول طريقتين يمكن الاعتماد عليها لتكييف باستخدام الإجراء PER. هذه هي اثنين من العديد من الطرق التي استخدمت بنجاح ^{27 و 21.} نحن توظيف الأسلوب 2 لجميع الدراسات التجريبية باستخدام PER كما هو موثوق باستمرار، حتى عبر المجربون مختلف.

تم تكييفها نفس الإجراء الأساسي لكثير من أنواع مختلفة من الدراسات مع عسل النحل، بما في ذلك استخدام المحفزات تكييف مختلفة وردود الفعل السلوكية المختلفة. كما تم ربطه التحقيقات من الأساس الجيني للاختلافات في تعلم ^28،29، ويرتبط الفسيولوجية للإدراك حاسة الشم والذاكرة في الدماغ ^13،14،30، وتغييري والجزيئية الوراثية قواعد السلوك ^15،16،31 . بسبب المعرفة المتقدمة من أهمية إيكولوجية التعلم حاسة الشم لعسل النحل، والتي بدأت مع أولى الدراسات التي كتبها كارل فون فريش قبل أكثر من 100 سنة ^{31، والنتائج من PER يمكن ربطها بسهولة مع احتياجات بقاء مستعمرة. وفي الآونة الأخيرة، تم تكييفها لدراسة زراعية للتحقيق في الآثار السلوكية شبه مميتة من المبيدات والسموم البيئية 17.}

الإجراء الأساسي هو قوي لأنه يمكن تطبيقها على التحقيق في مشاكل في الأنواع الأخرى أيضا. نوعين فراشة، ماندوكا سيكستا وورق القطن littoralis، وقد استخدمت في الدراسات PER للتحقيق في الأساس العصبي لتحديد قدرات التعلم ورائحة الشم كل الأنواع ^32،33. وقد وفرت تجارب PER مع ذباب الفاكهة العديد من الأفكار في شلالات الإشارات الجزيئية المشاركة في chemosensation والتعلم ^34. ومؤخرا استخدمت PER لدراسة التعود في برغوث (الرادنة prolixus) ^35، وهي ناقلات الأمراض مهم.

بشكل عام، هذا الإجراء هو قوي للتغيرات في طريقة. استخدام دوأساليب ifferent المرجح تنتج الفرق النسبي بين مجموعات العلاج نفسه. على الرغم من إجراء بسيط نسبيا، ويمكن في بعض الأحيان عدة مشاكل تمنع نحل العسل من تعلم الجمعية رائحة السكروز. المواضيع التالية هي التعديلات الممكنة للبروتوكول وبعض من أكثر المشاكل الشائعة التي قد تنشأ خلال تكييف PER.

الاعتبارات على عدد ونوع المحاكمات في بروتوكول تكييف

سوف تتطلب أي بروتوكول التعلم تعرض النحل لعدد من التجارب في مرحلة الاستحواذ. هذا الرقم يعتمد إلى حد كبير على صعوبة المهمة. يمكن أن نحل العسل يتعلم مهمة بسيطة بعد محاكمة واحدة، لكنها تحتاج إلى ما لا يقل عن ثلاث محاكمات للحث على تشكيل الذاكرة طويلة المدى. كما هو متوقع، فإن نحل العسل تتطلب أكثر بكثير التجارب لمعرفة كاف مهمة صعبة. عموما، هناك عدد ممكن من التجارب بعدها النحل لم تعد تحسن بشكل كبير منالأداء تحت الحمراء. هذا أقصى يعتمد على مهمة محددة، وأنواع رائحة وتركيز، وتركيز السكروز.

عند استخدام أكثر من نوع واحد من المحاكمة مع الروائح المختلفة، وتقديم أنواع مختلفة المحاكمة في تسلسل المزيف للحفاظ على النحل من حفظ تسلسل بسيط من العروض رائحة بدلا من تعلم الفروق بين الروائح ^36. في هذه متواليات المزيف، يجب أن يكون هناك عدد متساو من محاكمات لكل من أنواع الرائحة. أيضا، واحتمال محاكمة من نوع واحد الرائحة التي يسبقها ويتبعها نفس الرائحة، أو أي من الروائح الأخرى، يجب أن يكون على قدم المساواة لجميع الروائح. لمدة الروائح - A و B - استخدام التسلسل التالي: ABBABAAB. على مدى ثماني محاكمات يتم تقديم كل رائحة أربع مرات. سلسلة متواليات متطابقة للوصول إلى العدد المطلوب من التجارب لكل رائحة.

بغض النظر عن التصميم التجريبي، وهناك عدد قليل من المعالم التي يجب أن تبقىثابتة من أجل تحسين التعلم. التداخل بين CS والولايات المتحدة هو أمر حاسم لتكييف فعال. الفاصل الزمني بين المحاكمة (الشكل 1، الجدول 1) يجب أن يكون ثابتا ويكون الأمثل بسبب عدم انتظام أو فاصل زمني قصير جدا أو طويل جدا بين المحاكمة يمكن أن تؤثر بشكل كبير على فعالية تكييف بروتوكول ^1.

الاعتبارات على أهمية والتصميم لتجارب اختبار السلوكية

الردود المسجلة خلال "مرحلة اكتساب" من تجربة، عندما قدم CS والولايات المتحدة معا، يمكن أن تكون مفيدة. ومع ذلك، حذار أن ظروف العرض رائحة يمكن أن تختلف من نوع واحد من محاكمة إلى أخرى. خلال محاكمات المسلحة، وقدم رائحة تليها السكروز بالتزامن مع التحفيز البصري (حركة الجهاز لتقديم الحبرية السكروز) التي يمكن أن تؤثر على استجابة النحل. والنحل لها في المرتبة الثانية بعد ثلاثةق لإظهار استجابة (أربع ثوان من التحفيز رائحة ناقص واحد تداخل ثانية مع العرض السكروز، الشكل 1). إذا ينطوي على التجربة والتعلم للتمييز الروائح اثنين النحل (مثل مصفحة وغير مدعوم)، ورائحة غير المدعومة المقدمة على تجارب بديلة يحدث دون التحفيز البصري للعرض مكافأة والنحل لديهم أربع ثوان كاملة للرد. ولذلك، فإن الردود على اثنين من الروائح غير قابلة للمقارنة تماما خلال الاستحواذ. مع أي بروتوكول تكييف، لا تعتمد فقط على منحنيات الاستحواذ ^1. للتأكد من أفضل ما تعلمه النحل، وإدخال سلسلة من المحاكمات الاختبار غير المدعومة، حيث يتعزز ولا رائحة، والذي يضمن أن اختبار جميع المحفزات يتم في ظروف مماثلة.

تبعا للغرض محدد من التجربة، يمكن أن تتكون اختبار تجارب اختبار واحدة من رائحة مكيفة أو سلسلة من التجارب مع التطوير التنظيمي مكيفةأو أو مزيج من الروائح مكيفة والرواية. محاكمة اختبار واحدة من رائحة مكيفة توفر فحص بسيط عما إذا تذكر النحل "رائحة الهواء. ومع ذلك، وردا على أول اختبار المحاكمة قد تعكس مستوى الدافع النحل "وكذلك استدعاء لها من رائحة الهواء. سلسلة من المحاكمات الاختبار، إما سلسلة من المحاكمات انقراض رائحة مكيفة أو سلسلة من الاختبارات واحدة من كيفت واحد أو أكثر الروائح جديدة، ويمكن أيضا أن تستخدم لتقييم الذاكرة. سلسلة من المحاكمات الانقراض يمكن تقييم مدى قوة تذكر النحل "جمعية مكيفة. أقوى استدعاء عدد أكبر من التجارب اللازمة لاطفاء استجابة مشروطة. سلسلة من الاختبارات واحدة من الروائح مشروطة والرواية يمكن أيضا تقييم خصوصية ذاكرة النحل من رائحة الهواء.

ومن الضروري أيضا أن يكيف واختبار كل من السيطرة والمجموعات المعالجة في النقاط الزمنية نفسها. Comparجي أداء النحل قريبا بعد تكييف للنحل احتجازهم لفترات زمنية أطول إشكالية بسبب التعرض إلى الولايات المتحدة السكروز عن طريق تغذية النحل لشبع. على سبيل المثال، يمكن أن يكون انخفاض في الأداء بعد فترات طويلة بسبب اضمحلال الذاكرة أو قد يكون نتيجة للتغيرات في الدولة المحفزة و / أو التعلم الناجمة عن التعرض غير المدعومة إلى الولايات المتحدة، مما يجعل النتائج غامضة. ولذلك، ينبغي دائما أن يحكم أداء مجموعة العلاج النسبي لمجموعة مراقبة مكيفة واختبارها عند نقاط نفس الوقت.

تركيز الرائحة والنزاهة

هناك العديد من الطرق التي يمكن للتركيز وسلامة رائحة (CS) يمكن أن يتعرض للخطر. المشكلة الأكثر انتشارا مع تسليم رائحة هي رائحة استنزاف خراطيش من الإفراط (الشكل 2). استبدال خراطيش 10-12 الاستخدامات (كل 2 أو 3 تجارب مع مجموعات من 5 عسل النحل) لتجنب هذا المأزق. ومن الأهمية بمكان أيضا استخدامخراطيش جديدة للمحاكمات الاختبار، منذ الخراطيش المستخدمة قد استنفدت بشكل مختلف، وبالتالي الحالية المحفزات رائحة غير متكافئة. مشكلة شائعة أخرى هي التلوث خرطوشة رائحة المقرر أن تستخدم خرطوشة لرائحة أكثر من دون تنظيفه تماما. ويمكن لتدفق الهواء القذرة أو الملوثة أيضا إدخال غير قصد تحفيز حاسة الشم إضافية (يمكن مرشحات الفحم المنشط منع التلوث الخلفية). وهذه مشكلة خاصة عند اقتران PER تكييف مع القياسات من الاستجابات الفسيولوجية للرائحة. خراطيش رائحة تتسرب منها المياه تمثل مشكلة منذ يتعرضون العسل النحل لرائحة قبل أن تبدأ المحاكمة، مما يقلل من بروز التحفيز الرائحة. تركيب فضفاض على العرض الجوي للتسليم رائحة يمكن أن يؤدي إلى ضئيلة أو معدومة تسليم رائحة عندما يفتح صمام، والحد بشكل مصطنع استجابة النحل لرائحة المقصود.

محلول السكروز والمثير غير الشرطي (المكافأة)

في لجبل، والتركيز، وسلامة من الحل السكروز تستخدم الولايات المتحدة حيوية لنجاح التجربة. تكييف هي وظيفة من كمية وتركيز محلول السكروز في الماء تستخدم الولايات المتحدة ^37. ميكرومتر المحاقن المستخدمة في الأسلوب 2 تسمح للدقيقة جدا (وصولا الى 0.2 ميكرولتر) السيطرة على تسليم الولايات المتحدة، ونحن نوصي باستخدام لهم لكلا الأساليب المذكورة. استخدام المسواك (الطريقة 1) كافية للظروف التي الحقن مكلفة لا يمكن استخدام، مثل، في تدريب مجموعات كبيرة من الطلاب، والعمل في هذا المجال، أو ذات الميزانيات المنخفضة. تنفيذ دقيق للطريقة 1 على ما يرام طالما يتم الحفاظ توقيت مع استبدال العادية المسواك لتجنب تراكم السكروز (وتركيز تسليم). ومع ذلك، باستخدام المسواك هو أكثر من الصعب السيطرة عليها بدقة وتقدير كمية وحجم الولايات المتحدة تسليمها، وهو أمر مهم للدراسات تكييف ^1. تركيز السكروز اللازمة لتقديم مكافأة كافية للحفاظ على النحل الدافع لتعلم الجمعية مكيفة يمكن أن تعتمد على صعوبة المهمة والحالة الداخلية النحل "أو الوقت من السنة. المهام أكثر صعوبة تتطلب حلا السكروز العالي للنحل على التعلم بنجاح المهمة. تراكم العفن يمكن في حلول السكروز حتى في 5 ° C، والتي سوف تؤثر سلبا على سلامة الحل، مما يؤثر على صحة النحل والنظرة إلى مكافأة أثناء التجربة. فمن الأفضل أن تحل محل حل كل بضعة أيام.

الدقة، والتوقيت، وتناسق CS والولايات المتحدة التسليم

القضية الأكثر أهمية عن التنفيذ السليم لإجراء PER، أو لهذه المسألة أي إجراء تكييف، ينطوي على دقة وتوقيت واتساق CS والتسليم الولايات المتحدة (الشكل 1). المحققون الذين جديدة إلى الإجراء غير دقيقة حول تسليم واحد أو كلا المحفزات بشكل متكرر. في ISIالتي لا تسمح للتداخل في CS الولايات المتحدة ويؤدي ذلك إلى ضعف الأداء تكييف. المجلس التشريعي بأتمتة إشارة مسموعة للمجرب لتقديم السكروز 3 ثانية بعد بدء تسليم رائحة. يجب أن المحققين عقد السكروز / قطرة المياه القريبة من النحل للتسليم السريع بعد الإشارة. تساعد هذه الإجراءات على جر ISI ثابت. وضع ساعة توقيت بواسطة الساحة تكييف يسمح مريحة وضع وقت المحاكمة فضلا عن رصد الوقت النحل في الساحة قبل وبعد الولادة من المحفزات على حد سواء. بهذه الطريقة ال ITI يمكن أن تكون متسقة نسبيا ويمكن تشغيل الإجراء بأكمله بوتيرة رقابة. يمكن لITI التي هي قصيرة جدا، على سبيل المثال أقل من 1 دقيقة، أو وقتا طويلا يؤدي إلى سوء الأداء ¹ تكييف.

التأثيرات الموسمية والبيئية والسياقية على عسل النحل الأداء

أداء النحل العسل "يمكن أن تتأثر بشكل كبير من قبل محيطهاسواء قبل أو خلال تكييف. في كثير من الأحيان، فإن التقلبات في درجة الحرارة وتوفر الغذاء التي تأتي مع تغير الفصول يغير الدافع النحل على التعلم. عندما الزهور هي في ازهر، والدافع النحل "لتعلم الجمعية مكيفة في المختبر تنخفض ^38. عندما يتم التشديد المستعمرة - من درجات الحرارة القصوى ونقص الغذاء، أو الإجهاد المرتبطة المرض - النحل "سوف تظهر انخفاضا في الأداء داخل تعلمهم. أبقت نحل العسل في غرفة رحلة قد تعلم جيدا لفترة من الوقت، ولكن هناك أيضا من وطأة المرض والشيخوخة تتحلل أداء التعلم مع مرور الوقت. سياق خلال تكييف يمكن أيضا إنقاص الأداء النحل. يمكن لأي الروائح الغريبة، والحركة، والمنبهات الأخرى يصرف النحلة من المحفزات التجريبية. لتجنب هذه المشكلة، والحفاظ على، والسياق البصري مبسط متسقة إلى حد معقول.

النمط الجيني والخبرة يؤثر على أداء PER

<ع الطبقة = "jove_content"> يمكن للعمال النحل العسل تختلف اختلافا كبيرا في الأداء على أي إجراء تكييف بسبب التخصص المهمة، التركيب الوراثي أو العوامل البيئية الأخرى ^20. وبالتالي، فمن المهم توحيد، قدر الإمكان، وأنواع الحيوانات المستخدمة في التجربة من أجل تقليل التفاوت بين الأفراد. في مستعمرة بقيادة ملكة مفتوحة تزاوج، مما يعني أنها تزاوج مع العديد من طائرات بدون طيار مختلفة، والعمال تختلف في التركيب الوراثي لأبيه. الخلفية الوراثية يمكن أن تؤدي إلى اختلافات كبيرة في الاستجابة الحسية ³⁹ و تعلم الأداء ^29. باستخدام المستعمرات بقيادة تلقيح الملكات instrumentally بواسطة الحيوانات المنوية من طائرات بدون طيار واحدة ²⁸ يقلل هذا الاختلاف بين الأفراد.

البروتوكولات المذكورة أعلاه، يتضمن طريقة لجمع العمال نحل العسل من مدخل العش. ومع ذلك، هذه نحل العسل تختلف عن بعضها البعض فيما يتعلق سن أو المهمة السلوكية. قد يكون الاثنان من الصغر (inexperienCED) أو أكثر (أكثر) علافات من ذوي الخبرة. ويمكن أن تكون نحل العسل مما يجعل الشباب رحلات التوجه الأولى بهم. أو أنها قد تكون حارس النحل. للحد من التقلبات، بمناسبة النحل مع طلاء المينا التجفيف السريع أو علامات الوسم إما لأنها تظهر وكأنها البالغين (للسيطرة على العمر) و / أو لأنها تبدأ تستخدم علفا (للسيطرة على الخبرة). ثم، بعد بضعة أيام، وجمع النحل لتكييف ملحوظة. العمال التي تعمل في السلوك التمريض يمكن جمع من الأطر داخل الخلية. الممرضات يمكن تحديدها بشكل إيجابي عندما تضاف رؤوسهم في خلية الحضنة لتغذية ورعاية اليرقات داخل.

باستخدام العذراء كوينز أو الطائرات بدون طيار لتكييف PER

بالإضافة إلى عسل النحل العامل، عذراء ملكات نحل العسل والطائرات بدون طيار يمكن أن تكون مشروطة بسهولة في إجراء PER للدراسات تهدف إلى تطوير الخطوط الوراثية للنحل العسل التي تختلف في تعلم الأداء ^28. وينبغي جمع الملكات العذراء قريبا بعد عشرإرنست و يونغ الخروج من التشرنق وضعها مباشرة في يسخر الزجرية دون تخدير. الشباب، وطائرات بدون طيار غير الناضجة التي تم جمعها من مشط الحضنة داخل مستعمرة هي عموما ليست ذات دوافع للتعلم. بعد أن بدأت التزاوج الرحلات الجوية، طائرات بدون طيار يتعلم بسهولة المهام PER ^28. ينبغي جمعها بعد عودتهم من رحلة التزاوج بين عشية وضحاها وحافظ في قفص صغير في مستعمرة المستخدمة لتربية الملكات. لا تحاول تسخيرها في اليوم السابق تكييف. انهم لا البقاء على قيد الحياة بشكل جيد في التوصيلات بين عشية وضحاها. بضع ساعات قبل تكييف الطائرات بدون طيار يمكن جمعها من أقفاص ووضعها في يسخر الزجرية دون تخدير.

الاستنتاجات

هذا الإجراء PER، في الطريق من الطرق، هو بمثابة نقطة انطلاق لتصميم التجارب PER. سوف تتطلب معظم بروتوكولات PER أن الإجراء المبين تغييرها في بعض الطريق لتنفيذ الأهداف المحددة للتجربة وتسكنالبريد مجموعات العلاج متعددة. فمن السهل لتنفيذ. ومع ذلك، يتطلب التنفيذ السليم والاهتمام بالتفاصيل والممارسة. مرة واحدة يتقن يمكن أن يكون إجراء قوي لإضافة كأداة بحث لعدة برامج البحوث الأساسية والتطبيقية مع أنواع الحشرات المختلفة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378-1KG
Odorant Compounds (for example)
1-hexanol	Sigma-Aldrich	471402-100ML	For additional examples
2-octanone	Sigma-Aldrich	W280208-800G-K	of odorants, see any of
heptanol	Sigma-Aldrich	51778-5ML	the papers on olfactory
gerianol	Sigma-Aldrich	163333-25G	processing from the
nonanal	Sigma-Aldrich	131210-100ML	Smith lab.
Hexane	Sigma-Aldrich	296090-1L
Heavy mineral oil	Sigma-Aldrich	330760-1L	Make sure it’s odorless.
Ethanol	Sigma-Aldrich	459836-1L
Scintillation vials	Sigma-Aldrich	Z190535-1PAK	Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials.
Bee harness			Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing.
Duct tape
Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956-1PAK
Wash bottles	Sigma-Aldrich	Z560847-3EA	For the 70% ethanol.
Dryer tubing
FOR METHOD 1 ONLY
20 ml disposable plastic syringes	Cole-Parmer	WU-07945-18
15 mm filter paper circles	Sigma-Aldrich	Z274844-1PAK
Pushpins
Toothpicks
FOR METHOD 2 ONLY
Gilmont Micrometer syringe, 0.2 ml	Cole-Parmer	EW-07840-00
Gilmont micrometer syringe tip	Cole-Parmer	EW-07841-00
26 G 3/8” Leur hub hypodermic needles	Fisher Scientific	14-826-10
1 cc tuberculin syringes (plastic/glass)	Sigma-Aldrich	Z181641-1EA OR Z192090-200EA	Glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses.
Small rubber/silicone restrictors	Cole-Parmer	EW-95702-02	Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers.
[header]
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
75 x 100 mm filter paper	Sigma-Aldrich	Z695106-500EA
Direct Logic 05 Programmable Logic Controller	Koyo Electronics Industries Co, Ltd
1 mm, 4 mm, & 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing	Cole-Parmer	Various	Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing.
Polypropylene connectors & leur fittings	Cole-Parmer	Various	Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes.
65 mm Correlated Flowmeter	Cole-Parmer	EW-03216-08	Aluminum with glass float; for liquids and gases, with valve.
OR
Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump	Aquacave	AE-TETRA-300
LIF series Solenoid Valves for .042 " ID Tubing, Configuration "E"	The Lee Company	LFAA1200118H	Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280 mW
PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer	RadioShack	273-074