الإنتاجية العالية للفحص واسع الطيف الكيميائية مثبطات الحمض النووي الريبي الفيروسات

Summary

في فحوصات المختبر لقياس تكاثر الفيروس قد تحسنت إلى حد كبير من خلال تطوير فيروسات الحمض النووي الريبي المؤتلف معربا عن luciferase المراسل أو الإنزيمات الأخرى قادرة على تلألؤ بيولوجي. نحن هنا من التفصيل خط أنابيب الفرز الفائق الإنتاجية التي تجمع بين هذه السلالات المؤتلف من الحصبة والفيروسات شكونغنا لعزل الأدوية المضادة للفيروسات واسع الطيف من المكتبات الكيميائية.

Abstract

فيروسات الحمض النووي الريبي هي المسؤولة عن الأمراض التي تصيب الإنسان الرئيسية مثل الانفلونزا والتهاب الشعب الهوائية وحمى الضنك والتهاب الكبد C أو الحصبة. كما أنها تمثل تهديدا الناشئة بسبب زيادة التبادلات في جميع أنحاء العالم والبشر اختراق النظم الإيكولوجية أكثر وأكثر طبيعية. وخير مثال على مثل هذا الوضع الناشئ هو أوبئة فيروس شيكونغونيا من 2005-2006 في المحيط الهندي. تقدمات الأخيرة في فهمنا للمسارات الخلوية السيطرة على تكاثر الفيروس تشير إلى أن المركبات التي تستهدف وظائف الخلية المضيفة، وليس الفيروس نفسه، يمكن أن تمنع لوحة كبيرة من فيروسات الحمض النووي الريبي. وقد تم تحديد بعض المركبات المضادة للفيروسات واسع الطيف مع مضيفه المقايسات الموجهة المستهدفة. ومع ذلك، وقياس تثبيط تكاثر الفيروس في مزارع الخلايا باستخدام الحد من آثار الاعتلال الخلوي بمثابة قراءات لا يزال يمثل استراتيجية الفحص قصوى. وقد مثل شاشات الوظيفية تحسنت كثيرا من خلال تطوير فيروسات المؤتلف معربا عن مراسل الانزيمات كاليفورنياpable من تلألؤ بيولوجي مثل luciferase المراسل. في هذا التقرير، ونحن من التفصيل خط أنابيب الفرز الفائق الإنتاجية، والذي يجمع بين الحصبة المؤتلف والفيروسات شكونغنا مع المقايسات الجدوى الخلوية، لتحديد المركبات مع واسعة الطيف الشخصي المضادة للفيروسات.

Introduction

فيروسات الحمض النووي الريبي هي المسؤولة عن مجموعة كبيرة ومتنوعة من الإصابات البشرية، ويكون لها تأثير كبير على السكان في جميع أنحاء العالم سواء من حيث الصحة العامة والتكلفة الاقتصادية. وقد تم تطوير لقاحات فعالة ضد العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي الإنسان، وتستخدم على نطاق واسع كعلاج وقائي. ومع ذلك، لا يزال هناك نقص حاد في الأدوية العلاجية ضد عدوى فيروس الحمض النووي الريبي. في الواقع، لقاحات فعالة ليست متاحة ضد مسببات الأمراض البشرية الرئيسية، مثل فيروس حمى الضنك وفيروس التهاب الكبد C أو الجهاز التنفسي المخلوي الفيروس الإنسان (hRSV). الى جانب ذلك، فيروسات الحمض النووي الريبي هي المسؤولة عن غالبية الأمراض المستجدة، والتي تزايدت وتيرتها بسبب البورصات العالمية وتأثير الإنسان على النظم الايكولوجية. ضد هذا التهديد التي تمثل فيروسات الحمض النووي الريبي، ترسانة العلاجية لدينا محدودة للغاية وغير فعالة نسبيا ^1-3. وتقوم العلاجات الحالية أساسا على نوع المؤتلف أنا إنترفيرون (الإنترفيرون α / β) لتحفيز المناعة الفطرية،أو إدارة ريبافيرين. على الرغم من أن طريقة عمل هذا ريبونوكليوزيد التناظرية مثيرة للجدل ويعتمد على آليات مختلفة ربما، وتثبيط IMPDH الخلوية (إينوزين أحادي هيدروجين)، والذي يستنزف حمامات GTP داخل الخلايا، أمر ضروري بشكل واضح ^4. ريبافيرين، بالاشتراك مع مضاد للفيروسات الإنترفيرون α، هو العلاج الرئيسي ضد فيروس التهاب الكبد الوبائي C. ومع ذلك، والعلاج الإنترفيرون α / β وريبافيرين هي فعالية فقيرة نسبيا في الجسم الحي ضد معظم الفيروسات الحمض النووي الريبي لأنها حادة كفاءة الإنترفيرون α / β يشير من خلال التعبير عن عوامل الفوعة ⁵ وغالبا ما يفلتون من ريبافيرين ^3. وأضاف هذا إلى حقيقة أن العلاج ريبافيرين يثير قضايا هامة السمية، على الرغم من أنه تمت الموافقة مؤخرا ضد مرض hRSV شديدة مع فوائد مثيرة للجدل ^6. في الآونة الأخيرة، وقد تم تسويق بعض العلاجات الفيروس محددة، ولا سيما ضد فيروس الانفلونزا مع س التنميةو مثبطات النورامينيداز ^3. ومع ذلك، فإن التنوع الكبير وظهور دائم للفيروسات الحمض النووي الريبي يحول دون تطوير علاجات محددة ضد كل واحد منهم في مستقبل قريب نسبيا. تماما، وهذا يؤكد الحاجة إلى استراتيجيات فعالة لتحديد وتطوير جزيئات مضادة للفيروسات قويا في المستقبل القريب.

فمن تافهة القول بأن المانع واسع الطيف فعال ضد فريق كبير من فيروسات الحمض النووي الريبي من شأنه أن يحل هذه المشكلة. على الرغم من أن مثل هذا الجزيء لا يزال حلم عالم الفيروسات، وفهم أفضل لدينا من آليات الدفاع الخلوية ونظام المناعة الفطرية تشير إلى أن بعض الاحتمالات موجودة ^7،8. العديد من المختبرات الأكاديمية والصناعية يسعون الآن الجزيئات التي تحفز جوانب محددة من آليات الدفاع الخلوية أو المسارات الأيضية لفظة تكاثر الفيروس. على الرغم من أن هذه المركبات ربما تظهر آثار جانبية كبيرة، وعلاجات ضد الالتهابات الفيروسية الحادة تكون الادارىإد لفترة قصيرة نسبيا، مما يجعلها مقبولة على الرغم من بعض السمية المحتملة على المدى الطويل. وقد وضعت استراتيجيات مختلفة لتحديد مثل هذه واسعة الطيف الجزيئات المضادة للفيروسات. تهدف بعض البرامج البحثية في إيجاد الجزيئات التي تستهدف الدفاع أو التمثيل الغذائي مسارات محددة. وهذا يشمل، على سبيل المثال، المستقبلات الاعتراف الممرض للحصول المضادة للفيروسات التعبير الجيني ⁹ وتفعيل العوامل المضادة للفيروسات مثل RNaseL ^10، والآلات الالتهام الذاتي لتعزيز تدهور الفيروس ^11، والتوليف نوكليوزيد مسارات ^12،13، أو شلالات أفكارك لترسيب موت الخلايا المصابة بالفيروسات ^14. وقد وضعت مجموعات أخرى شاشات المظهرية التي لا تستهدف المستندة ^13،15-17. في هذه الحالة، يتم تحديد الجزيئات المضادة للفيروسات ببساطة عن طريق قدرتها على منع تكاثر الفيروس في نظام الهاتف الخلوي معين. الافتراض العام هو أن مركب تثبيط 2-3 فيروسات الحمض النووي الريبي لا علاقة لها سيكون له الشخصى مناسبة ل-SP واسعةectrum جزيء مضاد للفيروسات. يتم تحديد طريقة عمل مركبات ضرب المحدد مع هذا النهج التجريبية فقط في المرة الثانية، وفي نهاية المطاف، قد يؤدي إلى تحديد أهداف الخلوية رواية لمضادات الفيروسات. ومن المثير للاهتمام، وقد أظهرت تحليل بأثر رجعي من الأدوية الجديدة التي وافقت عليها إدارة الغذاء والدواء الأمريكية بين عامي 1999 و 2008 أنه في عام، مثل هذه الفحوصات المظهرية تميل إلى أداء أفضل من النهج القائم على الهدف لاكتشاف أول في فئة المخدرات جزيء صغير ¹⁸ .

عادة ما يتم تحديده تكاثر الفيروس في المقايسات خلية مقرها الإنتاجية العالية من الفيروس آثار الاعتلال الخلوي. والخلايا المصابة والمثقف في 96 - أو لوحات 384 جيدا في وجود مركبات اخضعت للاختبار. بعد بضعة أيام، يتم إصلاح الطبقات الخلوية وملطخة الأصباغ مثل الكريستال البنفسجي. أخيرا، يتم تحديد الامتصاصية مع تحديد قارئ لوحة ومركبات تثبيط تكاثر الفيروس عن طريق قدرتها على الحفاظ على الطبقات الخلوية جيئة وذهاباتأثير الاعتلال الخلوي الناجم عن الفيروس م. بدلا من ذلك، يتم تقييم آثار الاعتلال الخلوي بوساطة فيروسي باستخدام فحوصات سلامة قياسية مثل تخفيض MTS. هذه القياسات ليست لين العريكة للغاية وفعالة من حيث التكلفة، ولكن تعاني من القيود الرئيسية الثلاثة. الأولى، فإنها تتطلب مجموعة خلايا الفيروس حيث تكاثر الفيروس هو الاعتلال الخلوي في أيام قليلة فقط ولكن هذا ليس ممكنا دائما، وبالتالي الدعوة إلى النهج البديلة ^19. الثانية، فهي الكمي سيئة لأنها تستند إلى مقياس غير مباشر من تكاثر الفيروس. أخيرا، ومركبات سامة يمكن سجل الزيارات كما إيجابية، وبالتالي يجب القضاء مع شاشة العداد قياس الجدوى الخلوية. للتغلب على بعض هذه العقبات، قد تم تصميمها من الفيروسات أو المؤتلف replicons بواسطة الوراثة العكسية للتعبير عن البروتينات المراسل، مثل EGFP أو luciferase المراسل، من وحدة النسخ إضافية أو في الإطار مع جينات البروتين الفيروسي (أمثلة قليلة هي ^20-23). عند تكرار هذه الفيروسات، مراسل الأسبوعيةويتم إنتاج oteins جنبا إلى جنب مع البروتينات الفيروسية نفسها. وهذا يوفر مقايسة الكمية جدا لقياس تكاثر الفيروس وتقييم النشاط المثبطة الجزيئات مرشح. هذا صحيح بصفة خاصة للبحث عن الفيروسات المؤتلف معربا عن luciferase المراسل (أو الإنزيمات الأخرى قادرة على تلألؤ بيولوجي) لأن هذا النظام مراسل المعروضات مجموعة واسعة ديناميكية مع حساسية عالية ويكاد لا توجد خلفية هذا. وعلاوة على ذلك، لا يوجد أي مصدر للضوء الإثارة، وبالتالي منع التداخل مع مضان مجمع ^24.

هنا، لدينا بروتوكول الإنتاجية العالية من التفصيل لفحص المكتبات الكيميائية لمثبطات واسعة الطيف من فيروسات الحمض النووي الريبي. يتم اختبار المركبات الأولى على الخلايا البشرية المصابة بفيروس الحصبة المؤتلف (MV) معربا عن يراعة luciferase المراسل ²⁵ (rMV2/Luc، الشكل 1، الشاشة الرئيسية). MV ينتمي إلى Mononegavirales النظام، وغالبا ما تعتبر عضوا تنميط فيروس RNA سلبي حبلاوفاق. على هذا النحو، يتم استخدام MV الجينوم كقالب من قبل البلمرة الفيروسية لتجميع جزيئات مرنا ترميز للبروتينات الفيروسية. في سلالة MV المؤتلف دعا rMV2/Luc، وأعرب عن التعبير luciferase المراسل من وحدة النسخ الإضافية تدرج بين P والجينات M (الشكل 2A). في موازاة ذلك، يتم اختبار المركبات السمية على الخلايا البشرية باستخدام كاشف القائم على luciferase المراسل التجارية التي يقيم، من خلال القياس الكمي ATP، وعدد من خلايا نشطة عملية الأيض في الثقافة (الشكل 1، الشاشة الرئيسية). المكتبات الكيميائية بالكامل يمكن فرزهم بسهولة مع هذه المقايسات اثنين من أجل تحديد المركبات التي ليست سامة ومنع بكفاءة MV النسخ المتماثل. ثم، يتم اختبارها إصابات لتثبيط الاستجابة للجرعة من MV النسخ المتماثل، وعدم وجود سمية فضلا عن قدرتها على إضعاف الفيروس شيكونغونيا (CHIKV) التكرار (الشكل 1، وشاشة ثانوية). CHIKV هو عضو في عائلة الفيروسات الطخائية والجينوم هو أبositive منفردة الجديلة جزيء الحمض النووي الريبي. على هذا النحو، فمن لا علاقة لها تماما لالحصبة ومركبات تثبيط كلا MV وCHIKV تقف فرصة كبيرة لمنع لوحة كبيرة من فيروسات الحمض النووي الريبي. يتم تحويل البروتينات ابنيوي CHIKV مباشرة من الجينوم الفيروسي، في حين يتم ترميز البروتينات الهيكلية التي كتبها النسخ والترجمة من جزيء الرنا subgenomic. ويستند لدينا في المختبر تكرار الفحص لCHIKV على سلالة المؤتلف دعا CHIKV / رن، الذي يعبر عن Renilla انزيم luciferase المراسل كجزء المشقوق من polyprotein ابنيوي من خلال إدخال الجين المراسل بين nsP3 وتسلسل nsP4 ²⁶ (الشكل 2B). مقياس Renilla luciferase النشاط يسمح للرصد تكاثر الفيروس في مرحلة مبكرة من دورة حياة CHIKV.

وقد استخدم هذا البروتوكول الإنتاجية العالية لتحديد المركبات بسرعة مع لمحة مناسبة لمضادات الفيروسات واسع الطيف في مكتبة تجارية من 10،000 molecالمخصب ules للتنوع الكيميائية. مركبات كانوا يتبعون أساسا حكم يبينسكي من خمسة، مع الأوزان الجزيئية تتراوح 250-600 دالتون، وتسجيل القيم D أقل من 5. وكان معظم هذه الجزيئات كيانات كيميائية جديدة غير متوفرة في المكتبات التجارية الأخرى.

Protocol

1. إعداد 96 جيدا لوحات مركبات مع ابنة

1. نقل لوحات الأم 96 جيدا تحتوي على 10 ملي الحلول الأسهم من المركبات الكيميائية في DMSO من -20 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة. تمييع المركبات 5X في DMSO المتوسطة للحصول على لوحات التخفيف 96 جيدا في 2 مم. ويتحقق التخفيف من قبل pipetting 5 ميكرولتر في 20 ميكرولتر من DMSO والاختلاط.
2. ماصة 1 ميكرولتر من لوحات التخفيف في الآبار الجافة البيضاء، وزراعة الأنسجة شريط مشفر لوحات 96 جيدا. هذه أول مجموعة من لوحات ابنة (D1) سيتم استخدامها لتقييم سمية المركبات عند تركيز النهائي من 20 ميكرومتر. لوحات ابنة تخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. تمييع مركبات أخرى 01:10 بواسطة pipetting 4 ميكرولتر من لوحات التخفيف في 36 ميكرولتر من DMSO والاختلاط. ماصة 1 ميكرولتر في الآبار الجافة من البيض، مسطحة القاع، وزراعة الأنسجة شريط مشفر 96 بئرا لوحات. هذه المجموعة الثانية من لوحات ابنة (D2) سيتم استخدامها لتقييم تثبيط MV replicatioن من قبل المركبات بتركيز نهائي من 2 ميكرومتر. لوحات ابنة تخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. التحضير للثقافات الخليوي لتحديد سمية المركب

1. تنمو الخلايا HEK-293T عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ في تعديل متوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) مع استقرت L-الجلوتامين وتستكمل مع 10٪ الجنين مصل العجل (FCS)، الستربتوميسين (100 ميكروغرام / مل)، والبنسلين (100 وحدة دولية / مل). و passaged الخلايا عن طريق trypsinization كل 4-5 أيام، والمخففة 01:10 في قارورة جديدة. يجب أن تكون الخلايا في مرحلة سجل للتجارب.
2. في يوم من التجربة، واستعادة الخلايا عن طريق trypsinization وأداء العد الخلية. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي، و resuspend لهم في 3 × 10 ⁵ خلية / مل في مستنبت. نعتبر أن 12.5 مل من تعليق خلية مطلوبة من أجل كل لوحة الفرز.
3. نقل الخلايا إلى الحوض الصغير، والاستغناء عن 100 ميكرولتر من تعليق خلية في لوحات تحتوي على D1 ارتفعت كومبو الكيميائيةجهاز الأمم المتحدة الإنمائي. يتم تحريكها تعليق خلية داخل الحوض بشكل منتظم لتجنب الترسيب.
4. ارتفاع تحكم الآبار A1، C1، E1، G1، A12، C12، E12 وG12 مع 1 ميكرولتر من DMSO. وسوف تستخدم الآبار المقابلة كمرجع للخلايا الحية (أي سمية). ارتفاع تحكم الآبار B1، D1، F1، H1، B12، D12، F12 وH12 مع 1 ميكرولتر من DMSO و 2.5 ميكرولتر من حل IGEPAL 0.5٪ لقتل الخلايا. وسوف تستخدم الآبار المقابلة كمرجع للخلايا الميتة (سمية عالية).
5. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.

3. التحضير للثقافات الخلية المصابة بواسطة rMV2/Luc

1. تنمو واستعادة الخلايا كما هو موضح في 2.1 و 2.2. مرة أخرى، Resuspend الخلايا في 3 × 10 ⁵ خلية / مل في مستنبت. نعتبر أن 12.5 مل من تعليق خلية مطلوبة من أجل كل لوحة الفرز.
2. اختياري: ملحق الثقافة المتوسطة مع يوريدين في 20 ميكروغرام / مل.
   ملاحظة: عند فحص المكتبات الكيميائية لreplicatio الفيروسيةن مثبطات، يبدو أن المركبات التي تستهدف الخطوات في وقت مبكر من البيريميدين الحيوي مسار كثيرا ما عزل ^{13،16،27،28.} يستخدم إضافة إلى يوريدين مستنبت لتصفية مثل هذه الجزيئات المضادة للفيروسات. في الواقع، وهذا يعيد بكفاءة تكاثر الفيروس عندما يتم حظر الانزيمات المنبع من البيريميدين الحيوي المسار.
3. حفظ 1:10 من تعليق خلية للآبار مراقبة مع الخلايا غير المصابة، والمضي قدما للإصابة مع حجم المتبقية.
4. ذوبان الجليد على حجم مناسب من rMV2/Luc محلول المخزون. حلول الأسهم MV وعادة ما تكون في 10 ⁶ -10 ⁸ الجسيمات المعدية لكل مل. يجب أن تكون مصابة الثقافة مع 0.1 جزيئات معدية من rMV2/Luc في الخلايا المستهدفة، والتي تتطابق مع 0.1 تعدد العدوى (وزارة الداخلية). ملاحظة: مشتق من لقاح rMV2/Luc MV (سلالة شوارتز) ويتم التلاعب في بيئة BSL2.
5. إضافة الفيروس إلى تعليق خلية والمزيج بلطف. نقل الخلايا المصابة إلى الحوض الصغير، والاستغناء 100ميكرولتر من تعليق الخلية المصابة في الأعمدة من 2 إلى 11 لوحات D2 تحتوي على مركبات كيميائية ارتفعت. تعليق خلية داخل الحوض يتم خلط بانتظام بلطف.
6. في العمودين 1 و 12، الاستغناء 100 ميكرولتر من الخلايا غير المصابة جيدا على اثنين. يتم الاستغناء الخلايا المصابة في الآبار الآخرين.
7. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.

4. تدابير luciferase النشاط وتحليل البيانات

1. إزالة لوحات D1 من الحاضنة، وتحديد الجدوى الخلوية من خلال إضافة 50 ميكرولتر من القائم luciferase المراسل الجدوى كاشف مباشرة إلى آبار الثقافة. خلط واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قراءة لوحات مع luminometer. تم تعيين الوقت التكامل في 100 ميللي ثانية لكل بئر.
2. إزالة لوحات D2 من الحاضنة، وتحديد luciferase النشاط من خلال إضافة 50 ميكرولتر من الركيزة luciferase المراسل مباشرة إلى آبار الثقافة. احتضان لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وقراءة لوحات مع luminometer كما descriسرير أعلاه.
3. حساب عامل Z'عن كل لوحة D1 للمقايسة سمية لتبرير نوعية الشاشة ^29. Z '= 1-3 * (σ + + σ) / (μ + - μ)، حيث μ + σ + وتتوافق مع الوسائل من التألق والانحرافات المعيارية للخلايا كلوة-293T مع DMSO وحده (أي سمية)، وμ وσ هي وسيلة من التألق والانحرافات المعيارية للآبار ثقافة التعامل مع IGEPAL لقتل الخلايا. ومن المتوقع Z 'أن يكون فوق 0.5، أو يتم تجاهل وحة المقابلة.
4. تعيين عتبة السمية في μ + / 2. تجاهل مركبات مع القيم التلألؤ تحت هذا الوقف (الشكل 3A).
5. حساب عامل Z'عن كل لوحة D2 للمقايسة المضادة للفيروسات. هنا، μ + σ + وتتوافق مع الوسائل من التألق والانحرافات المعيارية للخلايا المصابة مثقف مع DMSO وحده، وμ وσ هي وسيلة من التألق والانحرافات المعيارية للخلايا غير المصابة. مرة أخرى، لوحات مع Z & #39؛ يتم تجاهل القيم أقل من 0.5.
6. حساب تثبيط تكاثر الفيروس على النحو التالي: النسبة المئوية للتثبيط = (μ + - luciferase النشاط لمجمع X) / (μ + - μ) * 100. تعيين عتبة 75٪ في تثبيط، وتحديد المركبات التي تحد من القيم التلألؤ تحت هذا الوقف (الشكل 3B) ليست سامة وفقا لمعايير وصفها في 4.4.

5. الشاشة الثانوية للسمية واسع الطيف المضادة للفيروسات آخر

1. جعل 1:2 التخفيفات التسلسلي لكل ضرب المركب في DMSO، بدءا من 500 ميكرومتر إلى 4 ميكرومتر (8 التخفيفات). ملء الأبيض، والأنسجة لوحات الثقافة شريط مشفر مع 50 ميكرولتر من مستنبت. إضافة 1 ميكرولتر من كل تخفيف المركب في الآبار الثقافة. كرر مرتين لدينا 3 لوحات الثقافة مع التخفيفات المسلسل مكررة لكل مركب ضرب.
2. إعداد 37.5 مل من تعليق خلية كلوة-293T في 6 × 10 ⁵ خلية / مل في مستنبت كما هو موضح أعلاه (2.1 و 2 في.2). الاستغناء 2X 12.5 مل في أنابيب الصقر وتصيب الخلايا مع rMV2/Luc إما في وزارة الداخلية = 0.1 أو CHIKV المؤتلف معربا عن Renilla luciferase المراسل (CHIKV / رن) في وزارة الداخلية = 0.2. مزيج من قبل قلب.
   ملاحظة: مشتق CHIKV / رن من سلالة من النوع البري من CHIKV وبالتالي ينبغي التلاعب في بيئة BSL3. يمكن نقل لوحات من BSL3 لBSL1 مرة واحدة تمت إضافة Renilla الركيزة لآبار الثقافة (انظر أدناه).
3. الاستغناء 50 ميكرولتر من / الخلايا غير المصابة، rMV2/Luc-infected، أو CHIKV رن المصابة في لوحات الثقافة التي تحتوي على التخفيفات التسلسلي للمركبات ضرب. احتضان 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
4. إضافة 50 ميكرولتر من يراعة luciferase المراسل الركيزة لتحديد النشاط يراعة luciferase في الآبار rMV2/Luc-infected. إضافة 50 ميكرولتر من الركيزة luciferase المراسل Renilla لتحديد Renilla luciferase النشاط في CHIKV / آبار رن المصابة. أخيرا، إضافة 50 ميكرولتر من القائم luciferase المراسل جدوى الفحص الكاشف إلى الخلايا غير المصابة لتحديد الجدوى الخلوية.
5. بيانات مؤامرة (فايجوري 4) وتحديد تركيزات المركب التي تمنع ضرب MV وتكرار CHIKV بنسبة 50٪. تجاهل المجمع تظهر بعض السمية في هذا الاختبار.

النتائج

خط الأنابيب هذا الفحص تعتمد أولا على اختيار المركبات التي تمنع تكرارها وMV لا تظهر أي سمية الخلوية كبيرة (الشكل 1، الشاشة الرئيسية). فإنه يستفيد من فحوصات على أساس luciferase المراسل لتحديد السمية الخلوية وتثبيط تكاثر الفيروس. جميع الخطوات pipetting لاقتناء والبيانات ...

Discussion

ويهدف خط أنابيب الفحص وصفها هنا في اختيار مركبات مع لمحة مناسبة باسم مثبطات واسعة الطيف من فيروسات الحمض النووي الريبي. ، وسجل أي تثبيط MV تكرار متفوقة على 75٪، و 40 مركبات (0.4٪) إيجابية عندما تم فحص مكتبة من 10،000 مركبات مع هذا البروتوكول وطبقت معايير التصفية المذكور?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freedom EVO platform	TECAN		Robotic platform
96-well polystyrene cell culture microplates, white	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570	Luciferase-based viability assay
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2610	Reagent containing firefly luciferase substrate
Renilla-Glo luciferase Assay System	Promega	E2710	Reagent containing Renilla luciferase substrate
Britelite plus Reporter Gene Assay System	Perkin-Elmer	6016761	Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity.