JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وترد تفاصيل بروتوكول للفي المختبر وضع العلامات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مع ثاني النانوية توليد التوافقي. وتعرض أيضا منهجيات التحقيق HESC بواسطة المجهر متعدد الفوتون والتمايز بهم في مجموعات القلب.

Abstract

في هذه التجربة تصور، وتقدم تفاصيل البروتوكول في المختبر لوضع العلامات من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) مع النانوية الجيل الثاني التوافقي (HNPs). هذه الأخيرة هي عائلة جديدة من تحقيقات أدخلت مؤخرا لوصفها العينات البيولوجية للتصوير متعددة الفوتون. HNPs قادرة على مضاعفة وتيرة ضوء الإثارة من خلال عملية البصرية غير الخطية من الجيل الثاني التوافقي مع عدم وجود قيود على الطول الموجي الإثارة.

متعدد الفوتون منهجيات HESC التمايز في مجموعات القلب (كما حافظت الثقافات الهواء السائل على المدى الطويل) استنادا يتم عرض بالتفصيل. على وجه الخصوص، وأظهرت الأدلة على كيفية تعظيم مكثفة الثاني التوافقي (SH) انبعاث HNPs معزولة خلال الرصد 3D من الضرب أنسجة القلب في 3D. هو مفصل أيضا تحليل الصور الناتجة لاسترداد أنماط النزوح 3D.

Introduction

أنظمة غير الخطية المجهري، وذلك بفضل قدرات الكامنة ثلاثة باجتزاء الأبعاد بهم، وقد أدت على نحو متزايد الطلب على صورة مستقرة fluorophores مع عصابات امتصاص ثنائي الفوتون في المستقبل القريب من الأشعة تحت الحمراء. فقط في العامين الماضيين، لاستكمال تطوير العلامات المستندة إلى مضان (الأصباغ، ونقاط الكم، النانوية تحويل متابعة)، وقد تم التصوير منهجية مختلفة الاستفادة من استخدام أسرة رواية الجسيمات النانوية غير الخطية بطبيعتها عن التسميات، أي النانوية التوافقي (HNPs) التي تم تطويرها خصيصا لمتعدد الفوتون المجهري. هذه التسميات، استنادا إلى بلورات noncentrosymmetric غير العضوية، وممارسة النقيض البصرية توليد SH من وتيرة الإثارة: على سبيل المثال من خلال تحويل جزء من الأشعة تحت الحمراء بالقرب من ضوء الإثارة نابض (λ = 800 نانومتر) إلى ضوء أزرق مرئية (λ / 2 = 400 نانومتر) . لقد اختبرت العديد من الكتاب في الماضي القريب مواد مختلفة، بما في ذلك أيودات الحديد الحديد (IO 3) 3 1، نيوبات البوتاسيوم (KNbO 3) 2، والليثيوم نيوبات (ينبو 3) 3، تيتانات الباريوم (BaTiO 3) 4،5، فوسفات البوتاسيوم والتيتانيل (KTiOPO4، KTP) 6-8، وأكسيد الزنك (أكسيد الزنك ) 5،9،10. مقارنة تحقيقات الفلورسنت، HNPs تمتلك سلسلة من الخصائص الجذابة، مثل غياب كامل للتبيض وامض، والعصابات الانبعاثات الضيقة، الإثارة الطول الموجي tunability (الأشعة فوق البنفسجية إلى الأشعة تحت الحمراء من)، والقدرة على استرجاع التوجه، والاستجابة البصرية متماسكة. وقد تم شرح هذه الخصائص فريدة من نوعها مؤخرا في ورقتين مراجعة شاملة 11،12. إمكانية العمل في المنطقة الطيفي بالأشعة تحت الحمراء، مما يزيد من عمق التصوير عن طريق تقليل نثر والاستيعاب، كما يحد بشكل كبير تدهور صورة عينة 13،14. علاوة على ذلك، للإشارة الصورة مستقرة بلا حدود التي يكفلها HNPs يجعلها مثالية للتحقيقات تتبع الخلية على المدى الطويل، والتي طق جذابة بشكل خاص للتطبيقات الطب التجديدي 15.

في هذه التجربة تصور، وتقدم تفاصيل البروتوكول في المختبر لوضع العلامات من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) مع HNPs unfunctionalized. هو مفصل تركيب وإعداد المعلقات الغروية في منشور السابقة والمراجع فيها 16 ويقع خارج نطاق هذا العمل. يتم عرض منهجيات التحقيق HESC بواسطة المجهر متعدد الفوتون والتمايز بهم في مجموعات القلب (كما حافظت الثقافات الهواء السائل على المدى الطويل). يمكن السماح ESC الإنسان للتمييز ضمن ما يسمى الهيئات مضغي الشكل (EBS) بطريقتين مختلفتين، إما عن طريق تشكيل EB شظايا مستعمرة في تعليق أو، بدلا من ذلك، تجميع الخلايا واحد في EBS باستخدام لوحة Aggrewell القسري، كما هو موضح في الشكل 1A . زراعة ضرب مجموعات من الخلايا القلبية على بولي تترافلوروإيثيلين (السليكوون) مرشحات مسامية القوات المسلحة الكونغوليةilitates على الصيانة على المدى الطويل لمزيد من الدراسات (على سبيل المثال القياسات الكهربية من إمكانات العمل).

مصدر الإثارة من مجهر المسح يجب أن تكون قادرة على تقديم نبضات فائقة القصر (مع مدة نبض أصغر من 300 FSEC في عينة) من أجل الوصول إلى ذروة السلطة اللازمة لأداء التصوير التوافقي الثاني من HNPs. على سبيل المثال، وأكثرها شيوعا FSEC المصدر المستخدمة في التصوير هي الانضباطي تي: ليزر الياقوت. بدلا من ذلك، وأشعة الليزر فائق السرعة أخرى يمكن استخدامها، على سبيل المثال الإربيوم أيون 17، الكروم 18 forsterite أو تي: الياقوت ضخ الأشعة تحت الحمراء مؤشرات التذبذب حدودي البصرية. يمكن تجهيز المجهر مع الهدف يفضل أن يكون مع الفتحة العددية عالية نوعا ما. الأهم من ذلك، قبل القياسات، وفي كل مرة يتم استبدال الهدف، وهي ملزمة للحد من التشتت الحالي في انشاء (العدسات) عن طريق تحسين إعدادات نبضة ليزر قبل الضاغط في العملالطول الموجي للاختيار. هذا الإجراء، المفصل في البروتوكول، ويضمن أن نبضة ليزر هو أقرب ما يكون إلى التحويل مدة محدودة (أي أقصر وقت ممكن) في المستوى البؤري ويزيد من استجابة عينة غير الخطية.

الهدف من تحليل الصور موضح في نهاية هذا البروتوكول هو تحديد وتتبع الحركات في 3D HNPs المرتبطة تقلصات الإيقاعي من الضرب مجموعات القلب. ويتحقق النانوية تتبع في الطائرة صورة ببساطة عن طريق تحديد مواقعهم في إطارات الفيلم المتعاقبة. لاستخراج معلومات عن الحركة المحورية، ومعايرة مسبقة من شدة الاستجابة غير الخطية بوصفها وظيفة من الإزاحة المحورية إلزامي. نلاحظ أن لقياسات طويلة الأمد، عنصر تحكم التداخل النشطة من موقف محوري العينة المطلوبة للحفاظ على صحة منحنى المعايرة بحضور الانجرافات الحرارية و / أو الميكانيكية.

وHNPs تستخدم هنا لتراكوتقوم خلايا البريد الضرب داخل المجاميع على البوتاسيوم نيوبات أكسيد (KNbO 3)، ولكن يتم مراجعة المواد النانوية الأخرى غير الخطية المتاحة في التفاصيل في عمل Staedler وآخرون 16.

الكفاءات البصرية غير الخطية لمعظم المواد النانوية التحقيق حتى الآن قابلة للمقارنة جدا. الخيار لKNbO 3 كان الدافع وراء أساسا من الاستقرار جيدة من الحل الغروية وتوافق مع الحياة جيدة، واختبارها على العديد من خطوط الخلايا البشرية حتى في تركيز عالية نسبيا والأوقات الطويلة المعرض 16.

نظرا لحداثة من المواد متناهية الصغر المستخدمة لهذا العمل، وتظهر الخصائص الرئيسية للHNPs بالمقارنة مع نيون / الانارة علامات الحيوية في فترة قصيرة للرسوم المتحركة الفيديو الأصلي الكمبيوتر أدركت من قبل المؤلفين.

Protocol

1. الثقافة وتوسيع ESC الإنسان

  1. إعداد وسط الانتشار الخلية (وتسمى PM) تحتوي على خروج المغلوب DMEM تستكمل مع 20٪ مصل خروج المغلوب، 1٪ MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1٪ الجلوتامين L-200 ملم، 1٪ البنسلين الستربتوميسين، و 3.5 ميكرولتر β-المركابتويثانول.
  2. ذوبان الجليد ESC الإنسان (HESC) في 8 مل PM المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي منهم 5 دقائق في 115 x ج لتجاهل تستكمل DMSO تجميد المتوسطة.
  3. إضافة 1 مل من PM المتوسطة التي تحتوي على 10 ملي روك المانع لمنع موت الخلايا المبرمج وتحسين بقاء الخلية على ذوبان (24 الحضانة ساعة فقط).
  4. إضافة عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) لرئيس الوزراء في التركيز المطلوب (4-10 نانوغرام / مل) لصيانة تعدد القدرات.
  5. لوحة للHESC على الإنسان المشع القلفة الخلايا المغذية (γHFF) (الشكل 1A)، مطلي سابقا بتركيز 2 × 10 4 خلية / سم 2.
  6. تغيير المتوسطة اليومية، وعند الضرورة، وإزالة أجزاء من جolonies بدءا التفريق بواسطة الشفط باستخدام ممدود خفض حاد باستور ماصة.
  7. مرة واحدة في الأسبوع، والمستعمرات مرور إنزيمي:
    1. إزالة المتوسطة وغسل المستعمرات مع 2 مل PBS.
    2. إزالة برنامج تلفزيوني واحتضان لهم مع 0.5 مل لكل بئر من الحارة كولاجيناز الرابع في 1 ملغ / مل لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
    3. جمع شظايا مستعمرة في 2 مل PM الجديدة وأجهزة الطرد المركزي في 115 x ج لمدة 3 دقائق.
  8. بدلا من ذلك، يمكن المستعمرات passaged ميكانيكيا عن طريق كشط:
    1. إزالة المتوسطة وغسل المستعمرات مع 2 مل PBS.
    2. تتخلص من المستعمرات باستخدام أداة StemPro EZPassage الأسطوانة مكشطة (الشكل 1B) يدويا.
    3. جمع شظايا مستعمرة وأجهزة الطرد المركزي ثم لمدة 3 دقائق في 115 x ج لإزالة طاف.
    4. شظايا وحة على γHFF أو معالجتها للتمايز في الهيئات مضغي الشكل (EBS).

2. التمايز ESC الإنسانبروتوكول

  1. إعداد المتوسطة التمايز (DM) باستخدام خروج المغلوب DMEM تستكمل مع 2٪ مصل Hyclone، 1.0٪ MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1.0٪ الجلوتامين L-200 ملم، 1٪ البنسلين الستربتوميسين، 3.5 ميكرولتر β-المركابتويثانول.
  2. إزالة المتوسطة وغسل المستعمرات مع 2 مل PBS.
  3. تشكيل EB شظايا مستعمرة في التعليق:
    1. إزالة برنامج تلفزيوني واحتضان لهم مع 0.5 مل لكل بئر من الحارة كولاجيناز الرابع في 1 ملغ / مل لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
    2. جمع شظايا مستعمرة في 2 مل DM جديدة وأجهزة الطرد المركزي في 115 x ج لمدة 3 دقائق.
    3. ثقافة لهم في تعليق في منخفضة للغاية مرفق 6 لوحات جيدة (2 مل لكل بئر) لمدة 4 أيام (الشكل 1C).
    4. وجمع لوحة للEBS شكلت حديثا على 0.1٪ المغلفة الجيلاتين 24 لوحات جيدة (حوالي 3 EBS / جيد) (الشكل 1D).
  4. بدلا من ذلك، اضطر تجميع الخلايا واحد في EBS باستخدام لوحة Aggrewell:
    1. إزالة برنامج تلفزيوني وفصل المستعمرات في الخلايا واحدة باستخدام accutase (0.5 مل / جيد).
    2. خلايا الطرد المركزي و resuspend في DM عند 1.2 × 10 6 / مل.
    3. إضافة 2 مل لكل غرفة Aggrewell لمدة 1 يوم (الشكل 1B).
    4. جمع EBS شكلت حديثا (الشكل 1C ') وطبق لهم على 0.1٪ المغلفة الجيلاتين 24 لوحات جيدة (حوالي 3 EBS / جيد).
    5. تغيير DM كل 2-3 أيام حتى ظهور مجموعات من الضرب العضلية (15-30 يوما).

3. الثقافات 3D الهواء السائل من ضرب الكتل وصفها مع HNPs

  1. تحديد وتشريح يدويا مجموعات من الضرب العضلية (الشكل 1D)، والتي تظهر عادة بعد 2-4 أسابيع من الثقافة، وذلك باستخدام ممدود خفض حاد باستور ماصة.
  2. إيداع 4 مرشحات السليكوون في إدراج التي سيتم وضعها على لوحة 6 جيدا (الشكل 1F).
  3. إضافة 1 مل من DM المتوسطة على رأس مجموعة شرق افريقياح جيدا.
  4. إضافة واحد تشريح كتلة الضرب على كل مرشح السليكوون (الشكل 1E)، والحد الأقصى 4/well، أي 24 في الركام لوحة (الشكل 1F).
  5. تغيير DM المتوسطة كل 2-3 أيام.
  6. لتسمية مجموعات، إزالة عامل التصفية السليكوون تحتوي الكتلة الضرب ووضعها على الزجاج 3.5 سم أسفل الطبق (170 ميكرون سميكة).
  7. إضافة 1 مل من الشرطة الوطنية الهايتية في تركيز 50 ميكروغرام / مل لمدة 30 دقيقة.

4. التصوير الضوئي غير الخطي

  1. إعداد العينات. بعد وضع العلامات باور (انظر الخطوة 3.6)، ونقل إما كليا أو تمييز أنواع البسكويت العالي الطاقة أوائل المجموعات الضرب القلب (تشريح عند ظهور انكماش) ​​على مرشحات السليكوون أكثر من 170 ميكرون سميكة صحن الزجاج السفلي متوافق مع مسافة العمل من أهداف عالية الفتحة العددية. بدلا من ذلك، تطبيق الطلاء مباشرة لضرب التكتلات على طبق من الزجاج السفلي قبل المغلفة مع 0.1٪ الجيلاتين.
  2. عينات نقل إلىالكل في واحد المجهر مجهزة يحتضنها غرفة ضمان درجة حرارة ثابتة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون 2 السيطرة على مدى فترات طويلة من الزمن.
  3. بعد التفتيش الأولي، وصورة العينة عن طريق التصوير حقل واسع تحت الضوء الإضاءة البيضاء لتحديد هياكل المصالح داخل EBS متباينة أو مجموعات الضرب النشطة التي سيتم اختيارها لمزيد من التحقيقات.
  4. إذا تألق ذاتي الخلية من NADH وSH من HNPs يجب أن يتم الحصول عليها في وقت واحد، ووضع أقصر طول موجي الإثارة ليزر (أي 720 نانومتر) لتتناسب مع امتصاص الجزيئي. استخدام واحد ضيق الفرقة تمرير مرشح الطيفية تركزت في نصف الطول الموجي الإثارة (أي λ = 360 ± 10 نانومتر) لكشف SH، وآخر للكشف عن تألق ذاتي.
  5. أداء أولا لذلك، دقة منخفضة سريع، ثلاثي الأبعاد مسح لإعادة بناء التشكل العام للكتلة القلب وتحديد الصورة داخل الطائرة حجم الكتلة مع عدة مرئية باورق.
  6. إذا لزم الأمر، تغيير الطول الموجي الإثارة بحرية لمطابقة أفضل الخصائص البصرية لعينة أو لتجنب photobleaching من وتلف الصورة وصورة أعمق في الأنسجة مع الطول الموجي الأشعة تحت الحمراء (أي 790 نانومتر) واستبدال فلتر التوافقي الثاني وفقا لذلك (أي 395 نانومتر ). تحسين إعدادات نبضة ليزر قبل ضاغط في الطول الموجي العمل من خيار من خلال تعظيم إشارة التوافقي الثاني من HNPs تترسب على العينة.
  7. رصد في الوقت الحقيقي تقلصات العنقودية القلب، وتعيين المجهر الماسح الضوئي في أسرع وضع مثل وضع الرنانة، مما يتيح الحصول على سرعة عالية من الصور ثنائية الأبعاد.
  8. اختيار الإعدادات كما أفضل حل وسط بين تباين الصورة وسرعة اكتساب، مثل:
    • مسح المتوسط: 4
    • بكسل يسكن الوقت: 0.1 μsec
    • معدل الصورة: 3.75 قطة في ثانية (الثانية)
  9. يتم تعديل قوة الليزر وفقا لتنسيق بقعة قإيزي وسرعة المسح الضوئي. 50 ميغاواط (تقاس عند مدخل الهدف) هو القيمة النموذجية ل0.1 μsec بكسل زمن السكون وخطة APO 20X NA 0.75 هدف الحفاظ على بقاء الخلية.

5. تحليل الصور

  1. إجراء المعايرة المحوري. اختيار واحد باور المودعة على ركيزة العارية. ضبط التركيز (أي الموقف المحوري للجسيمات متناهية الصغر) لتعظيم كثافة SH. تختلف بطريقة تسيطر على الموقف المحوري للمرحلة المجهر للحصول على منحنى المعايرة المتعلقة كثافة SH بوصفها وظيفة من الشرطة الوطنية الهايتية تعويض من المستوى البؤري. وذكرت وإخراج هذا إجراء المعايرة ل0.75 هدف خطة APO 20X NA في الشكل 4C.
  2. حدد HNPs موجودة في جميع إطارات الفيديو وتحديد الحركات الدورية. هذا الإجراء يمكن أن يكون آليا بسهولة، على سبيل المثال من خلال التعليمات البرمجية المخصصة تسعى للإشارة أقصى البقع كثافة في منطقة محددة من الفائدة وربطها بين مختلف الأطر (رمز المثال مكتوبة في Matlab R2009 ب باستخدام وظيفة "الدعائم المنطقة من أدوات معالجة الصور وعرضها).
  3. تقييم الكمي للخارج الطائرة التشريد، ويرتبط مع HNPs ارجاعها غير مستمر تتحرك على طول المحور البصري، عن طريق تحويل التحويرات كثافة في جميع أنحاء إطارات مختلفة في الإزاحة المحورية باستخدام منحنى المعايرة الذي أنشئ في الخطوة 5.1. لاحظ أن هذا الإجراء يتيح الوصول إلى الحركات المحورية ولكن لا يمكن أن تستخدم لتحديد اتجاه المطلقة (صعودا أو هبوطا).

النتائج

قبل تقييم النشاط الضرب بواسطة التصوير متحد البؤر، تم إجراء توصيف دقيق للاستجابة البصرية غير الخطية من المرشحات السليكوون، إما وحده أو في وجود HNPs في تركيز عال (1 ملغ / مل). تم التأكد من أن: ط) الركيزة العارية اثنين من الفوتون مضان متحمس ضعيف جدا، ولا يمكن منع قياس العينات...

Discussion

تطبيق تكنولوجيا النانو لأبحاث الخلايا الجذعية هو حقل جديد نسبيا ولكن التوسع السريع. كما أشار إلى ذلك العديد من المقالات مراجعه عن هذا الموضوع، واستخدام الجسيمات النانوية يمكن تطبيقها على إنجاز المهام البحثية المختلفة، بدءا من خلية تتبع (سواء في التجارب المختبرية...

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أنوه تمويل جزئي من FP7 مشروع بحث مشروع INTERREG الرابع فرانس سويسرا NAOMI NAMDIATREAM الأوروبية (NMP4-LA-2010-246479، http://www.namdiatream.eu) و.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Microscope IncubatorOKO LABUNO package (top stage)37 °C, 5% CO2, moisturized
Multiphoton microscopeNikonAR1-MP
Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors
Filters SHG and autofluorescenceSemrockFF01-360/12-25
FF01-395/11-25 
FF02-485/20-25
Microscope objectivesNikon
CFI Plan Fluor 10XNA 0.30, WD 16 mm
CFI Plan Apo 20XNA 0.75, WD 1.0 mm, VC
CFI Apo 40XNA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat
Rhock inhibitor SigmaY-27632
Knockout DMEMInvitrogen10829
Knockout Serum Invitrogen10828
MEM Non-Essential Amino Acids Invitrogen1140
L-glutamine 200 mM Invitrogen25030
Penicillin-streptomycinInvitrogen15140
β-mercaptoethanol SigmaM7522
Collagenase IV Gibco17104-019
Roller scraper tool StemPro EZPassage, Invitrogen23181-010
StemPro Accutase GibcoS11105-01
Aggrewell system StemCell Technologies27845
Hyclone serum Thermo ScientificSH30070.03
GelatinSigmaG9391
6-well plates Falcon353046
24-well plates Nunclon142475
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filtersMilliporeNA76/25
InsertsMilliporePICM03050

References

  1. Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
  2. Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
  3. Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
  4. Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
  5. Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
  6. Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
  7. Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
  8. Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
  9. Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
  10. Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
  11. Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
  12. Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
  13. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
  14. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  15. Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
  16. Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
  17. Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
  18. Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
  19. Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
  20. Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
  21. Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
  22. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
  23. Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
  24. Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
  25. Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
  26. Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
  27. Haase, M., Schafer, H. Upconverting nanoparticles. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).
  28. Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
  29. Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

87 ESC EBS cardiomyocyte

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved