JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ثلاثة الثقافة الأبعاد للخلايا الظهارية الثديية على الغشاء القاعدي المعاد هو طريقة مفيدة لتلخيص العمارة في الجسم الحي من الثدي حميدة، والتفريق بين النمط الظاهري الخبيثة من النمط الظاهري الثدي حميدة. الأهم من ذلك، هذا النظام يمكن تطبيقه على دراسة سرطان الغازية في الأنسجة الأخرى.

Abstract

سرطان الثدي الغازية هي مجموعة من الأورام الظهارية الخبيثة التي تتميز غزو الأنسجة المجاورة والميل إلى تنتشر. تفاعل الإشارات بين الخلايا السرطانية والمكروية التي تمارس تأثيرا قويا على نمو سرطان الثدي والسلوك البيولوجية 1. ومع ذلك، يتم فقدان معظم هذه الإشارات من المصفوفة خارج الخلية أو سلوكه أهميتها عندما تزرع الخلايا في الثقافة ثنائية الأبعاد (2D) كما أحادي الطبقة. في السنوات الأخيرة، برز ثلاثي الأبعاد (3D) الثقافة على الغشاء القاعدي المعاد كوسيلة لاختيار لألخص هندسة الأنسجة من خلايا الثدي الحميدة والخبيثة. الخلايا المزروعة في 3D الإبقاء على الإشارات الهامة من المصفوفة خارج الخلية وتوفير نظام فيفو السابقين 2،3 ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. من المذكرة، هناك أدلة متزايدة تشير إلى أن الخلايا تتصرف بشكل مختلف عندما نمت في 3D بالمقارنة مع 2D 4. الثقافة 3Dيمكن استخدامها بشكل فعال كوسيلة للتمييز الخبيث من النمط الظاهري النمط الظاهري الثدي حميدة والتي تدعم إشارات الخلوية والجزيئية المعنية 3. واحدة من الخصائص المميزة للخلايا الظهارية الحميدة هي أنها الاستقطاب بحيث السيتوبلازم قمي هو نحو التجويف وتقع السيتوبلازم القاعدية على الغشاء القاعدي. يتم فقدان هذه الأقطاب apico القاعدية سرطان الثدي في الغازية، التي تتميز الفوضى الخلوية وتشكيل anastomosing والمتفرعة الأنابيب التي تتسرب جزافا ستروما المحيطة بها. يمكن استنساخها هذه الاختلافات التشريحية المرضية بين الغدة الحميدة وسرطان الغازية في 3D 6،7. باستخدام قراءة عموميات المناسبة مثل تحديد الكميات من الهياكل عنيبية دورة واحدة، أو التفاضلية التعبير الواسمات الجزيئية التحقق من صحة لتكاثر الخلايا، والاستقطاب وموت الخلايا المبرمج في تركيبة مع تقنيات البيولوجيا الجزيئية والخلوية الأخرى، الثقافة 3Dه يمكن أن توفر أداة مهمة لفهم أفضل للتغيرات الخلوية خلال التحول الخبيث وترسيم إشارات المسؤولة.

Introduction

ثلاثة الثقافة الأبعاد (3D) في خلايا الثدي الظهارية على الغشاء القاعدي المعاد هو نظام نموذجا هاما لدراسة النمط الظاهري المعقدة والإشارات المرتبطة الثدي الطبيعية وسرطان الثدي 2،3. وحدة وظيفية من الثدي هو وحدة مفصص القناة محطة (TDLU) الذي يتكون من القناة الصغيرة التي فروع في عنيبات. وعنيبات ​​هي هياكل درجة عالية من التنظيم، يتكون من طبقتين الخلايا، والخلايا الظهارية عضلية ظهارية، والتي يحيط بها الغشاء القاعدي 5. أهم السمات المميزة لعنيبات ​​العادية هي الاستقطاب الخلوية، المرفق إلى الغشاء القاعدي الكامنة والاتصالات خلية خلية متخصصة. تعطل هذه المنظمة المعقدة في سرطان الغازية. ثقافات 2D تستخدم على نطاق واسع، حيث تزرع الخلايا كما الطبقات الوحيدة، لا تسمح لتشكيل عنيبات. وبالتالي، فإن الثقافة أحادي الطبقة يعاني من نقص في توفير نظام للقبض على العلاقة المعقدة بين الخلايا الظهاريةفي الثدي العادية والتحرر من القيود في سرطان الثدي. وقد تم تطوير الثقافات الظهارية monotypic الوظيفية للخلايا الثدي في العديد من المختبرات 2،3. ينطوي الثقافة 3D نمو خلايا الثدي على Matrigel، وهو مستخلص مشتق من solubilized Engelbreth-هولم-سرب خلايا فأر ساركوما ومتاح تجاريا. الطبقات التحتية 3D أخرى مثل الكولاجين تستخدم أيضا أنا. خلايا الثدي يمكن تربيتها في 3D بواسطة 3D مقايسة جزءا لا يتجزأ، حيث يتم استزراع الخلايا جزءا لا يتجزأ من Matrigel 2. بدلا من ذلك، الخلايا يمكن تربيتها من قبل 3D على رأس الفحص، وتسمى أيضا فحص 3D تراكب، والتي هي فعالة من حيث التكلفة لأنها تتطلب أقل من حجم Matrigel، ويسهل مرور الوقت مراقبة تشكيل مستعمرة من قبل التصوير النقيض من المرحلة، ويعتبر مثاليا لتصوير الوضع الطبيعي 2 في -3. تم استخدام 3D على رأس فحص لتحديد العلاقة بين النمط الظاهري عنيبية والتعبير الجيني الشخصي 7.

يمكن فعاليه الثقافة 3Dاعل تستخدم للتمييز بين الخلايا الطبيعية وحميدة من سرطان الغازية. خلايا الثدي العادية وحميدة تشكيل هياكل النمو القبض الاستقطاب مع التجويف واضحة المعالم في المركز على Matrigel في حين خلايا سرطان الغازية تنمو بغزارة وبشكل عشوائي مع عدم وجود تطهير التجويف. E6/E7 خلدت الخلايا الظهارية الثديية البشرية وخط الخلية MCF10A، الذي هو خط خلية خلد عفويا معزولا عن المريض 36 سنة مع التغيرات فيبروكيستيك، وقد استخدمت بنجاح لاستعادة النمط الظاهري الثدي حميدة في 3D 3،8 وكانت بمثابة نظام نموذجي لدراسة وظيفة القامع أنكجنيك والورم من عدة جزيئات 8،9. هذه الخلايا حميدة يمكن هندستها للتلاعب الجيني (ق) من الفائدة من خلال إدخال الفيروسة البطيئة / الارتجاعي. إذا كان الجين (ق) من الفائدة هو القامع الورم، وضربة قاضية shRNA بوساطة يؤدي إلى تحول خبيث في حين إذا كانت الجينات في المصالح هو من overexpression الجين الورمي في خلايا حميدةيجب أن يظهر النمط الظاهري الخبيثة. في كلتا الحالتين الهياكل عنيبية شكلت في 3D يمكن التقاط التحول الخبيث.

الخلايا واحد مطلي حميدة في 3D تبدأ في التكاثر وتشكيل الهياكل جولة كروية. بعد يوم 5-8 هذا الركام كروية من الخلايا سوف تفرق في طبقة المحيطة الاستقطاب من الخلايا التي هي في اتصال مع Matrigel، وكتلة من الخلايا الداخلية أقل الاستقطاب، والتي تفتقر اتصال مع Matrigel. في 10-15 يوما المقبلة سوف تبدأ الخلايا الداخلية للموت عن طريق موت الخلايا المبرمج تشكيل التجويف واضحة. الخلايا الخبيثة ستنمو فقدان جزافا قطبية بهم. الخلايا الخبيثة للغاية عادة تشكيل هياكل المتفرعة. هذه الاختلافات في النمط الظاهري يمكن التقاطها بواسطة الوقت الفاصل بين مرحلة التصوير وعلى النقيض من قبل في الموقع المناعية مع الواسمات الجزيئية ذات الصلة. علامات الأكثر شيوعا هي ألفا 6 إنتغرين، وقطبية علامة القاعدية، في تركيبة مع انتشار علامة الفوسفات هيستون-3 وapoptotجيم علامة المشقوق كاسباس 3. وهذا الأخير مهم لتحديد ما إذا كان هناك تشكيل التجويف في وسط عنيبات، وهي سمة من خلايا الثدي العادية وحميدة. وتشمل الاستقطاب والاتصال خلية خلية علامات أخرى GM130، laminin، إدارة مخاطر المؤسسات، E-كادهيرين. بالتناوب على خطوط خلايا سرطان الثدي يمكن هندستها لمعالجة الجينات في المصالح. في هذه الحالة الارتداد إلى المزيد من النمو القبض على النمط الظاهري حميدة يمكن أن تستخدم تلا تمييزها عن النمط الظاهري السرطان.

ويمكن أيضا أن تستخدم الثقافة 3D بعناية لترسيم مسارات الإشارات المشاركة في التحول الخبيث 10-11. باستخدام المذكورة أعلاه الرافضة قراءة، مثبطات الدوائية، والأجسام المضادة ومنع أو البروتينات المؤتلف ويمكن استخدام يتم تحديد في الإشارات الجزيئية التي تؤدي إلى التحول الخبيث. مع الجهود المستمرة من مختلف المختبرات فمن الممكن لاستخراج الخلايا من 3D لعزل الحمض النووي الريبي، وكذلك إعداد لست] لimmunoblotting واللقاحاتnoprecipitation. يتم وصف هذه الاستراتيجيات في خطوة بخطوة وبطريقة مفصلة في البروتوكول.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد المواد والثقافة وسائل الإعلام

  1. عامل النمو ذوبان الجليد خفض (GFR) Matrigel عند 4 درجة CO / N.
  2. الاحماء وسائل الإعلام كاملة عن خط الخلية المطلوبة عند 37 درجة مئوية. MCF10A-ATCC المحدد وسائل الإعلام؛ HME-هام في F-12 المتوسطة تستكمل مع 5٪ مصل الجنين البقري، 1 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 10 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة، و 100 نانوغرام / مل بكتيريا الكوليرا؛ F-12-SUM149 وسائل الإعلام هام لتستكمل مع 5٪ FBS، 2 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون و 5 ميكروغرام / مل الأنسولين؛ وMDA-MB-231-10٪ FBS-DMEM
  3. Precool شريحة الغرفة 8 جيدا على الجليد.
  4. إعداد الأنسجة غطاء الثقافة واللوازم.

2. ثلاثة الثقافة الأبعاد في 8 جيدا غرفة الشرائح

  1. معطف كل بئر من الشريحة 8 جيدا مع 40 ميكرولتر من Matrigel GFR. إضافة Matrigel في وسط الشريحة وانتشرت بعد ذلك باستخدام ماصة غيض P200. محاولة لنشر بالتساوي قدر الإمكان، وتجنب فقاعات وoverspreading التي يمكن أن تؤدي إلىتشكيل الغضروف المفصلي.
  2. احتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2. في حين أن Matrigel وترسيخ، يعرض للتريبسين الخلايا، وجمع وتدور في 150 x ج في زراعة الأنسجة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق.
  3. عد الخلايا وتضعف إلى 12،500 خلية / مل في وسائل الإعلام كاملة من خط الخلية منها. إضافة GFR Matrigel إلى 2٪ وإضافة 400 ميكرولتر لكل بئر من الشريحة غرفة Matrigel precoated.
  4. احتضان الشرائح في حاضنة CO 2. تعطي التغييرات الطازجة وسائل الإعلام كاملة كل يوم 4 حتى ال 15 يوما.
  5. العلاج مع مثبطات دوائية: للدراسات المانع إضافة مثبطات جزيء صغير إلى وسائل الإعلام كاملة في وقت الطلاء تليها التغييرات وسائل الإعلام الجديدة تستكمل مع مثبطات كل ثلاثة أيام في حين تزايد الخلايا على Matrigel GFR.
  6. المعاملة مع البروتين النقي:
    1. لوحة الخلايا التالية الخطوات 2،1-2،3. السماح للثقافات أن ينمو لمدة 4 أيام تليها starvati المصلعلى لمدة 16 ساعة.
    2. في يوم 5، وعلاج الخلايا مع التركيز المناسب من البروتين المنقى في 0.1٪ FBS تستكمل وسائل الإعلام إلى مصل الخلايا جوعا. تعطي تغير وسائل الإعلام الجديدة مع البروتين النقي بعد أيام 2.
    3. في يوم 10 يحل محل وسائل الإعلام مكيفة مع وسائل الإعلام HME كاملة. السماح للثقافات أن ينمو لمدة 5 أيام أخرى.
  7. المناعي تلطيخ هياكل عنيبية نمت على Matrigel:
    1. إعداد بارافورمالدهيد 2٪، 0.5٪ تريتون X-100 و 100 ملي جليكاين في برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.4. إعداد العازلة المناعي (IF العازلة) التي تضم برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 0.1٪ ألبومين المصل البقري، 0.2٪ تريتون X-100، 0.05٪ توين 20.
    2. استخدام غيض ماصة P200 لنضح بعناية وسائل الإعلام مكيفة.
    3. إصلاح هياكل عنيبية مع 2٪ الطازجة بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة.
    4. Permeabilize الخلايا مع 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    5. غسل الثقافةق ثلاث مرات مع 100 ملي جليكاين، 10-15 دقيقة لكل غسل.
    6. منع الخلايا مع 10٪ مصل الماعز في المنطقة العازلة IF، ودعا كتلة الأولية، لمدة 1 ساعة على RT.
    7. احتضان الثقافات مع 20 ميكروغرام / مل الماعز المضادة الماوس F (أ ب ') 2 جزء في كتلة عازلة الأولية لمدة 30 دقيقة. هذه الخطوة مهمة لمنع الأنواع مفتش الماوس مناعيا في Matrigel.
    8. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في عرقلة الحل الثاني (كتلة الابتدائية +20 ميكروغرام / مل الماعز المضادة الماوس F (أ ب ') 2 جزء) O / N عند 4 درجة مئوية.
    9. يغسل ثلاث مرات مع العازلة IF لمدة 10-15 دقيقة لكل منهما مع هزاز لطيف.
    10. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق فلوري في IF العازلة لمدة 45 دقيقة.
    11. غسل 3X لمدة 10 دقيقة مع كل IF العازلة مع هزاز لطيف.
    12. جبل الشرائح مع مكافحة تتلاشى كاشف تحتوي على دابي لتصور النوى.
    13. تسمح الشرائح لتجف O / N في RT.
    14. الحصول على الصور: الحصول على صور متحد البؤر في مستعمرة ميلdsection من الخلايا المزروعة على رأس Matrigel. للحصول على مزيد من المعلومات سلسلة من المقاطع البصرية في جميع أنحاء كامل طول الهيكل عنيبية بواسطة Z التراص.

3. ثلاثة الثقافة الأبعاد في 2 جيدا غرفة الشرائح لImmunoblotting

  1. Precool شريحة غرفة 2 جيدا على الجليد. اتبع الخطوات من 2،1-2،4 الارتقاء الكواشف ل2 جيدا غرفة الشريحة مثل معطف مع 160 ميكرولتر من Matrigel وإضافة 1.6 مل من خلية / Matrigel المزيج إلى كل بئر من الشريحة 2 جيدا.
  2. حصاد هياكل عنيبية من Matrigel باستخدام المتاحة تجاريا عدة الحصاد خلية ثقافة 3D باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  3. تمييع غسل الخلايا وحصاد الخلايا المخازن المؤقتة إلى 1X و precool إلى 4 درجات مئوية. ينبغي أن يتم غسل وبإزاحة Matrigel خارجا على الجليد.
  4. غسل الهياكل عنيبية 3X باستخدام غسل العازلة الخلية.
  5. جمع عنيبات ​​إلى 15 مل أنابيب الطرد المركزي باستخدام بو حصاد الخلاياffer تليها 30 دقيقة الحضانة على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية. مزيج التعليق بشكل جيد مع ماصة 1 مل. وهذا كسر Matrigel في قطع صغيرة والافراج عن معظم الخلايا في المخزن المؤقت حصاد الخلايا.
  6. بيليه الخلايا في 200 x ج في جهاز للطرد المركزي الثقافة. إزالة الطبقة العائمة من هيدروجيل من الخلايا مكعبات مع طرف ماصة P200.
  7. resuspend ولست] في SDS عينة العازلة المتوفرة مع الطقم. ويمكن أيضا أن تستخدم RIPA العازلة تحلل.

4. الكمي لمقابل خبيثة حميدة النمط الظاهري الثدي

  1. تنمو الخلايا في يثلث لكل مجموعة العلاج الخطوات التالية 2،1-2،4.
  2. التقاط صور النقيض من المرحلة هياكل عنيبية من كل بئر في 5X أو 10X القرار باستخدام المجهر النقيض من المرحلة تعلق على شيفتر الشريحة وجهاز كمبيوتر. اتخاذ الصور عن طريق تحريك الشريحة من إطار واحد إلى آخر، وبالتالي تغطي البئر بالكامل من الشريحة غرف.
  3. عد العدد الكلي للهياكل عنيبية،عدد واحد عنيبات ​​شقة المستديرة وعدد من الهياكل multiacinar أو هياكل المتزايد جزافا تفتقر إلى التنظيم ومع العمليات المتفرعة المنبثقة عنها.
  4. حساب النسبة المئوية من واحد هياكل عنيبية شقة جولة مقابل الهياكل الخبيثة والمؤامرة كما عمود الرسم البياني. حساب الأهمية التي كتبها t-اختبار الطالب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الثقافة 3D يمكن استخدامها بشكل فعال لتمييز النمط الظاهري الخبيثة في خلايا الثدي الظهارية البشرية من الثدي حميدة. الخلايا واحد مطلي على Matrigel حميدة تنمو هياكل كروية المنظمة التي يمكن بسهولة يمكن تصوير واحد كما عنيبات ​​شقة جولة في طائرة واحدة باستخدام التصوير النقيض ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وصفناها هنا ثقافة ثلاثية الأبعاد للخلايا الثدي الظهارية على الغشاء القاعدي المعاد وفائدة هذا النظام للتمييز بين الخبيث مقابل حميدة النمط الظاهري الثدي. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النظام لثقافة أنواع مختلفة من الخلايا من أنسجة غدية وأخرى تم الإبلاغ عن أن تكون قد استخد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 CA107469، R01 CA125577، وU01CA154224 لCG Kleer، جامعة مركز السرطان دعم ميشيغان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Growth Factor Reduced MatrigelBD Biosciences354230Avoid repeat freeze thaw 
Lab-Tek glass hamber slides 8-wellThermo Fisher Scientific177402Precool on ice 
Lab-Tek glass chamber slides 2-well Thermo Fisher Scientific177380Precool on ice 
Goat anti mouse F(ab´)2 fragmentJackson Immunoresearch115-006-006
Normal goat serumJackson Immunoresearch005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodiesMolecular ProbesPlease look at molecular probes website
Prolong gold antifade reagent with DAPIMolecular ProbesP36935
3D Culture Cell Harvesting kitTrevigen3448-020-k
Anti-Apha-6-integrinFisher ScientificMAB13781:100 dilution for IF
Anti-GM130BD Biosciences6108221:100 dilution for IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC ConjugatedFisher Scientific16-2221:100 dilution for IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)Cell Signaling9661s1:50 dilution for IF
Anti-E-cadherinBD Biosciences6101811:200 dilution for IF

References

  1. Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. Stroma in breast development and disease. Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).
  2. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  3. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).
  4. Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).
  5. Rosen, P. P. Rosen's breast pathology. Rosen, P. , 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2008).
  6. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  7. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
  8. Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer. Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).
  9. Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor. Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).
  10. Wang, F., et al. Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts. J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).
  11. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
  12. Wang, R., et al. Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone. Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).
  13. Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells. Differentiation. 74, 141-148 (2006).
  14. Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes. Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).
  15. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8, 1-11 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

86 Matrigel

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved