JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن هنا وصف اثنين من المقايسات لقياس تفعيل مكملا الناجم عن أجسام مضادة ضد خلايا الدم الحمراء. وميزة كبيرة على المقايسات الحالي الكمي وطبيعة السهل تفسير ل.

Abstract

أجسام مضادة ضد خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) يمكن أن يؤدي إلى تنشيط تكمل مما أدى إلى تسارع التخليص عبر مستقبلات مكملا في الكبد (انحلال الدم خارج الأوعية) أو يؤدي إلى تحلل كرات الدم الحمراء داخل الأوعية الدموية لل. Alloantibodies (على سبيل المثال ABO) أو الأجسام المضادة لمستضدات RBC (كما رأينا في فقر الدم الانحلالي الذاتية، AIHA) مما يؤدي إلى تفعيل تكمل يحتمل أن تكون ضارة ويمكن أن يكون - وخصوصا عندما يؤدي إلى تحلل داخل الأوعية الدموية - 1 القاتلة. حاليا، تكمل التنشيط بسبب (السيارات) الأجسام المضادة في كرات الدم الحمراء في المختبر يتم تقييم باستخدام اختبار كومبس يعكس ترسب تكمل على RBC أو عن طريق فحص الدم الانحلالي nonquantitative يعكس RBC تحلل 1-4. ومع ذلك، من أجل تقييم فعالية مثبطات مكملا، وهي ملزمة أن يكون التقنيات الكمية. نحن هنا وصف اثنين من هذه التقنيات. الأول، وهو فحص للكشف عن C3 و C4 ترسب على خلايا الدم الحمراء التي يسببها الأجسام المضادة في مصل المريض قبلsented. لهذا، يتم استخدام تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية مع fluorescently المسمى مكافحة C3 أو C4 لمكافحة الأجسام المضادة. المقبل، وصفت الحالة للدم الفحص الكمي. يتم قياس انحلال الدم بوساطة تكمل في هذا الاختبار، الناجمة عن المصل المريض استفادة من الكشف الطيفي من الهيموغلوبين الافراج عنهم. كل من هذه المقايسات استنساخه جدا والكمية، وتسهيل الدراسات التنشيط تكملة الناجم عن الأجسام المضادة.

Introduction

أجسام مضادة ضد خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) يمكن أن يتسبب عن طريق نقل الدم من كرات الدم الحمراء معربا عن مستضد والذي هو غير موجود على كرات الدم الحمراء المتلقي. ويمكن لهذه الأجسام المضادة ألو يسبب ردود فعل الانحلالي الحاد نقل نظرا لتكمل التنشيط على نقل التالية 5. في المناعة الذاتية فقر الدم الانحلالي (AIHA)، المرضى الذين لديهم أضداد ذاتية ضد كرات الدم الحمراء الخاصة بهم. وهذا يؤدي إلى تسارع إزالة الخلايا عن طريق التفاعل بين مفتش ملزمة لكرات الدم الحمراء مع Fcγ-المستقبلات على البالعات في الطحال و / أو في حالة أضداد ذاتية قادرة على تنشيط مستقبلات مكملا عبر مكملا في الكبد 6،7. تفعيل مكملا مداهم انحلال الدم داخل الأوعية الدموية مما يؤدي إلى أمر نادر الحدوث ولكن غالبا ما يكون مميتا. المعجل، تكمل بوساطة الدمار الناجم عن RBC إما النتائج أو الأجسام المضادة في ألو فقر الدم الحاد ونقص الأكسجة الأنسجة وبالتالي يحتمل أن تكون قاتلة. تصنف الأجسام المضادة لصناعة السيارات في AIHA في الأجسام المضادة الحارة والباردة، DEPENDINز على درجة الحرارة المثلى التي تربط لكرات الدم الحمراء (37 درجة مئوية أو أقل، على التوالي). الأجسام المضادة الدافئة وعادة ما تكون من مفتش نمط إسوي والأجسام المضادة الباردة من الغلوبولين المناعي نمط إسوي 8،9. AIHA يمكن أن تكون ثانوية بالنسبة لمثل lymphoprolyferative اضطرابات وأمراض النسيج الضام، والأورام الصلبة، والالتهابات أو المخدرات، ولكن في 50٪ من الحالات مجهولة السبب هو AIHA 9.

يتم إجراء كشف gammaglobulins (على سبيل المثال. مفتش أو الغلوبولين المناعي) وتكمل ملزمة لكرات الدم الحمراء المريض عن طريق اختبار ضد الغلوبولين المباشرة نصف كمي (كومبس) (DAT). في DAT يتم تحضين كرات الدم الحمراء المريض مع المضادة للمفتش أو المضادة للC3D. حدوث تراص RBC يوضح وجود مكونات تكملة المرفقة أو مفتش ملزمة. يتم إجراء الكشف عن الأجسام المضادة، ألو أو في مصل المريض عن طريق اختبار ضد الغلوبولين غير المباشرة (IAT). في معهد التكنولوجيا التطبيقية، يتم تحضين اختبار كرات الدم الحمراء المعالجة بروميلين مع مصل المريض، وغسلها ثم حضنت مع المضادة للحأومان مفتش. في حال تم توعية كرات الدم الحمراء مع المضادة للمفتش RBC موجودة في مصل المريض تراص سيحدث. والأجسام المضادة الغلوبولين المناعي لكرات الدم الحمراء يؤدي مباشرة إلى تراص على حضانة اختبار كرات الدم الحمراء المعالجة بروميلين مع مصل المريض. ويتم تقييم RBC تراص في اختبار كومبس المباشر أو في IAT بصريا إما عن طريق العين في أنبوب اختبار أو عن طريق تحميل العينة على عمود Sephadex صغيرة تفصل كرات الدم الحمراء التصق واحد عن طريق حجم 1.

آخر تقنية استخداما لقياس تفعيل تكمل على كرات الدم الحمراء هو فحص الدم الانحلالي 1، التي يتم فيها تقييم قدرة المريض المصل للحث (بوساطة تكمل) انحلال الدم من كرات الدم الحمراء المعالجة بروميلين 10. ويلاحظ اختبار بأنها إيجابية عندما طاف بعد الطرد المركزي اتسخت الأحمر بسبب الهيموغلوبين صدر ويعتبر أن تكون سلبية إذا كان لا يزال عديم اللون. كل من اختبار ضد الغلوبولين وفحص الدم الانحلالي هي نصف كمي، منذ أعلى سيرووتدل م التخفيف التي الاختبار لا تزال ايجابية.

اختبار ضد الغلوبولين وفحص الدم الانحلالي والمقايسات قوية التي يتم استخدامها بشكل روتيني في التشخيص. لأن هذه القياسات ليست نصف كمي ويعتمد على تجربة أداء فني الفحص أنها ليست مناسبة لدراسة الفروق الدقيقة التنشيط تكمل على كرات الدم الحمراء، حسب الحاجة عند تقييم فعالية مثبطات مكملا. لذلك، قمنا بتطوير اثنين من المقايسات الكمية لتحديد التنشيط مكملا بنسبة (السيارات) الأجسام المضادة لكرات الدم الحمراء، والتي سنقوم بشرح في هذه الورقة.

الأول، وضعنا مقايسة لقياس ترسب شظايا تفعيل المتممة C3 و C4 على كرات الدم الحمراء (الشكل 1A). في هذا الاختبار، يتم تحضين المعالجة بروميلين الإنسان نوع 0 كرات الدم الحمراء مع المصل الحرارة المعطل المريض (المضادة للRBC مصدر الأجسام المضادة)، مصل AB الطازجة (المصدر مكملا) والمضادة للC5 ريتوكسيماب (Eculizumab). خلال هذا المؤتمر الوطني العراقيubation، سوف تحدث C3 و C4 ترسب إذا كان المصل يحتوي على المريض تكمل تفعيل الأجسام المضادة للRBC. من أجل منع تحلل RBC عن طريق تفعيل تكملة المصب يتم إضافة عرقلة مكافحة C5 وحيدة النسيلة الأجسام المضادة. المقبل، يتم الكشف C3 و C4 ترسب على كرات الدم الحمراء عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة fluorescently المسمى أو فاب-شظايا التفاعل مع C3 و C4، على التوالي. تبوب على كرات الدم الحمراء واحدة من المهم لضمان موثوقية النتائج. وتشمل مزايا هذه التقنية أن كمية صغيرة من مادة المريض هو مطلوب، تكمل التنشيط في مرحلة مبكرة من تتالي يتم تقييم والأسلوب هو استنساخه والكمي. ميزة إضافية للنظر في كل من C3 و C4 هو أن التمييز يمكن أن يتم بين الكلاسيكية وكتين تفعيل المسار (سواء C3 و C4 ترسب) وتفعيل مسار بديل (C3 فقط ترسب). استخدام كرات الدم الحمراء المعالجة بروميلين بدلا من كرات الدم الحمراء غير المعالجة يزيد من حساسية كمايقول.

ويستند الفحص الثاني على فحص الدم الانحلالي المستخدمة حاليا (الشكل 1B). يتم تحضين المعالجة بروميلين الإنسان نوع 0 كرات الدم الحمراء مع المصل الحرارة المعطل المريض (المضادة للRBC مصدر الأجسام المضادة) والمصل AB الطازجة (مصدر مكمل). إذا تم تنشيط مكملا من قبل الأجسام المضادة للRBC المريض، سوف تحدث الجرعة تعتمد RBC تحلل، مما يؤدي إلى إطلاق سراح من الهيموغلوبين. وكميا كمية الهيموجلوبين صدر عن طريق قياس الامتصاصية في 414 نانومتر في في طاف بعد الغزل أسفل كرات الدم الحمراء سليمة ومجزأة. الامتصاصية يرتبط مع كمية من انحلال الدم حدث. وعلى النقيض من الفحص المستخدمة حاليا، وهذا البروتوكول يسمح للهدف، والقيمة الكمية للانحلال الدم وهذا هو استنساخه جدا ولا تعتمد على الشخص تفسير الفحص.

وقد وصفت لتطبيق هذه الأساليب في 11، حيث كان احتمال استخدام مثبط C1-كما المانع مكملا في AIHA قtudied.

Protocol

1. إعداد بروميلين المعاملة خلايا الدم الحمراء

  1. خلايا الدم الحمراء كتبته-0 غسل 3x أخرى مع برنامج تلفزيوني 1X (الطرد المركزي في 664 x ج لمدة 2-5 دقيقة).
  2. احتضان 1 حجم كرات الدم الحمراء محملة مجلدين من حل بروميلين 0.5٪ لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X 3x أخرى.
  4. الخلايا يمكن تخزينها كحل 3٪ في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني 1X لمدة أسبوع واحد على الأقل.

2. C3 و C4 تحليل ترسب على كرات الدم الحمراء عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية

  1. للحرارة تعطيل المبلغ المطلوب من مصل المريض (أو غيرها من مصدر الأجسام المضادة لمكافحة RBC) عن طريق تسخين العينة لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية.
  2. غسل كرات الدم الحمراء المعالجة بروميلين ثلاث مرات في VBG - (5 ملي Veronal، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.05٪ الجيلاتين ودرجة الحموضة 7.4) و resuspend لهم في VBG + + (VBG - + 2 + 2 ملي MgCl 10 مم CaCl 2) لإعطاء 0.5٪ محلول.
  3. ماصة المكونات التالية في لوحة جولة القاع مع كوب اللؤلؤ (وأو الخلط السليم): 25 ميكرولتر كرات الدم الحمراء 0.5٪، 37.5 ميكرولتر مصل الطازجة AB (مصدر مكمل) و 37.5 ميكرولتر 200 ميكروغرام / مل مكافحة C5. مكافحة C5 مكلفة ويمكن أن يكون من الصعب الحصول عليها. يمكن للمرء أن تنظر في استخدام المصل أو C5-/C6-/C7- C8-ناقصة بدلا من AB المصل ومكافحة C5.
  4. إضافة مصل المريض لكل بئر إلى تركيز النهائي من 0،1 حتي 33٪. الصحيح الاختلافات في تركيز المصل لكل بئر بسبب استخدام الحرارة المعطل AB المصل. إضافة VBG + + للحصول على الحجم النهائي من 150 ميكرولتر / جيد. لوحة الوثيق مع ELISA احباط.
  5. احتضان 1.5-2 ساعة عند 37 درجة مئوية في حين تهتز.
  6. غسل كرات الدم الحمراء ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني + 0.5٪ BSA (الطرد المركزي في 664 x ج لمدة 2 دقيقة).
  7. إضافة fluorescently المسمى مكافحة C3 والاجسام المضادة لمكافحة C4 أو شظايا فاب الخاصة بهم (للحد من تراص) في برنامج تلفزيوني + 0.5٪ BSA إلى تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل. هنا وضعت مخصصة لمكافحة C3-اليكسا فلور 488 وتستخدم لمكافحة C4-اليكسا فلور 647 الاجسام المضادة، واختيار تساه تسميات الفلورسنت يسمح الكشف في وقت واحد من C3 و C4 بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية.
  8. احتضان 30-45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
  9. غسيل كرات الدم الحمراء 3X مع برنامج تلفزيوني + 0.5٪ BSA.
  10. في resuspend كرات الدم الحمراء 150 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني +0.5٪ BSA وماصة لهم في لوحة جديدة (للتخلص من اللؤلؤ الزجاج قبل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية).
  11. تحليل أداء نظام مراقبة الأصول الميدانية. الخلايا وحيدة منفصلة عن الحلل في مبعثر بالتآمر FSC-A؛ تعيين البوابة على كرات الدم الحمراء واحد، واختيار القناة المناسبة للكشف عن الإشارات مضان (مثل FITC وAPC).
  12. قياس النتائج باستخدام كثافة مضان وسيطة.

ملاحظة: من الممكن استخدام isotype السيطرة (على سبيل المثال وصفت fluorescently مكافحة IL6 الماوس IgG1). ومع ذلك، فمن المستحسن لتشمل مراقبة سلبية حقيقية مثل التي يحتضنها كرات الدم الحمراء دون مصل المريض (فقط AB المصل) أو بدون مصدر مكمل (الحرارة المعطل AB المصل والمصل المريض الحرارة المعطل)، ود ثم وصمة عار هذه مع نفس المضادة للC3-اليكسا فلور 488 والمضادة للC4-اليكسا فلور 647 الأجسام المضادة. وهذا يعطي المزيد من السيطرة صالحة من مجرد isotype السيطرة في حالة خلايا الدم الحمراء 12، على الرغم من أن هذه الضوابط المختلفة عادة ما تعطي نفس، نتائج سلبية.

3. الفحص الانحلالي الكمي

  1. للحرارة تعطيل المبلغ المطلوب من الأمصال المريض (أو غيرها من مصدر الأجسام المضادة لمكافحة RBC) عن طريق تسخين العينة 30 دقيقة في 56 درجة مئوية.
  2. غسيل كرات الدم الحمراء 3X مع VBG - ومرة واحدة مع VBG + +.
  3. ماصة المكونات التالية في لوحة جولة القاع مع لؤلؤة الزجاج (لخلط السليم): 35 ميكرولتر 3٪ كرات الدم الحمراء، و 25 ميكرولتر الطازجة المصل AB (مصدر مكمل) ومصل المريض 1-50٪. الصحيح الاختلافات في تركيز المصل باستخدام الحرارة المعطل AB المصل. إضافة VBG + + للحصول على الحجم النهائي من 150 ميكرولتر / جيد. لوحة الوثيق مع ELISA احباط.
  4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5-2 ساعة مع اهتزاز.
  5. Cلوحة entrifuge في 664 x ج لمدة 5 دقائق مع خفض التباطؤ (مثل التباطؤ إلى وقف كامل في 2-3 دقيقة).
  6. ماصة بعناية طاف 90 ميكرولتر في وحة microtiter جديدة. من المهم في هذه الخطوة لمنع فقاعات الهواء ومنع أن تتخذ على طول خلايا سليمة.
  7. قياس A414/690 في معمل مناسبة.
  8. تعبير عن تحلل كنسبة مئوية من تحلل كرات الدم الحمراء لعينة بالماء النقي.

النتائج

ويبين الشكل 2A مؤامرة مبعثر ممثل لكرات الدم الحمراء. ويمكن رؤية النابضة مناسبة لكرات الدم الحمراء واحدة في دي FSC-W - FSC-A مؤامرة (P1). عادة حوالي 95٪ من كرات الدم الحمراء تقع ضمن هذه البوابة P1 (الخلايا واحد)، ولكن عندما يتم استخدام نسبة عالية من مصل المريض، وهذا يمكن ...

Discussion

المقايسات أعلاه هي استنساخه وقوية. فهي سهلة لأداء وأنه من الممكن القيام بها مع العديد من العينات في نفس الوقت (في لوحة 96 أيضا). وبالتالي، فإن هذا النهج أيضا أن تكون مناسبة لنظام مؤتمتة بالكامل، مثل نظام الروبوت ELISA. وعلى النقيض من التقنيات المستخدمة حاليا، وهذه ال...

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

SZ وDW تتلقى منحة غير المقيد للViropharma.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PBSFresenius Kabi 
BSASigmaB-4287 
BarbitalFagron0261This chemical is subject to drug regulation.
Sodium BarbitalFagron0263This chemical is subject to drug regulation.
GelatinMerck1.0470.0500 
Sodium chlorideMerck1.06404.1000 
Magnesium ChlorideMerck1.05833.0250 
Calcium chlorideMerck1.0238.0500 
Dylight 488 amine reactive dyePierce46402 
Dylight 650 amine reactive dyePierce62265 
αC5 (Eculizumab)Alexion Pharmaceuticals 
FACS (Canto)BDAny FACS can be used that has the appropiate lasers.
Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) Thermo Labsystems1500-193Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used
BD FACSDiva software v 6.1.2BD643629Any compatible FACS analysis software can be used
Bromelain SanquinK1121 

References

  1. Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
  2. Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
  3. Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
  4. Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr, ., R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
  5. Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
  6. Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
  7. Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
  8. Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
  9. Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
  10. Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
  11. Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
  12. Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

83 C1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved