JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

يمكن فحوصات البيوكيميائية مع المؤتلف الإنسان جزيئات MHC II تقديم سريع، رؤى الكمي في تحديد حاتمة المناعية، الحذف، أو التصميم. هنا، يوصف مقايسة ملزمة الببتيد-MHC II تحجيم لوحات 384 جيدا. هذا الشكل فعالة من حيث التكلفة يجب أن تكون مفيدة في مجالات deimmunization البروتين وتصميم لقاح والتنمية.

Abstract

يمكن فحوصات البيوكيميائية مع المؤتلف الإنسان جزيئات MHC II تقديم سريع، رؤى الكمي في تحديد حاتمة المناعية، الحذف، أو تصميم 1،2. هنا، يتم تحجيم مقايسة ملزمة الببتيد-MHC II إلى تنسيق 384 جيدا. بروتوكول تقليص يقلل التكاليف بنسبة 75٪ كاشف والإنتاجية أعلى من البروتوكولات التي سبق وصفها جيدا 1،3-5 96. على وجه التحديد، والتصميم التجريبي يسمح تحليل دقيق وقابلة للتكرار تصل إلى 15 الببتيدات ضد واحد أليل MHC II في 384 جيدا لوحة ELISA. باستخدام السائل واحد التعامل مع الروبوت، وهذا الأسلوب يسمح أحد الباحثين لتحليل ما يقرب من تسعين الببتيدات اختبار في ثلاث نسخ على مجموعة من ثمانية تجمعات وأربعة أنواع أليل MHC الثاني في أقل من 48 ساعة. غيرهم من العاملين في مجالات البروتين deimmunization أو تصميم وتطوير لقاح قد تجد البروتوكول أن تكون مفيدة في تسهيل عملهم. على وجه الخصوص، وتعليمات خطوة بخطوة والشكل البصريمن إن الرب يجب السماح للمستخدمين الآخرين بسرعة وسهولة لإنشاء هذه المنهجية في مختبرات خاصة بهم.

Introduction

البروتينات هي أسرع فئة متزايدة من العوامل العلاجية 6، وركزت التوسع السريع في خطوط الأنابيب biotherapeutic باهتمام متزايد على التحديات المرتبطة بالتنمية واستخدام العقاقير البروتين. ينبع اعتبار واحد فريد من نوعه من حقيقة أنه، في نظام المناعة الصحي والعمل، يتم أخذ عينات جميع البروتينات خارج الخلية بواسطة مستضد تقديم الخلايا (ناقلات الجنود المدرعة). مرة واحدة المنضوية بواسطة ناقلات الجنود المدرعة، والمشقوق بروتين الببتيد إلى شظايا صغيرة، ويتم تحميل شرائح المناعية المفترضة في أخدود من الدرجة الثانية البروتينات التوافق النسيجي الرئيسي المعقدة (MHC II). ثم يتم عرض المجمعات الببتيد-MHC II على سطح APC، والببتيدات مناعة حقيقية، ووصف خميس الحواتم الخلايا، وشكل الثلاثي MHC II-الببتيد-T المجمعات مستقبلات الخلايا CD4 T مع المشابهة مستقبلات سطح الخلية 7. هذا الحدث الاعتراف الجزيئية الحرجة يبدأ سلسلة معقدة إشارات، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا T، والإفراج عن خلوىق، CD4 T-B بوساطة خلية خلية النضج، وفي نهاية المطاف إنتاج الأجسام المضادة المنتشرة التي تربط مفتش لمسح والخارجية البروتين المتسبب في المشكلة. وبالتالي، قد يكون deimmunized البروتينات المناعية عن طريق تحديد التأسيسية الحواتم الخلايا التائية وتحور بقايا الرئيسية المسؤولة عن تشكيل MHC II معقدة. مشيرا إلى أنها تتحمل، مع ذلك، أن خميس الحواتم الخلية يمكن أن تكون عديدة وعلى نطاق واسع في جميع أنحاء توزيع البروتينات المناعية، والغالبية العظمى من الطفرات حذف حاتمة من المحتمل أن يسبب خسائر غير مقصودة من وظيفة البروتين أو الاستقرار. وبالتالي، يمكن deimmunized الهندسة biotherapies أن يكون هدفا معقدة وصعبة من الناحية الفنية، ولكن توجد العديد من الأمثلة الناجحة T حاتمة خلية المشاريع الحذف 3،5،8-12. على عكس القائمة على تطعيم "أنسنة"، الذي يقتصر إلى حد كبير إلى العلاجات الضد، حاتمة الحذف يمكن تطبيقها على أي هدف أساسا من البروتين بغض النظر عن تسلسل، وهيكل، وظيفة، أو توافر homologoلنا السقالات الإنسان. الخطوة الأولى لتنفيذ هذا النهج هو تحديد الحواتم الببتيد الرئيسية جزءا لا يتجزأ من داخل تسلسل البروتين الهدف.

يمكن عالية الإنتاجية فحوصات البيوكيميائية باستخدام الببتيدات الاصطناعية والمؤتلف الإنسان جزيئات MHC II تقديم رؤى الأولية السريعة في تحديد حاتمة والتخفيف 1،3-5. ويمكن لهذه المقايسات نوع ELISA يكون مكملا قويا لغيرها من تصميم وتطوير الأدوات البروتين / قاح. على سبيل المثال، واحدة المنهج التجريبي راسخة لرسم خرائط حاتمة يعتمد على الوقت، والعمل، والموارد فيفو السابقين المقايسات تكاثر الخلايا المركزة 15. لفترة وجيزة، وينقسم التسلسل الرئيسي للبروتين الهدف الأول في لوحة من الببتيدات متداخلة، وغالبا 15 السائدة مع 12 بقايا تتداخل بين الببتيدات المجاورة. يتم تصنيعه كيميائيا لوحة الببتيد ويتم اختبار المناعية لكل الببتيد في واحدة من عدة المناعية المختلفة التي توظف bloo الطرفيةالخلايا وحيدة النواة د (PBMC) المعزولة من المانحين الإنسان 13،14. لتوفير قدر أكبر من الثقة في النتائج، يتم اختبار الببتيدات عادة في تكرار مع PBMC من 50 أو أكثر الجهات المانحة المختلفة. في الحالات التي يكون فيها deimmunization هو الهدف النهائي، وتتفاقم الأعمال الأخرى بسبب الحاجة لإنتاج لوحات إضافية من الببتيدات تحور واختبار الألواح الببتيد الجديدة في المقايسات PBMC قبل إدخال أي طفرات في بروتين deimmunizing طول الكامل للتحليل وظيفي لاحقة 10. في حين لا تزال هذه المقايسات الخلوية المعيار الذهبي لتقييم إمكانات المناعية في المرضى من البشر، يمكن تحسين كفاءة هذا النهج شاملة من قبل prefiltering الحواتم المناعية المفترضة باستخدام الإنتاجية السريعة وعالية MHC II-الببتيد مقايسة ملزمة.

وبالمثل، والكيمياء الحيوية المقايسات ملزمة الببتيد-MHC II يمكن دمجها مع التنبؤية في أساليب سيليكون لتسريع جذري في عملية تحديد الهوية حاتمة.توجد مجموعة متنوعة من الأدوات الحسابية لحاتمة تي خلية التنبؤ، وتشمل الأمثلة ProPred 16، MHCPred 17، SVRMHC 18، ARB 19، SMM محاذاة 20، 21 NetMHCIIpan فضلا عن أدوات الملكية مثل EpiMatrix بواسطة EpiVax 22. وبالمثل، تم مؤخرا جنبا إلى جنب مع تنبؤ حاتمة المعلوماتية الحيوية الأخرى، وأدوات النمذجة الجزيئية لانتاج خوارزميات deimmunization البروتين متكاملة تهدف للحد من المخاطر التي قد الطفرات deimmunizing تعطيل بنية البروتين وظيفة 23-26. في حين أثبتت عدة تنبئ حاتمة أن تكون دقيقة إلى حد معقول 27،28، النتائج الحسابية تتطلب دائما التحقق التجريبي. السريع، وإنتاجية عالية، وفعالة من حيث التكلفة الطرق التجريبية هي الأنسب كعامل تصفية أولية للسيليكون في التنبؤات حاتمة.

في سياق مماثل، يمكن أن تنبئ حاتمة مستضد لاختيار قيادة vaccinolo العكسيغراي 29،30. على سبيل المثال، قد أسفرت عن التقدم في المعلوماتية الحيوية شاشات الجينوم التي تحدد بسرعة اللقاحات المرشحة في شكل البروتينات كليا أو الحواتم الببتيد المستخرجة من proteomes الممرض. بينما هذه التكنولوجيا تمكن هو إعادة تشكيل اكتشاف وتطوير لقاحات واقية، فإنه يدخل تحديا جديدا في شكل قوائم كبيرة intractably المرشحين لقاح مناعة. يمكن المقايسات ملزمة عالية الإنتاجية الببتيد-MHC II توجيه اختيار حاتمة عن طريق قياس الببتيد تقارب ملزمة ملزمة والمجون بين الأليلات متعددة MHC II. كما هو الحال مع البروتين deimmunization، فإن المطلوب من هذه الطرق التجريبية في نهاية المطاف للتحقق من صحة التنبؤات الحسابية يؤدي لقاح واعد.

هنا، يوصف مقايسة ملزمة الببتيد-MHC II تحجيمها إلى تنسيق 384 جيدا. البروتوكول هو متوازية إلى حد كبير ويقلل من التكاليف بنسبة 75٪ كاشف مقارنة موضح سابقا 96 لوحة جيدا صيغ 1،3-5. باستخدام LIQUI واحدد التعامل مع الروبوت، وهذا الأسلوب يسمح أحد الباحثين لتحليل ما يقرب من تسعين الببتيدات بسهولة اختبار في ثلاث نسخ على مجموعة من ثمانية تجمعات وأربعة أنواع أليل MHC الثاني في أقل من 48 ساعة. توضح هذه المقالة الإعداد من لوحة واحدة 384 جيدا لتحليل ELISA سبعة الببتيدات التجريبية ضد أحد MHC II الأليل، ولكن يتم توفير الآلات الحاسبة ورقة انتشرت كمادة تكميلية بحيث يسهل على مقياس التجربة إلى أي عدد من الببتيدات المطلوب و / أو MHC الثاني الجزيئات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تضم أربعة أنشطة رئيسية مقايسة ملزمة الببتيد-MHC II: 1 التجليد: الببتيدات اختبار تتنافس مع الببتيدات السيطرة مرقوم للمرحلة حل ملزم للذوبان البروتينات MHC II. ملزمة يقاس على مدى واسع من تركيزات الببتيد الاختبار. 2-الالتقاط: بعد اقتراب رد فعل ملزم التوازن، يتم التقاطها الببتيد-MHC II المجمعات وفصلها عن الببتيد غير منضم والبروتين عن طريق الاعتراف تعتمد على التشكل مع الأجسام المضادة يجمد. تم الكشف عن الملتقطة السيطرة الببتيد كميا باستخدام مضان حل الوقت: 3-كشفها. 4 التحليل: تتم معالجة البيانات الطيفية، وتآمر وتحليلها للتأكد تعتمد على الجرعة خصائص ملزمة اختبار الببتيد والبروتينات MHC II.

في الخطوات المختلفة في الإجراء أدناه، واستخدام الروبوت التعامل مع السائل ينصح إذا كان متوفرا. ولا سيما في شكل 384 جيدا، صرف الآلي والتخفيف من السوائل يقلل من خطأ المستخدم، والنتائج في أكثريتفق جيدا إلى مجلدات بشكل جيد، وينتج 95٪ أضيق فترات الثقة لIC 50 القيم مقارنة دليل المقايسات 96 جيدا (لا تظهر البيانات). إذا روبوت التعامل مع السائل غير متوفرة، الخطوات المشروحة مع "(التعامل مع السائل الروبوت)" يمكن أن يتم باليد. وبالمثل، إذا كان ذلك ممكنا، فمن المستحسن لوحة الغسالة الآلية التي تتوافق مع شكل 384 جيدا. هذا توحد بشكل فعال في عملية الغسيل لوحة. إذا طبق غسالة غير متوفرة، الخطوات المشروحة مع "(لوحة غسالة)" يمكن أن يتم باليد.

1. معطف ELISA لوحة (يوم 1)

  1. تمييع الضد الأسهم L243 (0.5 ملغ / مل) في بورات العازلة إلى تركيز العمل من 10 ميكروغرام / مل.
    1. إلى معطف واحد لوحة 384 جيدا، إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأسهم إلى 9.8 مل من بورات العازلة. (انظر جدول التكميلي حاسبة لتحجيم البديلة).
  2. إضافة 25 ميكرولتر من الحل L243 الضد إلى كل بئر من 384 ثالذراع الأبيض ELISA لوحة عالية ملزم. (التعامل مع السائل الروبوت)
  3. ختم لوحة مع فيلم البوليستر واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن لكل ELISA لوحة 384 جيدا أن تستوعب ما يصل إلى 15 الببتيدات الاختبار في ثمانية التخفيفات لأحد MHC II أليل، فضلا عن الضوابط الإيجابية والسلبية. وسوف تسفر في نهاية المطاف هذه القياسات ثلاث نسخ.

2. جعل اختبار التخفيفات الببتيد (يوم 1)

  1. بدءا من الأسهم 10 ملم من كل الببتيد الاختبار في DMSO، وجعل سلسلة التخفيف التالية في السيترات الفوسفات العازلة باستخدام لوحات البولي بروبلين 384 جيدا (الجدول 1). (التعامل مع السائل الروبوت)
    ملاحظة: كامل لوحة البولي بروبلين 384 جيدا يتطلب ثلاث لوحات منفصلة ELISA. وثلث لوحة البولي بروبلين تتطلب واحد فقط ELISA لوحة (الشكل 1).
عدد التخفيف حجم رس تتخذ من التخفيف / الأسهم قبل حجم السيترات العازلة لإضافة اضرب. من الاضعاف اضرب. في رد فعل ملزم اضرب. في المحيدة ELISA
(ميكرولتر) (ميكرولتر) (ميكرومتر) (ميكرومتر) (ميكرومتر)
1 0.7 35.1 195،531 97.765 48.883
2 14.3 14.3 97.765 48.883 24.441
3 7.1 28.7 19.389 9.695 4.847
4 14.3 14.3 9.695 4.847 2.424
5 7.1 28.7 1.923 0.961 0.481
6 14.3 14.3 0.961 0.481 0.24
7 7.1 28.7 0.191 0.095 0.048
8 14.3 14.3 0.095 0.048 0.024
إزالة وتجاهل 7.1 ميكرولتر من الحل الببتيد من تخفيف عدد 8.

الجدول 1. إعداد اختبار الببتيد سلسلة التخفيف.

figure-protocol-4546
الشكل 1. لوحة خريطة الببتيد تجليد الفحص (A) خريطة التخفيفات الببتيد في البولي بروبلين لوحات 384 جيدا. يمكن لكل لوحة البولي بروبلين استيعاب ثلاث مجموعات من 15 الببتيدات في التفاعلات ملزم المنافسة ضد الغناء لو MHC II أليل. (ب) بعد اقتراب رد فعل ملزمة التوازن، يتم نقل كل مجموعة الببتيد، في ثلاث نسخ، لوحة 384 جيدا ELISA منفصلة الذي تم precoated مع المضادة للMHC II الأجسام المضادة.

3. تحضير ماجستير ميكس MHC II (يوم 1)

  1. جعل رد فعل العازلة
    1. إضافة 80 ميكرولتر من 1 ملم PEFA كتلة و 60 ملغ من الأوكتيل-β-D-glucopyranaside إلى 3،920 ميكرولتر من العازلة الفوسفات السيترات. (انظر جدول التكميلي حاسبة لتحجيم البديلة).
  2. تمييع اختيار الحلول الأسهم MHC II إلى 101 نانومتر في رد فعل العازلة باستخدام أنبوب 15 مل المخروطية (الجدول 2).
    ملاحظة: سوف تركيز MHC II يكون في نهاية المطاف 50 نانومتر في رد فعل ملزم و 25 نانومتر في ELISA مقايسة تحييدها. سوف تختلف تركيزات الأسهم MHC II اعتمادا على الشركة المصنعة الكثير العدد. (انظر جدول التكميلي حاسبة).
"> MHC II أليل DRB1 *: 1501 MHC II الأسهم تركيز (ملغ / مل) 1.3 MHC II الأسهم تركيز (ملم) 20 المجلد. MHC II الأسهم لإضافة (مل) 14.65 المجلد. رد فعل العازلة لإضافة (مل): 2885.35 MHC II ميكس ماجستير تركيز (نانومتر) 101

الجدول 2. إعداد MHC II مزيج الرئيسي.

4. إعداد ضوابط السلبية والإيجابية (يوم 1)

  1. إضافة 21.5 ميكرولتر من العازلة الفوسفات السيترات إلى "المراقبة السلبية" بئر من لوحة البولي بروبلين 384 جيدا من الخطوة 2.1 (الشكل 1A).
  2. إضافة 21.5 ميكرولتر من العازلة الفوسفات السيترات إلى "مراقبة إيجابية" بئر من لوحة البولي بروبلين 384 جيدا.
    ملاحظة: "POSIالسيطرة TIVE "سيتم الانتهاء في القسم 5 أدناه.
  3. إزالة 49.5 ميكرولتر من ميكس ماجستير MHC الثاني من الخطوة 3.2 وماصة في أنبوب 1.5 مل إيبندورف.
  4. إضافة 0.5 ميكرولتر من العازلة السيترات إلى 49.5 ميكرولتر من ميكس ماجستير MHC الثاني من الخطوة 4.3.
  5. إضافة 21.5 ميكرولتر من تركيز تعديل MHC II ميكس ماجستير من الخطوة 4.4 إلى "المراقبة السلبية" بئر من لوحة البولي بروبلين 384 جيدا (الشكل 1A).
    ملاحظة: تمثل هذه العينة سيطرة سلبية صفر إشارة تحتوي على البروتين MHC II، NO الببتيد السيطرة، وNO الببتيد الاختبار.

5. إضافة التحكم الببتيد المناسبة لماجستير ميكس MHC II (يوم 1)

MHC II أليل DRB1 * البيروكسيديز تحكم الببتيد (بقايا) تسلسل
0101 انفلونزا-HA-B (306-318) البيوتين (Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-أميد
0301 الميوجلوبين (137-148) البيوتين (Ahx) - (Ahx) LFRKDIAAKYKE-OH
0401 يار-B (1-14) البيوتين (Ahx) (Ahx) YARFQSQTTLKQKT-OH
0701 TetTox-B (830-843) البيوتين (Ahx) (Ahx) QYIKANSKFIGITE-OH
1101 انفلونزا-HA-B (306-318) البيوتين (Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-أميد
1501 MBP-B (84-102) البيوتين (Ahx) (Ahx) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH

* ونحن نوصي يأمر نطاق 10 ملغ للاقتصاد.
الجدول 3. الببتيدات الرقابة على مختلف الأليلات MHC II. *

  1. تمييع الببتيد تحكم (المخزنة في 400 ميكرومتر في DMSO) في 01:20 DMSO جديدة لتسفر عن الأسهم المخفف في 20 ميكرومتر.
    1. إضافة 25 ميكرولتر 400 ميكرومتر السيطرة الببتيد ل475 ميكرولتر DMSO. ملاحظة: هذا هو فائض كبير، ولكن يسمح معالجة دقيقة من الحلول DMSO لزج.
  2. مزيد من تمييع الببتيد تحكم من الخطوة 5.1 (20 ملي) 1:100 في ميكس ماجستير MHC الثاني من الخطوة 3.2.
    1. إضافة 28.8 ميكرولتر من مراقبة الببتيد المخفف في الخطوة 5.2 إلى 2،850.5 ميكرولتر المتبقية للماجستير ميكس MHC II.
  3. إضافة 21.5 ميكرولتر من ميكس ماجستير MHC II مع التحكم الببتيد (الخطوة 5.2) للسيطرة على البئر إيجابية من لوحة البولي بروبلين 384 جيدا (الخطوة 4.2) (الشكل 1A). ملاحظة: تمثل هذه العينة مراقبة إيجابية عالية إشارة التي تحتوي على البروتين MHC II، ومراقبة الببتيد، وNO الببتيد الاختبار.

6. جعل رد الفعل التجليد (يوم 1)

  1. إضافة ميكس ماجستير MHC II تحتوي على تحكم الببتيد (الخطوة 5.2) إلى كل من التخفيفات اختبار الببتيد (الخطوة 2.1) في نسبة 1:1 لخلق رد فعل ملزم.
    1. إضافة 21.5 ميكرولتر من MHC II ميكس ماجستير تحتوي على كونTROL الببتيد من الخطوة 5،2-21،5 ميكرولتر من كل تخفيف اختبار الببتيد من الخطوة 2.1. (التعامل مع السائل الروبوت)
  2. ختم رد فعل ملزم مع فيلم البوليستر واحتضان 12-24 ساعة في حاضنة للرقابة غير CO-2 عند 37 درجة مئوية دون أن تهتز.

7. تحييد ونقل رد فعل ملزم (اليوم 2)

  1. إزالة لوحة البولي بروبلين 384 جيدا تحتوي على رد فعل ملزم (الخطوة 6.2) من الحاضنة 37 درجة مئوية.
  2. تمييع رد الفعل 1:01 ملزم مع تحييد العازلة. (التعامل مع السائل الروبوت)
    1. إضافة 43 ميكرولتر من العازلة تحييد كل رد فعل ملزم أيضا.
  3. إزالة لوحة ELISA (الخطوة 1.3) في الفترة من 4 درجة مئوية، وغسل 3X مع 60 مل / جيد من برنامج تلفزيوني، 0.05٪ توين 20. (لوحة غسالة)
  4. نقل 25 ميكرولتر من كل رد فعل ملزم تحييد من الخطوة 7.2 في الآبار ثلاث نسخ من 384 جيدا ELISA لوحة المغلفة الأضداد من الخطوة 7.3. (الشكل 1 ) (السائل التعامل مع الروبوت)
  5. تغطية لوحة ELISA مع فيلم البوليستر ومكان في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة أو في الثلاجة 4 درجات مئوية خلال الليل.

8. التنمية ELISA (اليوم 2 أو 3)

  1. إزالة لوحة ELISA من الخطوة 7.5، ويغسل 3 مرات مع 60 ميكرولتر / جيد من برنامج تلفزيوني، 0.05٪ توين. (لوحة غسالة)
  2. تمييع Streptavidin-الأوروبيوم محلول المخزون (0.1 ملغ / مل streptavidin، 7 اوو 3 + / streptavidin) 1،000 أضعاف في DELFIA الفحص العازلة.
    1. لوحة واحدة 384 جيدا، وتمييع 10 ميكرولتر Streptavidin-اليوروبيوم في 10 مل العازلة الفحص.
  3. إضافة 25 ميكرولتر من المخفف Streptavidin-اليوروبيوم إلى كل بئر من لوحة 384 جيدا ELISA من الخطوة 8.1. (التعامل مع السائل الروبوت)
  4. تغطية لوحة مع فيلم البوليستر والمكان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. ملاحظة: أثناء الحضانة 1 ساعة، وإزالة الحل تعزيز من الثلاجة ويترك جانبا 10 مل / لوحة في الظلام في ريال عمانيدرجة الحرارة أوم.
  5. بعد حضانة 1 ساعة،، وغسل لوحة 384 جيدا ELISA من الخطوة 8.3 3X مع 60 ميكرولتر / جيد من برنامج تلفزيوني، 0.05٪ توين. (لوحة غسالة)
  6. إضافة 25 ميكرولتر من الحل تعزيز لكل بئر من لوحة 384 جيدا ELISA من الخطوة 8.5. (التعامل مع السائل الروبوت)
  7. تغطية 384 جيدا لوحة ELISA مع فيلم البوليستر وتسمح لوحة الجلوس في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.
  8. بعد دقيقة الحضانة 10-15، قراءة مضان من لوحة 384 جيدا ELISA من الخطوة 8.7 باستخدام وقت حل القارئ الفلورسنت لوحة مع إعدادات اليوروبيوم (على سبيل المثال، تشغيل مادبا: 200، توقف الباحث: 1،000، تحويلة 340، م 615، القطع: لا شيء، PMT: السيارات، ويقرأ / حسنا: 50).

9. تحليل البيانات

  1. إدخال البيانات في الرسم البياني XY تنسيق مع القيم تكرار في 3 جنبا إلى جنب الأعمدة (X = اختبار تركيز الببتيد؛ Y = قياس مضان).
  2. تسجيل تحويل القيم X لكافة البيانات: X = سجل (X)
  3. تناسب الهيئة السجلnsformed البيانات لدى موقع واحد نموذج ملزمة تنافسية لاستخراج قيمة IC 50.
  4. تقيد قيمة أسفل إلى متوسط ​​قيمة السيطرة السلبية.
  5. تناسب عالميا قيمة أعلى وضمان أن المعلمة مناسبا العالمية أقل من أو مساو لمراقبة إيجابية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم تحليل تسلسل الببتيد ناضجة من الأمعائية المذرقية P99 بيتا اكتاماز (جيش تحرير بلوشستان) (بنك الجينات رقم # X07274.1) مع ProPred 16 لدنة الببتيد المفترضة لMHC II أليل DRB1 * 1501 (جدول 4). حددت ProPred 117 الببتيدات nonamer مع إلزامية P1 مرساة بقايا (أي M، L، I، V، F، Y، W أو في ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد أنشأت Biotherapeutics نفسها باعتبارها حجر الزاوية في الطب الحديث، وهو ما يمثل أربعة من الخمسة الاوائل الأدوية مبيعا في عام 2012 32. وقد أظهرت قطاع الصيدلانيات البيولوجية النمو المطرد لعدة سنوات 6، والتطوير المستمر للعوامل الرواية فضلا عن ظهور البدائل الحيوية و...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعمل ليونارد مويس قبل ويحمل خيارات الأسهم في EpiVax، وهي شركة مملوكة للقطاع الخاص شركة للتكنولوجيا الحيوية تقع في بروفيدانس، رود ايلاند. العمل الواردة في هذا التقرير البحثي خالية من أي تحيز التي قد تترافق مع الأهداف التجارية للشركة.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01-GM-098977-R21 وAI-098122 لبنك الكويت المركزي وKEG. وأيد RSS في جزء من زمالة مؤسسة لوسي وجزئيا على زمالة برنامج الابتكار ثاير ثاير من كلية الهندسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium Tetraborate DecahydrateSigma221732
Citric AcidSigmaC1901
Dibasic Sodium PhosphateSigmaS7907
Trizma HClOmniPur9310
Tween-20SigmaP7949
100% DMSOSigmaD8418
Octyl-β-D-GlucopyranasideFischer29836-26-8
Pefa Bloc SCFRoche1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered SalineInvitrogen14200-166
DELFIA Assay BufferPerkin Elmer4002-0010
DELFIA Enhancement BufferPerkin Elmer4001-0010
Europium Labelled StreptavidinPerkin Elmer1244-360
L243 anti-HLA-DR antibodyBiolegend307602
Biotinylated tracer peptides21st Century BiochemicalsCustom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity)GenscriptCustom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated)Benaroya Research Institute*Custom Order
384-well white EIA/RIA plateThermo460372
Polypropylene 384-well plateCostar3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator Axygen AscientificPCR-SP
MilliQ WaterN/AN/A
Epimotion Liquid Handler (or similar)Eppendorf5075
Select TS Plate Washer (or similar)BioTek405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar)Molecular DevicesN/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

References

  1. Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
  2. Raddrizzani, L., et al. Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires. J. Immunol. 159, 703-711 (1997).
  3. Osipovitch, D. C., et al. Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy. Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).
  4. Moise, L., et al. In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes. Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).
  5. Moise, L., et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).
  6. Aggarwal, S. R. What's fueling the biotech engine-2011 to 2012. Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).
  7. Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).
  8. Warmerdam, P. A. M., et al. Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling. Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).
  9. Jones, T. D., et al. Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).
  10. Harding, F. A., et al. A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy. Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).
  11. Mazor, R., et al. Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).
  12. Cantor, J. R., et al. Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).
  13. Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer. Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).
  14. Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. High throughput T epitope mapping and vaccine development. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720(2010).
  15. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  16. Singh, H., Raghava, G. P. ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).
  17. Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding. Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).
  18. Wan, J., et al. SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides. BMC Bioinformatics. 7, 463(2006).
  19. Bui, H. H., et al. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).
  20. Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8, 238(2007).
  21. Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure. Immun. Res. 6, 9(2010).
  22. De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification. Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).
  23. Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content. J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).
  24. Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins. J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).
  25. Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions. J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).
  26. Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins. BMC Bioinformatics. 11, 180(2010).
  27. De Groot, A. S., Martin, W. Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).
  28. Wang, P., et al. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput. Biol. 4, e1000048(2008).
  29. Sette, A., Rappuoli, R. Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics. Immunity. 33, 530-541 (2010).
  30. Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines. Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).
  31. Sturniolo, T., et al. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).
  32. Biologic drugs set to top 2012 sales. Nat. Med. 18, 636(2012).
  33. Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology. Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).
  34. Jiang, W., Boder, E. T. High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).
  35. Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -L. B., Buus, S. Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays. Immun. 5, 1-20 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 3/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (mM)20
Vol. MHC II Stock to Add (ml)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

to:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (μM)20
Vol. MHC II Stock to Add (μl)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

85 MHC II T Deimmunization

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved