JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الحلزون البحري Aplysia californica وقد استخدمت على نطاق واسع كنموذج البيولوجيا العصبية للدراسات على أساس الخلوية والجزيئية للسلوك. هنا يتم وصف منهجية لاستكشاف الجهاز العصبي من Aplysia للتحليلات الكهربية والجزيئية من الخلايا العصبية واحدة من الدوائر العصبية المحددة.

Abstract

يتمثل التحدي الرئيسي في علم الأحياء العصبية في فهم الأسس الجزيئية للدوائر العصبية التي تحكم سلوكا محددا. بمجرد تحديد الآليات الجزيئية المحددة ، يمكن تطوير استراتيجيات علاجية جديدة لعلاج التشوهات في سلوكيات محددة تسببها الأمراض التنكسية أو شيخوخة الجهاز العصبي. الحلزون البحري Aplysia californica مناسب تماما للتحقيقات في الأساس الخلوي والجزيئي للسلوك لأن الدوائر العصبية الكامنة وراء سلوك معين يمكن تحديدها بسهولة ويمكن التلاعب بسهولة المكونات الفردية للدوائر. وقد أدت هذه المزايا من Aplysia إلى العديد من الاكتشافات الأساسية لعلم الأعصاب من التعلم والذاكرة. هنا نحن نصف إعداد الجهاز العصبي Aplysia للتحليلات الكهربية والجزيئية للخلايا العصبية الفردية. لفترة وجيزة، يتعرض العقدة تشريح من الجهاز العصبي إلى بروتياز لإزالة غمد العقدة بحيث تتعرض الخلايا العصبية ولكن الاحتفاظ النشاط العصبي كما هو الحال في الحيوان سليمة. يستخدم هذا الإعداد لإجراء القياسات الكهربية للخلايا العصبية واحدة أو متعددة. الأهم من ذلك، بعد التسجيل باستخدام منهجية بسيطة، يمكن عزل الخلايا العصبية مباشرة من العقدة لتحليل التعبير الجيني. واستخدمت هذه البروتوكولات لتنفيذ التسجيلات الكهربية في وقت واحد من الخلايا العصبية L7 و R15, دراسة استجابتها للأستيل والتعبير الكمية من الجينات CREB1 في L7 واحدة معزولة, L11, R15, و R2 الخلايا العصبية من Aplysia.

Introduction

الدماغ البشري معقد بشكل غير عادي مع ما يقرب من 100 مليار خلية عصبية وتريليونات من الاتصالات متشابك. هناك ما يقرب من عدد متساو من الخلايا غير العصبية التي تتفاعل مع الخلايا العصبية وتنظيم وظيفتها في الدماغ. يتم تنظيم الخلايا العصبية في الدوائر التي تنظم سلوكيات محددة. على الرغم من التقدم في فهمنا لوظائف الدماغ والدوائر العصبية ، لا يعرف سوى القليل عن هوية مكونات الدوائر التي تتحكم في سلوك معين. معرفة هويات مكونات مختلفة من الدوائر سوف تسهل كثيرا فهمنا للأساس الخلوي والجزيئي على حد سواء من السلوك والمساعدة في تطوير استراتيجيات علاجية جديدة للاضطرابات العصبية والنفسية.

الحلزون البحري Aplysia californica كان العمود الفقري لتحديد الدوائر العصبية الكامنة وراء سلوكيات محددة1-14. يحتوي الجهاز العصبي Aplysia على ما يقرب من 20،000 خلية عصبية يتم تنظيمها في 9 ganglia مختلفة. الخلايا العصبية من Aplysia كبيرة ويمكن التعرف عليها بسهولة على أساس حجمها، والخصائص الكهربائية، والموقف في العقدة. Aplysia لديها ذخيرة غنية من السلوكيات التي يمكن دراستها. أحد السلوكيات المدروسة جيدا هو رد الفعل الخياشيم الانسحابي (GWR). وتقع المكونات المركزية لهذا رد الفعل في العقد البطن. وقد تم رسم خرائط لمكونات دوائر الموارد العالمية وتحديد مساهمات مختلف المكونات. الأهم من ذلك، تخضع دوائر GWR لتعلم ترابطي وغير مرتبط5,6,15-19. عقود من الدراسة على هذا المنعكس كما حددت العديد من مسارات الإشارات التي لها دور رئيسي في التعلم والذاكرة20-24.

تم استخدام العديد من الاستعدادات المختلفة من Aplysia لدراسة الأساس الخلوي والجزيئي لتخزين الذاكرة. وتشمل هذه الحيوان سليمة2,3,إعداد شبهسليمة 1,7,13,14,16 وإعادة تشكيل المكونات الرئيسية للدوائر العصبية25-29. ويرد هنا إعداد مخفض لاستكشاف العقدة Aplysia للتحليلات الكهربية والجزيئية من الدوائر العصبية المحددة. تمت دراسة الخلايا العصبية الأربعة التالية المحددة. R15, انفجار الخلايا العصبية, L7 و L11, تمت دراسة اثنين من الخلايا العصبية الحركية المختلفة وR2, الخلايا العصبية الكوليني. R2 هو أكبر خلية عصبية وصفها في الجهاز العصبي اللافقاريات. باختصار، تتضمن هذه المنهجية علاج البروتيز للجانجليا، والقياسات الكهربية قبل وبعد العلاجات الدوائية، وعزل الخلايا العصبية المفردة للتحليل الكمي للتعبير الجيني. هذه المنهجية تمكننا من الجمع بين التحليلات الجزيئية مع تسجيل متزامن من خلايا عصبية متعددة. وقد استخدمت هذه المنهجية بنجاح لدراسة استجابات الخلايا العصبية R15 و L7 إلى أستيل (أش) عن طريق تسجيلات داخل الخلايا المقترنة. بعد القياسات الكهربية R15 و L7 وغيرها من الخلايا العصبية المحددة مثل L11 و R2 تم عزلها لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) للتعبير عن CREB1 ، وهو عامل نسخ مهم لتخزين الذاكرة.

Protocol

1. إعداد العقد البطني، القياسات الكهربية، وعزل الخلايا العصبية المحددة واحدة من العقدة البطنية من كاليفورنيكا Aplysia

  1. الحفاظ على Aplysia في الحوض المختبر مع تعميم مياه البحر الاصطناعية (ASW) في 16 درجة مئوية تحت 12:12 ضوء: ظروف مظلمة.
  2. عزل العقدة البطنية.
    1. تخدير الحيوانات عن طريق حقن 380 mM MgCl2 حل لمدة 5-10 دقيقة (أي ما يعادل 30-35٪ من وزن جسم الحيوان).
    2. تحديد العقدة البطنية بناء على موقعها في الجهاز العصبي المركزي24,28.
    3. إزالة ganglia عن طريق العملية الجراحية وتخزينها على الفور في مياه البحر الاصطناعية التي تتكون من 450 mM NaCl، 10 MM KCl، 10 mM CaCl2،55 mM MgCl2،2.5 mM NaHCO3،و 10 M HEPES (pH 7.4).
  3. علاج بروتياز.
    1. احتضان العقدة البطن لمدة 30 دقيقة في 34 درجة مئوية±0.5 في طبق بيتري مع 0.1٪ بروتياز (ديسباس) المخفف في ASW المذكورة أعلاه.
      ملاحظة: كمية البروتياز المستخدمة تحتاج إلى أن تكون موحدة مع عمر ووزن الحيوانات. بشكل عام ، فإن الحيوانات الأكبر سنا والأكبر تتطلب المزيد من البروتيز.
  4. إزالة غمد الجانجليا.
    1. بعد معالجة الإنزيم، قم بإلصاق العقدة بقاعدة سيلغارد السيليكون في غرفة الخلية (Ø= 1 سم؛ vol. = 0.3 مل) والتشويش مع ASW (معدل التدفق: 150 ميكرولتر/دقيقة) في درجة حرارة الغرفة (18 درجة مئوية±2).
      ملاحظة: من أجل زيادة رؤية الخلايا العصبية المحددة، ضع العقدة على الجزء العلوي من اسطوانة زجاجية متعددة الكربونات(الشكل 1)(قطر Ø = 2 مم غرفة الخلية المعدلة) التي يمكن أن تضيء بسهولة من أسفل باستخدام مجسم مناظير مع تكبير 20X و 40X.
    2. إزالة بعناية غمد من العقدة باستخدام ملقط وmicroscisors.
  5. تسجيل كهربي في وقت واحد من اثنين من الخلايا العصبية.
    1. تحديد الخلايا العصبية ذات الاهتمام.
    2. إمبالا الخلايا العصبية مع microelectrode حادة واحدة داخل الخلايا مع المقاومة 10-15 MΩ مليئة 3 M KCl الحل.
    3. سجل نشاط الخلايا العصبية (تمرير النطاق 10 كيلوهرتز) باستخدام نظام تسجيل داخل الخلايا.
    4. معالجة بيانات التسجيل باستخدام برامج الفيزيولوجيا الكهربية مثل أكسوغراف.
      ملاحظة: يمكن للمرء بسهولة تنفيذ تسجيل من الخلايا العصبية متعددة. الخلايا العصبية L7, L11 أو R15 و R2 يتم التعرف بسهولة على أساس موقفهم. مطلوب اثنين من مكبرات الصوت واثنين من micromanipulators لتسجيل في وقت واحد من اثنين من الخلايا العصبية L7 و R15 (الشكل 2).
  6. تطبيق المخدرات.
    1. تطبيق المخدرات من اختيار في غرفة الخلية عن طريق الأنابيب لطيف أو حقن مباشرة في الخلايا العصبية.
    2. إجراء القياسات الكهربية.
      ملاحظة: اعتمادا على الهدف التجريبي، يمكن للمرء قياس المعلمات الكهربية المختلفة للخلايا العصبية مثل التغيرات في إمكانات الأغشية (MP) أو إمكانات العمل (AP) قبل وأثناء وبعد تطبيق الدواء.
  7. عزل الخلايا العصبية واحدة.
    1. في ختام التجارب الكهربية، وقف التغلغل ASW وغسل العقدة مع الإيثانول 100٪.  التعرض للإيثانول سوف تحجر الخلايا العصبية و, باستخدام ملقط غرامة, تجعل من السهل لإزالة الخلايا العصبية الفردية دون إتلاف الخلايا العصبية الأخرى من العقدة.
    2. إزالة الخلايا العصبية واحدة تحت مجسم ونقل إلى أنبوب Eppendorf الصغيرة التي تحتوي على الجليد الباردة 500 ميكرولتر الحمض النووي الريبي استخراج كاشف. يمكن تخزين الخلايا العصبية المعزولة في كاشف استخراج الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية للتحليل المستقبلي.

2. عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية واحدة وتحليل التعبير الجيني من قبل PCR الوقت الحقيقي الكمي (qPCR)

  1. الاحتياطات اللازمة لتقليل تدهور الحمض النووي الريبي:
    ريبونوكلياس (RNases) تتحلل الحمض النووي الريبي وهي إنزيمات مستقرة ونشطة جدا. اتخاذ الخطوات التالية أثناء معالجة RNAs.
    1. تنظيف منطقة العمل والأدوات مع RNase تعطيل وكلاء.
    2. ارتداء قفازات في جميع الأوقات أثناء التعامل مع الجيش الملكي النيبالي وتغيير القفازات في كثير من الأحيان.
    3. استخدم فقط البلاستيك الحر RNase للتعامل مع RNAs.
  2. عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية واحدة:
    1. يمكن استخدام بروتوكول تريزول القياسي لعزل الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية المفردة. إضافة لفترة وجيزة 20٪ v/v من الكلوروفورم إلى تريزول، مزيج جيدا عن طريق دوامة وجيزة.
    2. ضع الأنابيب على الدوار لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تدور مزيج تريزول-الكلوروفورم في 12،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    3. جمع المرحلة المائية ونقل إلى أنبوب جديد.
    4. إضافة محلول خلات الصوديوم (pH 5.5) إلى تركيز نهائي من 0.3 M، 100 نانوغرام / مل من جليكوبلو coprecipitant، و 2.5 مجلدات من الإيثانول 100٪ لتسريع الحمض النووي الريبي.
    5. اخلطي العينات جيدا واحتضنيها عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    6. تدور العينات في 12000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية ، وسوف بيليه زرقاء صغيرة تكون مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب.
    7. إزالة supernatant وغسل بيليه مع 850 ميكرولتر من الإيثانول الجليد الباردة 75٪ في 12000 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    8. إزالة supernatant بعناية والهواء الجاف بيليه الجيش الملكي النيبالي لمدة 7-10 دقيقة، كحد أقصى.
      ملاحظة: تأكد من أن لا يترك الجيش الملكي النيبالي لفترة طويلة لتجف كما أكثر-تجفيف بيليه الجيش الملكي النيبالي يجعل التشحيم صعبة للغاية.
    9. مرة واحدة المجففة، resuspend بيليه الجيش الملكي النيبالي في 10 ميكرولتر من المياه الحرة RNAse وتحديد تركيز الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف. عند عدم استخدام على الفور، تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية.
  3. تخليق أرنا من الخلايا العصبية واحدة:
    1. تضخيم الحمض النووي الريبي (جولة أو جولتين اعتمادا على الهدف التجريبي) باستخدام نظام تضخيم الحمض النووي الريبي الخطي المتاح تجاريا.
      ملاحظة: تراوح إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية واحدة من ~ 10-60 نانوغرام. العائد المتوقع من الجولة الأولى من التضخيم هو ~ 100-300 نانوغرام والجولة الثانية من التضخيم هو ~ 0.8-1.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي.
  4. النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي:
    1. لتوليد cDNA من ARNA، استخدم 1.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في 20 ميكرولتر من رد فعل النسخ العكسي. وتتوفر عدة مجموعات من اللوازم تجاريا لهذا الغرض.

      ملاحظة: تم تصنيعها cDNA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة باستخدام الإعدادات التالية على دورة الحرارية.
      5 دقائق عند 25 درجة مئوية
      30 دقيقة عند 42 درجة مئوية
      5 دقائق عند 85 درجة مئوية
      اضغط على درجة حرارة 4 °C
    2. بعد خطوة النسخ العكسي، قم بتخزين cDNA عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  5. تصميم التمهيدي وتوحيد:
    تتوفر العديد من البرامج الممتازة مجانا لتصميم التهيئة للتضخيم في الوقت الحقيقي.
    1. حدد 18-24 مير أوليغونوكليوتيدات التي تنتج 70-110 bp amplicons وتوليف التمهيديات باستخدام مصادر تجارية.
      ملاحظة: يجب تصميم أزواج التمهيدي اثنين إلى ثلاثة لكل جين من الفائدة. كل مجموعة التمهيدي يحتاج إلى توحيدها من قبل qPCR. أزواج التمهيدي الأمامية والعكسية التي تم استخدامها للجين CREB1 (الشكل 4) هي أدناه:

      مجموعة التمهيدي 1
      إلى الأمام: 5'-تاتكتغاكغاغاغاغا-3'
      عكس: 5'-ACCGTGAGAGTCAGTTGTAGA-3'
      مجموعة التمهيدي 2
      خط الهجوم: 5'-أغغااتغاتغاغاغا-3'

      عكس: 5'-GACACACAGAAGTATGCCAAA-3'
    2. لتحديد أفضل التمهيدي ليتم استخدامه لتحليلات المصب، مراقبة قيمة Ct وشكل منحنى التضخيم في qPCR.
      ملاحظة: تعد المبرمجينات التي تعطي قيم Ct (عتبة الدورة) بين 10-35 في التضخيم المستدير الأربعين والمنحنيات السلسة خلال المرحلة الأسية من PCR متبوعة بهضبة ناعمة مثالية لتحليلات التعبير الجيني.
  6. الكمى في الوقت الحقيقي PCR (qPCR):
    ملاحظة: استخدم الأنابيب المناسبة أو اللوحات المتوافقة مع جهاز qPCR.
    1. تمييع cDNA إلى 5x مع ماء خال من النيوكليز.
    2. إلى 2 ميكرولتر من cDNA المخفف، أضف 8 ميكرولتر من مزيج رئيسي qPCR يحتوي على 2 ميكرولتر من H2O، و 5 ميكرولتر من مزيج رئيسي أخضر 2x SYBR، و 1.0 ميكرولتر من 10 ميكرومتر (لكل منهما) إلى الأمام وعكس التمهيدي.
    3. إغلاق الأنابيب وختم لوحة بعد الأنابيب cDNA ومزيج رئيسي. امزج المحتويات عن طريق النقر اللطيف والغزل عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
    4. انتقل إلى إعداد جهاز qPCR.

النتائج

تراوحت أوزان الحيوانات التي استخدمت في هذه الدراسة من 100-200 غرام. بعد البروتوكولات الموصوفة، أجرينا قياسات كهربية وتحليل جزيئي للخلايا العصبية من العقد البطنية المعزولة عن الحيوانات التي تتراوح بين 2-5 غرام إلى 200-300 غرام.

توحيد العلاج بروتياز مهم للقياسات الكهربية الناجحة م?...

Discussion

وتشارك الخلايا العصبية R15 في تنظيم القلب والأوعية الدموية, الجهاز الهضمي, الجهاز التنفسي, والجهاز التناسلي30. نشاط الانفجار الإيقاعي بانتظام من وكالة أسوشيتد برس هو سمة من سمات R15. كما هو مبين في قسم النتائج، تسجيل مقترن من R15 و L7 تظهر أن إعداد ganglia حافظت على نشاط الخلايا العصبية R15. استج...

Disclosures

ليس للمؤلفين أي مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

نشكر بصدق مؤسسة وايتهول على دعمها التمويلي وصناديق الشركات الناشئة من معهد سكريبس للأبحاث على تنفيذ هذا العمل.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AplysiaNational Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaClSIGMAS 3014-1KG
KClSIGMAP 9333-500G
CaCl2•2H2OSIGMAC5080- 500G
MgCl2•6H2OFisher ScientificBP 214-501
NaHCO4SIGMAS 6297-250G
HEPESSIGMAH 3375-500G
ProteaseGIBCO17105-042
TrizolAmbion15596-026
ChloroformMP Biomedicals2194002
100% EthanolACROS64-17-5
GlycoBlueAmbionAM9515
3 M NaOAc, pH 5.5AmbionAM9740
Nuclease free waterAmbionAM9737
MessageAmp II aRNA Amplification KitAmbionAM1751
qScript cDNA SuperMixQuanta Biosciences95048-100
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
ForcepsFine Science Tools11252-20
ScissorsFine Science Tools15000-08
Stainless Steel Minutien Pins Fine Science Tools26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal CyclerApplied BiosystemsVeriti Thermal Cycler
5430R CentrifugeEppendorf5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCRApplied Biosystems7900HT Fast Real-Time PCR
AmplifierBRAMP-01RNPI Electronics
Digidata ConverterInstrutech ITC-18HEKA ELEKTRONIK
Micro ManipulatorPatch StarScientifica

References

  1. Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
  2. Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
  3. Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
  4. Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
  5. Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
  6. Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
  7. Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
  8. Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
  9. Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
  10. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
  11. McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
  12. Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
  13. Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
  14. Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
  15. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
  16. Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
  17. Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
  18. Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
  19. Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
  20. Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
  21. Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
  22. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  23. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
  24. Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
  25. Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
  26. Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
  27. Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
  28. Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
  29. Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
  30. Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
  31. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
  32. Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  33. Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
  34. Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
  35. Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
  36. Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
  37. Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
  38. Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
  39. Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
  40. Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
  41. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
  42. Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O'Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
  43. Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
  44. Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
  45. Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
  46. Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
  47. Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
  48. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  49. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
  50. Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
  51. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
  52. Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
  53. Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
  54. Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
  55. Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
  56. Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
  57. Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

83 CREB Aplysia californica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved