Nanopodia - رقيقة، غشاء التوقعات الهشة مع الأدوار في حركة التفاعلات بين الخلايا الخليوي و

Summary

Nanopodia قنوات غشاء رقيق ولكنها هشة التي تمتد ما يصل الى 100 ميكرون من قيادة الجبهة الخلفية أو زائدة الخلية والشعور البيئة الخلوية. ويلزم تثبيت مباشرة عند 37 درجة مئوية، وغسل لطيف، وتجنب المذيبات العضوية مثل الإيثانول والميثانول، أو الأسيتون وارتفاع تريتون X-100 تركيزات مراعاة هذه الهياكل الخلوية.

Abstract

الخلايا الملتصقة في ثقافة الحفاظ على حالة الاستقطاب لدعم الحركة والتفاعلات بين الخلايا. Nanopodia هي رقيقة، ممدود، إلى حد كبير، F-الأكتين سلبية التوقعات في غشاء الخلايا البطانية والسرطان الذي يمكن تصور خلال TM4SF1 (عبر الغشاء-4-L-ستة أسرة-1) المناعي تلطيخ. مجموعات TM4SF1 في 100-300 ميكرون قطر TMED (TM 4SF1 ه nriched omains د الصغرى) التي تحتوي على 3 إلى ما يصل إلى 14 فرد TM4SF1 الجزيئات. يتم ترتيب TMED بشكل متقطع على طول nanopodia في تباعد العادية من 1-3 TMED في μ م وترسيخ nanopodia إلى المصفوفة. وهذا يتيح nanopodia تمديد أكثر من 100 μ م من قيادة الجبهة أو زائدة الجزء الخلفي من الخلايا البطانية أو ورم الاستقطاب، ويسبب بقايا الغشاء أن تترك وراءها على MATRالتاسع عندما يتحرك الخلية بعيدا. تم التغاضي TMED وnanopodia بسبب هشاشتها الشديدة والحساسية لدرجة الحرارة. غسل الروتينية وتعطيل تثبيت الهيكل. يتم الاحتفاظ Nanopodia من قبل التثبيت المباشر في بارافورمالدهيد (PFA) عند 37 درجة مئوية، تليها التعرض قصيرة إلى 0.01٪ تريتون X-100 قبل تلطيخ. Nanopodia فتح آفاقا جديدة في بيولوجيا الخلية: يعدون لإعادة تشكيل فهمنا لكيفية خلايا الشعور بيئتهم، كشف وتحديد الخلايا الأخرى على مسافة، والشروع في التفاعلات بين الخلايا في اتصال وثيق، وآليات الإشارات المشاركة في الحركة، والانتشار، والخلية الاتصالات الخلية. قد تكون الأساليب التي يتم تطويرها لدراسة nanopodia TM4SF1 المستمدة من المفيد للدراسات nanopodia التي تشكل في أنواع الخلايا الأخرى من خلال وكالة tetraspanins الكلاسيكية، ولا سيما CD9 أعرب بتواجد مطلق، CD81، وCD151.

Introduction

خلال الاستقطاب للحركة، والخلايا الحيوانية توسيع مجموعة متنوعة من الديناميكية، نتوءات غشاء من سطوحها، بما في ذلك أرجل كاذبة خيطية، أقدام صفاحية والألياف التراجع، والكشكشة ^1. تمت إضافتها مؤخرا إلى هذه القائمة كانت nanopodia، وهو نوع المعترف بها حديثا رقيقة (100-300 ميكرون في القطر)، ممدود (50-100 ميكرون تصل إلى الطويل) الغشاء الذي الإسقاط توفير قنوات الغشاء لتمديد الهياكل F-الأكتين مثل أرجل كاذبة خيطية والألياف التراجع، وأنه وصمة عار بإيجابية مع TM4SF1 (عبر الغشاء-4-L-ستة أسرة-1) في البطانية والورم الخلايا المستزرعة ^2،3.

TM4SF1 هو بروتين مع مثل tetraspanin طوبولوجيا التي كانت تعرف أصلا باعتبارها مستضد الخلايا السرطانية ⁴ قبل اكتشاف جزيء أن العلامات البيولوجية هو الخلايا البطانية التي تلعب دورا أساسيا في تكاثر الخلايا البطانية والهجرة ^2،3. وكشف المناعي تلطيخ أن TM4SF1 المترجمة إلى perinucالحويصلات ولير لغشاء البلازما، ويتم تخصيبها في TM 4SF1 ه nriched omains د الدقيقة (TMED). TMED مرساة nanopodia إلى matrix والحاضر في نمط النطاقات متباعدة بصورة منتظمة من 1-3 طول TMED / ميكرون من nanopodia. Nanopodia تمتد عادة من الأمام مما يؤدي خلية وراء خلية الخلفية خلال الاستقطاب للحركة. نظرا لطبيعة ملتصقة شركة من TMED، nanopodia غير قادرين على التراجع مرة أخرى إلى الخلية وهو يتحرك بعيدا؛ وبالتالي التخلي عن بقايا nanopodia تتبع خارج مسار الحركة الخلوية. Nanopodia توفير قنوات لتمديد غشاء F-الأكتين والتراجع، والمواقع هي من التفاعلات بين الخلايا والاتصالات ^2،3. هذه الخصائص يعني أن nanopodia توفير فرصة فريدة لدراسة الآليات الكامنة وراء التجمع F-الأكتين خلال الاستقطاب الخلوية، والاستشعار الخلوية للبيئة، وتحديد مسار واتجاه حركة الخلية، والتفاعلات بين الخلايا والثانية الاتصالات.

نظرا لطبيعة مسعور للغاية من TMED وطبيعة الغشائي رقيقة وهشة من nanopodia، يحتاج إلى رعاية خاصة التي يتعين اتخاذها من أجل الحفاظ على TMED وnanopodia. تدمير nanopodia وإزالة TMED بالطرق المختبرية الشائعة هي الأسباب المحتملة لماذا ظهرت المنشورات ثلاث وستين فقط على TM4SF1 منذ أول اكتشاف لها في عام 1986 ¹ والافتقار التام إلى معرفة تخصيب TM4SF1 في 100-300 ميكرون microdomains على سطح الخلية حتى تقرير TM4SF1 في الخلايا البطانية في عام 2009 ^2.

أساليب المناعية التقليدية عادة ما تستخدم المذيبات العضوية مثل الإيثانول والميثانول، الأسيتون أو لإصلاح الخلايا واستخدام 0.1٪ أو أعلى تركيز تريتون X-100 لpermeabilize الخلايا ^5. تنفيذ الدراسات وصفها هنا ثلاثة تغييرات كبيرة في الطريقة التقليدية للكشف عن TMED وnanopodia: (ط) استخدام 37 درجة مئوية 4٪ PFA وإصلاح الخلايا في 3776؛ مئوية الحاضنة، (ب) تطبيق لطيف درجة حرارة الغرفة PBS الغسيل، و (ج) استخدام أقل من 0.03٪ تريتون X-100 فقط لفترة وجيزة لpermeabilize الخلايا قبل إضافة الأجسام المضادة الأولية، كما تريتون X-100 أعلى من 0.03٪ سيتم استخراج TM4SF1.

جميع tetraspanins تشكيل microdomains على غشاء الخلية ⁶ و بعض colocalize مع TMED في البطانية وخلايا الورم ^2،3. كما يتم التعبير عن tetraspanins مثل CD9، CD81، وCD151 بتواجد مطلق، وبروتوكول تلطيخ الموصوفة هنا يمكن أن تمتد إلى العديد من أنواع مختلفة من الخلايا التي تفتقر TM4SF1 للدراسات وظيفة nanopodia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. الثقافة الخلية على الكولاجين المغلفة القرص زجاج

1. الأقراص مكان الزجاج (12 مليمتر في القطر) في وعاء زجاجي (4 أوقية) والأوتوكلاف لتعقيم الأقراص.
2. وضع 25 مل 70٪ من الإيثانول في أنبوب 50 مل الصقر ووضعه في غطاء ثقافة الخلية. هذا الحل يمكن إعادة استخدامها عدة مرات حتى مستوى الحل ينخفض ​​إلى 20 مل.
3. وضع ملقط حاد مع نقطة غرامة اضافية في الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقائق قبل استخدامه للتعامل مع القرص الزجاج.
4. إزالة بعناية ملقط من الأنبوب وأغلق الغطاء، ثم ضع برفق الإيثانول تعامل ملقط على رأس الأنبوب إلى الهواء الجاف لمدة 2 دقيقة. لا تسمح غيض من ملقط للمس أي شيء في غطاء محرك السيارة.
5. استخدام ملقط معقم للاستيلاء على قرص واحد زجاجية معقمة للخروج من جرة الزجاج ووضعه في بئر من 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية. كرر حتى تم ملؤها العدد المطلوب من الآبار مع أقراص.
6. وضع 500 ميكرولتر من محلول الكولاجين البقري (50 نانوغرام / مل) في كل بئر يحتوي على قرص من الزجاج ووضعه في 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ خلية ثقافة حاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل. ليس هناك ضرر في الحضانة لفترة أطول.
7. الحصاد HUVEC (الخلايا البطانية الوريد السري الإنسان) أو PC3 (الخلايا السرطانية في البروستاتا) التي كانت تزرع بالفعل في 150 ملم وحة الثقافة الخلية من خلال trypsinization ومنع النشاط التربسين باستخدام كاملة المتوسطة ثقافتها. جمع الخلايا في أنبوب 15 مل الصقر.
8. حساب عدد الخلايا والتأكد من جدوى أكبر من 90٪.
9. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف.
10. استخدام مستنبت لتمييع الخلايا إلى 10 ⁵ خلية / مل. وضع الخلايا على الجليد.
11. نضح الكولاجين في غطاء محرك السيارة خلية ثقافة ووضع بلطف 500 ميكرولتر من تعليق خلية إلى كل بئر التي تم precoated الأقراص الزجاج مع الكولاجين. سوف 5 × 10 ⁴ خلايا / جيد في 24 لوحة جيدا تعطي 60٪ أسيوطluency لHUVEC و 30٪ confluency للخلايا PC3. ملاحظة: إضافة المزيد من تعليق خلية لأعلى كثافة الخلية.
12. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ الحاضنة لمدة 1 ساعة، 2 ساعة، 4 ساعة، 6 ساعة، أو 24 ساعة لتتبع أنشطة nanopodia ومرور الخلية. عادة، سوف الخلايا نعلق على القرص الزجاج في أول 30 دقيقة، ثم البدء في استقطاب وتهاجر في الساعة الأولى، وإجراء التفاعلات بين الخلايا وانقسام الخلايا في الساعات التالية.

2. تثبيت الخلية

1. كل بئر ستحتاج 500 ميكرولتر PFA 4٪ (بارافورمالدهيد) لإصلاح الخلايا. إما تصنيعها تجاريا أو تقدم طازجة PFA 4٪ يمكن استخدامها. حساب كمية PFA اللازمة استنادا إلى عدد من الآبار على استعداد، ووضع منهاج العمل في أنبوب 15 مل الصقر. تنبيه: امتصاص العرق هو مادة مسرطنة مشتبه بهم.
2. وضع أنبوب الصقر في موقف الستايروفوم التي كانت بالفعل في مكان في الحاضنة 37 درجة مئوية. ترك الأنبوب في الحاضنة لمدة 30 دقيقة إلى الحربم حتى PFA إلى 37 درجة مئوية.
3. وضع وسادة التدفئة في غطاء محرك السيارة والثقافة، وتشغيله.
4. إخراج 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية وPFA prewarmed للخروج من الحاضنة ووضعه على رأس وسادة التدفئة.
5. استخدام يدا واحدة لنضح المتوسطة من بئر، وعلى الفور بعد استخدام اليد الأخرى إلى الشريحة بلطف 500 ميكرولتر PFA في البئر من خلال الحافة جيدا. لتسهيل الطموح، إمالة لوحة الثقافة في حوالي 45 درجة، يميل ضد موقف الستايروفوم بحيث أنها مستقرة في هذه الزاوية. وسوف يسهل هذا الطموح وإضافة PFA حل لالبئر من دون إزعاج الخلايا في الثقافة. هذه هي الخطوة الأكثر أهمية للحفاظ على بنية الخلية الأصلية للأنشطة الخلية.
6. كرر العملية حتى تلقوا جميع الآبار مع قرص الزجاج PFA. ملاحظة: ستكون جميع الخطوات التي تحتاج إلى تغيير الحل موجود مسبقا من البئر تطبيق إجراءات الطموح نفسه.
7. وضع لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
8. تأخذ اللوحة إلى غطاء محرك السيارة والثقافة، وإمالة ضد الستايروفوم كما هو موضح في الخطوة 2.5. استخدام يد واحدة لنقل بلطف PFA من البئر في أنبوب جمع؛ استخدام اليد الأخرى لوضع مباشرة بعد ذلك لا يقل عن 500 غرفة درجة الحرارة PBS ميكرولتر في البئر. بعد أن تم غسلها جميع الآبار، والعودة وتكرار الغسيل PBS مرة أخرى في كل جيدا. إفراغ PFA جمعها في وعاء النفايات الخطرة.
9. إعداد عازلة تمنع المحكمة الجنائية الدولية بإضافة 2٪ مصل بقري جنيني لبرنامج تلفزيوني. يضاف 0.04٪ أزيد الصوديوم (20٪ من تمييع الحل الأسهم) كمادة حافظة. تنبيه: أزيد الصوديوم هو مركب سام. ويمكن تخزين المخزن المؤقت في 4 درجة مئوية لفترة طويلة من الزمن دون التلوث الجرثومي.
10. مع لوحة الثقافة لا يزال يميل ضد موقف، مرة أخرى من خلال كل دورة الشفط جيدا لإزالة برنامج تلفزيوني ومباشرة بعد ذلك بإضافة 500 ميكرولتر من المحكمة الجنائية الدولية عرقلة العازلة. الخلايا هي الآن جاهزة للتلوين المناعي. إذا لزم الأمر، وخلايا ثابتة يمكن تخزينها في الثلاجة 4 ° C لمدة أسبوع دون خسارة كبيرة من البروتين TM4SF1.

3. TM4SF1 المناعي تلون Nanopodia

1. في كل بئر، واستبدال العازلة حجب 500 ميكرولتر المحكمة الجنائية الدولية مع عازلة تمنع جديدة تحتوي على 0.01٪ تريتون X-100 والسماح لها الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. لا تستخدم أعلى من 0.03٪ تريتون X-100 كما أنه سيتم إزالة TM4SF1 من أغشية الخلايا. PBS غسلها الخلايا من الخطوة 2.10 يمكن نقلها مباشرة إلى المخزن المؤقت حجب تحتوي على تريتون إذا كان على استعداد لتلطيخ أن تبدأ على الفور.
2. تمييع الأساسية المضادة للTM4SF1 (أو المضادة للCD9) الأجسام المضادة إلى 0.5 ميكروغرام / مل في المحكمة الجنائية الدولية عرقلة العازلة.
3. في كل بئر، وإزالة ICC/0.01٪ تريتون العازلة واستبدالها 300 ميكرولتر من الحل لمكافحة TM4SF1 الضد. احتضان 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو ترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
4. غسل كل بئر مع ما لا يقل عن 500 ميكرولتر PBS. تكرار 3X؛ في كل مرة تعطي في LeAST 5 دقائق من الوقت الحضانة.
5. إعداد الأجسام المضادة وphalloidin حل الثانوي في المحكمة الجنائية الدولية عرقلة العازلة، وذلك باستخدام 1،000 مرة التخفيف من اليكسا 488 المسمى حمار مكافحة فأر الضد الثانوية (2 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) و 1،000 س التخفيف من phalloidin (50 نانوغرام / مل تركيز النهائي).
6. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية وحل phalloidin إلى كل بئر واحتضان لمدة 2 ساعة أو ترك الأمر بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
7. تكرار PBS غسل الخطوات مع ما لا يقل عن 5 دقائق في الحضانة غسل. في غسل الماضي، وترك كل بئر في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة.
8. إسقاط قطرة واحدة (~ 10 ميكرولتر) من مكافحة تتلاشى تصاعد وسائل الاعلام على شريحة زجاجية.
9. منحنى غيض من 19 G 1 ½ حقنة في الإبرة 90 درجة عن طريق الضغط بلطف على سطح صلب. استخدام يد واحدة لعقد إبرة محني ورفع بلطف صعودا قرص الزجاج من البئر، واستخدام اليد الأخرى لفهم القرص باستخدام ملقط حادة.
10. تحويل القرص الزجاج و# 160؛ وجهه لأسفل السماح للاتصال الجانب خلية الإعلام متزايدة على شريحة زجاجية. وضع بلطف قرص الزجاج واتركها تجف بين عشية وضحاها في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة.
11. انتقل إلى صورة ملطخة nanopodia المناعي، أو تخزين الشرائح في مربع الشريحة في -20 درجة مئوية. ستبقى الشرائح للعرض لمدة بضعة أشهر في -20 درجة مئوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لخطوة 1:

إذا الخلايا (مثل HUVEC وPC3 المستخدمة في هذه الدراسة) هي قادرة على النمو بشكل طبيعي، وسوف نعلق على خلايا القرص المغلفة الكولاجين في غضون 30 دقيقة بعد هم المصنف، استقطاب وتصبح المحمول بعد ذلك بقليل، وتوسيع nanopodia قبل مسيرتهم الحرك?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Nanopodia قنوات رقيقة الغشاء الخلوي أن نعلق بحزم إلى matrix خلال TMED ويمكن أن تمتد أكثر من 100 ميكرون من خلية المحمول الاستقطاب لاستشعار البيئة والتفاعلات بين الخلايا توسط ^2،3. Nanopodia التمسك مصفوفة بقوة حتى يتم ترك مخلفات وراء بينما يتحرك بعيدا الخلية (الشكلان 1 و <...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass disks	Fisher Scientific	12-545-82	12 mm diameter
Glass jar	Fisher Scientific	02-912-310	Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz
Glass slide	Fisher Scientific	12-544-1	Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides
50 ml Falcon tube	BD Falcon	352070	50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.
15 ml Falcon tube with Styrofoam rack	Corning	430790	Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes
Sharp forceps	Fisher Scientific	13-812-42	Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps
24-well Cell culture plate	BD Bioscience	353047	24-well Cell Culture Plate
150 mm Cell culture plate	BD Bioscience	353025	150 mm cell culture plate
19 G 1 ½ Syringe needle	BD Bioscience	309635	19 G 1 ½
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2701	Decon's Pure Ethanol 200 Proof
Collagen solution	BD Bioscience	354249	Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-053-CI	0.25% Trypsin-EDTA 1x
DMEM	Life Technologies	11965-092	DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate
10x PBS	Affymetrix	75889 5 LT	PBS, 10x Solution, pH 7.4
PFA (paraformaldehyde)	Affymetrix	19943 1 LT	4% in PBS
FBS	Sigma-Aldrich	F4135-500ML	Fetal Bovine Serum
EGM2-MV	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.
Mouse anti-human TM4SF1 antibody	Millipore	MAB3127	Epitope is located in extracellular domain
Mouse anti-human CD9 antibody	BD Bioscience	555370	Epitope is located in extracellular domain
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody	Life Technologies	A-21202	Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)
Phalloidin	Chemicon	90324	Rhodamine-conjugated Phalloidin
Anti-fade mounting media	Life Technologies	P-36931	ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI
70% Ethanol			17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water
10x PBS (make 200 ml)			20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water
20% Triton X-100 (make 20 ml)			4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water
4% NaN3 (make 25 ml)			1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water
50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)			Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS
ICC Blocking Buffer (50 ml)			49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3)
ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)			50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100
HUVEC	Lonza	C2517A	www.lonza.com
PC3	ATCC	CRL-1435	www.atcc.org
Cell culture hood	NuAIRE	Nu-425-600	NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet
37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator	CellStar	QWJ300DABA	Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator
Heating pad	K&H Manufacturing	1020	K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com)
Centrifuge	Sorvall	T6000B	Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hemocytometer