دراسة الهجرة خلية في القنوات Microfabricated

Summary

يوصف الأسلوب الكمي لدراسة الهجرة عفوية من الخلايا في المكروية يقتصر ذات بعد واحد. هذا الأسلوب يستفيد من القنوات microfabricated، ويمكن استخدامها لدراسة هجرة عدد كبير من الخلايا تحت ظروف مختلفة في التجارب واحد.

Abstract

الطريقة الموضحة هنا يسمح دراسة الهجرة الخلية تحت الحبس في بعد واحد. لأنه يقوم على استخدام القنوات microfabricated، التي تفرض النمط الظاهري الاستقطاب إلى الخلايا عن طريق القيود المادية. مرة واحدة داخل القنوات، وخلايا لديها سوى احتمالين: التحرك إلى الأمام أو الخلف. هذه الهجرة مبسطة الذي يقتصر الاتجاهية يسهل التتبع التلقائي للخلايا واستخراج المعلمات الكمي لوصف حركة الخلية. وتشمل هذه مؤشرات قوة الاندفاع الخلية، والتغيرات في الاتجاه، وتوقف أثناء الحركة. Microchannels هي أيضا متوافقة مع استخدام علامات الفلورسنت، وبالتالي فهي مناسبة لدراسة توطين عضيات داخل الخلايا والهياكل أثناء الهجرة الخلية بدقة عالية. أخيرا، والسطح من القنوات يمكن بين functionalized مع ركائز مختلفة، والسماح للسيطرة على خصائص لاصقة من القنوات أو دراسة haptotaxis. وباختصار، فإن نظام حيحرث صفها يهدف إلى تحليل هجرة أعداد الخلايا الكبيرة في الظروف التي يتم التحكم كلا من الهندسة والطبيعة والكيمياء الحيوية للبيئة، وتسهيل تطبيع واستنساخ تجارب مستقلة.

Introduction

الهجرة هي وظيفة الخلوية المعقدة وهذا أمر مهم لكثير من العمليات الفسيولوجية في الكائنات متعددة الخلايا، بما في ذلك التنمية، الاستجابات المناعية، وتجديد الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، بعض الحالات المرضية مثل غزو الورم والانبثاث تعتمد على خلية حركية ^1. لهذه الأسباب، فقد أصبحت الهجرة الخلية حقل رئيسي للدراسة في سياق البحوث الأساسية ومتعدية على حد سواء. في الجسم الحي، وتتميز معظم الأنسجة عن طريق مصفوفة خارج الخلية الغنية وكثافة الخلايا عالية. الهجرة الخلية وبالتالي، في ظل الظروف الفسيولوجية، ويحدث في بيئة محصورة المعقدة. كلاسيكيا، وقد درس الهجرة الخلية على الأرجح لأسباب تاريخية وحدود التقنية في أنظمة 2D المسطحة التي لا تتكاثر العديد من خصائص البيئة جدت في الأنسجة، مثل الحبس. علاوة على ذلك، عوامل مثل التصاق الخلية، التي تعتبر ضرورية لحركية في 2D، وقد أظهرت مؤخرا أن لا يكون necessaمطلوب rily للهجرة في الجسم الحي أو داخل المواد الهلامية، مما يوحي بأن الآليات التي تحكم تحرك خلية في 2D و في بيئات أخرى تختلف ^2. وقد تم تطوير عدة أنظمة لمحاكاة خصائص معقدة من الأنسجة، والمواد الهلامية يجري الكولاجين الأكثر شهرة، والتي تهدف إلى تلخيص خصائص تكوين المصفوفة خارج الخلية ^3. ونحن هنا نقترح microchannels كوسيلة مكملة بسيط هو أن يسمح للهجرة الخلية الدراسة في بعد واحد تحت بيئة محصورة.

في هذا النظام تهاجر الخلايا جنبا إلى جنب في microchannels التي يدخلون من تلقاء أنفسهم. الخلايا المهاجرة ثم الحصول على شكل قنوات، واعتماد هندسة أنبوبي أن يعزز على الأرجح قطبية بهم. حركة خطية من الخلايا في قنوات يسمح تتبع خلية الآلي واستخراج المعلمات كمية من التجارب. من الناحية الفنية، وهذا النظام هو سهلة ومرنة. وcoatinغرام من جدران القناة ويمكن التلاعب بها، وحجم وشكل القنوات يمكن تكييفها، ويمكن تحليل عدد كبير من الخلايا في تجارب واحد. هذا النظام يمكن زيادتها المتابعة أيضا لإجراء تحليل الشاشة متوسطة المدى من الجزيئات المشاركة في حركية الخلية. بروتوكول الموصوفة هنا كانت موحدة باستخدام الخلايا الجذعية (DC) كنموذج الخلوية. هذه الخلايا هي المفتاح لجهاز المناعة كما أنها تشارك في بدء وصيانة الاستجابات المناعية محددة ^4. في المختبر، وقد تبين أن البلدان النامية إلى الهجرة بشكل عفوي في البيئات المحصورة وبالتالي فهي نموذجا جيدا لدراسة حركية خلية في microchannels ^5،6 . الأهم من ذلك، هذا النظام يمكن تمديدها لتحليل الهجرة إلى أي نوع من الخلايا متحركة أخرى اللمفاويات التائية، العدلات، أو الخلايا السرطانية ^7-9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة هامة: يفترض هذا البروتوكول الذي القالب الذي يحتوي على شكل لو microchannels المطلوب أحرز بالفعل. مزيد من المعلومات حول إعداد القالب تم نشره بالفعل ^10. يفترض هذا البروتوكول أيضا أن الثقافة البلدان النامية نخاع العظم هو معروف.

1. رقاقة تلفيق

1. مزيج النفط PDMS وكيل علاج في نسبة الوزن 10:01 في كوب من البلاستيك. خلط كل من المركبات بدقة.
2. يلقي المزيج فوق و microchannels تحمل العفن. يجب أن يكون الارتفاع الكلي بين 0.5-1 سم.
3. إزالة فقاعات الهواء في جرس جرة الفراغ خلال 1 ساعة.
4. PDMS تتصلب في القالب عن طريق وضع هذا الأخير في الفرن لمدة 2 ساعة على 65 درجة مئوية.
5. مرة واحدة في PDMS هو في درجة حرارة الغرفة، وقطع قطعة كبيرة حول هيكل بشفرة الجراحية وقشر تشغيله من القالب (الشكل 1A).
6. حفر ثقوب حيث سيتم حقن الخلايا (عادة 2 ملم) وتغيير حجم PDMSمع شفرة جراحية لتناسب حجم الأطباق الزجاجية القاع التي سيتم تقييم الهجرة (الشكل 1B). قبل المتابعة، وإزالة الغبار المتبقي من الطبق باستخدام عدسة تنظيف الورق. هذا تفضل ملزمة من PDMS على الزجاج هو موضح في الخطوة 1.10.
7. تنظيف رقاقة PDMS حجمها تحتوي على القنوات عن طريق الالتزام وتقشير شريط لاصق على الجانبين الهيكل.
8. يصوتن القطع PDMS 30 ثانية في 70٪ من الإيثانول لإزالة الغبار والجسيمات الصغيرة PDMS. تجفيفها بسرعة بعد ذلك من قبل تهب الهواء النقي.
9. تفعيل PDMS (هياكل صعودا) والأطباق الثقافة عن طريق الجو (أو الأكسجين) العلاج البلازما خلال 30 ثانية في 300 mTorr.
10. وضع كل السطوح تفعيلها على اتصال دائم التمسك PDMS إلى الركيزة. إذا لزم الأمر، واستخدام ملقط معدني للضغط قليلا على الجزء العلوي من PDMS لإجبار الاتصال بين البوليمر والزجاج من الطبق (الشكل 1C).
11. احتضان شريحة في الفرن عند 65 درجة مئوية FOص 1 ساعة إلى تعزيز ملزمة.

2. طلاء Microchannels

1. تفعيل الهيكل كله من قبل البلازما الجوية في 300 mTorr لمدة 1 دقيقة. وهذا تشجيع دخول السائل في القنوات في الخطوة التالية.
2. ملء الثقوب بسرعة دخول رقاقة مع فبرونيكتين في 10 ميكروغرام / مل في الماء. ركائز أخرى مثل PEG يمكن أن تستخدم لتعديل الالتزام الخلية إلى جدران القناة. الانتباه إلى أن السائل ينتشر في جميع أنحاء هيكل كامل. هذا ويمكن التحقق بسهولة من خلال العين تحت ضوء العادية أو باستخدام مجهر حقل مشرق العادية.
   ملاحظة: في هياكل صغيرة جدا، والذي نشر هو أصعب، يمكن أن يجبر دخول السائل في القنوات عن طريق وضع هيكل في جرس جرة فراغ خلال 15 دقيقة على الأقل. للتحقق من كفاءة الطلاء ركائز الفلورسنت يمكن استخدامها (الشكل 2).
3. احتضان 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح الامتزاز من فبرونيكتين أو أي SUBST طلاء أخرىمعدل لجدران القنوات.
4. غسل الهياكل 3x أخرى مع برنامج تلفزيوني لإزالة الركيزة nonbound.
5. بعد الغسيل، والمضي قدما في البروتوكول 3 أو تخزين رقاقة في 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا (24 ساعة كحد أقصى).

3. خلية تحميل

1. إزالة برنامج تلفزيوني من لوحة وملء مع الميكروسيستم المتوسطة الخلية. دعونا احتضان لمدة 1 ساعة لتشبع قنوات مع المتوسط.
   ملاحظة: للحصول على التجارب التي تنطوي على المخدرات مثل مثبطات جزيء، وينصح ليحضن مسبقا القنوات مع المتوسط ​​تحتوي على المخدرات في تركيز الحق. علاوة على ذلك، بعض الأدوية تميل إلى ذوبان في هيكل PDMS مما يقلل من التركيز الفعال. وقد اقترحت بعض الحلول لمواجهة هذه القضية ^11-12.
2. إزالة العائمة البلدان النامية واستعادة الخلايا شبه ملتصقة بواسطة بيغ مع الثقافة المتوسطة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
   ملاحظة: للحصول على التصوير النواة، يمكن تحقيق هويشت 33342 تلطيخ مسبقا من قبل فيcubating 2 × 10 ⁶ خلايا خلال 30 دقيقة مع الصبغة في 200 نانوغرام / مل في المتوسط ​​كاملة. يغسل مرتين بواسطة الطرد المركزي لإزالة الزائدة من الصبغة قبل مواصلة البروتوكول.
3. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق (الوقت والسرعة يمكن أن تكون مختلفة اعتمادا على نوع من الخلايا) وتجاهل المتوسطة. تمييع بيليه للوصول إلى تركيز 20 × 10 ⁶ خلية / مل.
4. إزالة الزائدة متوسطة من لوحة وتفريغ الثقوب دخول في هيكل PDMS باستخدام micropipette. ملء الإدخالات مع 5 ميكرولتر من حل الخلية لتصل إلى مبلغ 1 × 10 ⁵ خلايا في كل ثقب الدخول.
   ملاحظة: مطلوب كثافة الخلايا عالية لصالح الاتصال من الخلايا التي تحتوي على القنوات. قد يؤدي انخفاض كثافة الخلايا في انخفاض عدد خلايا داخل القنوات وفشل التجربة.
5. احتضان رقاقة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. إضافة 2 مل من المتوسط ​​كاملة على طبق التجربة.
   ملاحظة: هيكل PDMS كله يجب به مغطاة من أجل تجنب جفاف الخلايا أثناء التجربة. إذا 2 مل ليست كافية، إضافة المزيد من المتوسطة لتغطية كامل هيكل PDMS.

4. التصوير

1. تنظيف السطح السفلي الخارجي من الأطباق مع الأنسجة تنظيف العدسة قبل وضع لوحات تحت المجهر.
2. لتحليل الهجرة في عدد كبير من الخلايا، استخدم 10X التكبير وإضاءة حقل واسع في CO ₂ ودرجة الحرارة مجهزة الفيديو المجهر (الشكل 3). لتسهيل تتبع الخلية، هويشت تلطيخ والأشعة فوق البنفسجية يمكن استخدام ضوء (انظر الخطوة 3.2). الهجرة يمكن أن يكون تحليلها أيضا باستخدام متحد البؤر المجهري من أجل الحصول على دقة أعلى من الهياكل الخلوية أثناء الترحيل.
3. للفحص المجهري الوقت الفاصل في 10X، واختيار تردد وقت وفقا لسرعة خلية المتوقع (عادة 2 دقيقة للخلايا الجذعية المهاجرة مع سرعة من 5 ميكرون / دقيقة).
   ملاحظة: بروتوكول الموصوفة هنا لا نبعد التمديد تشمل تحليل المعلمات هجرة الخلية. وفيما يلي بعض النقاط في المناقشة لتقديم المشورة للقراء بشأن كيفية المضي قدما لانتزاع معلومات من الأفلام الفاصل الزمني.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في كل تجربة وهي مغلفة سطح PDMS مع جزيء تكييفها لمصلحة الدراسة. ويبين الشكل 2 القنوات المغلفة مع جزيء نيون، PLL-G-PEG، قبل وبعد غسل (الخطوة 2.4). هذه التجربة تسمح للسيطرة على تجانس الطلاء في القنوات.

بعد تحميل الخلية، المجهري الفيد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نحن هنا وصف الجهاز يتكون من microchannels كوسيلة لدراسة خصائص المهاجرة من عدد كبير من الخلايا في تجارب واحد. هذا النظام التجريبي يحاكي القيود البيئية تقتصر جدت في أنسجة الخلايا المهاجرة الذاتية. ومع ذلك، من خلال إجبار الهجرة في بعد واحد، فإنه يسهل تتبع خلية الآلي واستخراج ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2.5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254