القبض على ببتيد سكري لخلية سطح البروتينات

Summary

بروتينات سطح الخلية مهمة من الناحية البيولوجية والغليكوزيلاتي على نطاق واسع. ونحن نقدم هنا نهج ببتيد سكري التقاط لذوبان، وإثراء، وdeglycosylate هذه البروتينات لتحليلات البروتين السهل LC-MS القائمة.

Abstract

بروتينات سطح الخلية، بما في ذلك البروتينات المصفوفة خارج الخلية، والمشاركة في جميع العمليات والوظائف الخلوية الرئيسية، مثل النمو، والتمايز، والانتشار. توصيف شامل لهذه البروتينات يوفر معلومات غنية لاكتشاف العلامات البيولوجية، خلية من نوع تحديد الهوية، واختيار المستهدفة المخدرات، وكذلك المساعدة على تطوير فهمنا لعلم الأحياء الخلوي وعلم وظائف الأعضاء. البروتينات السطحية، ومع ذلك، تشكل تحديات كبيرة التحليلية، وذلك بسبب وفرة منخفضة بطبيعتها، للا مائية عالية، والتعديلات بعد متعدية الثقيلة. الاستفادة من ارتباط بالغليكوزيل انتشارا على سطح البروتينات، ونحن نقدم هنا نهج ببتيد سكري التقاط الإنتاجية العالية التي تدمج مزايا عدة N-glycoproteomics الوسائل المتاحة. يمكن أسلوبنا إثراء glycopeptides المستمدة من البروتينات السطحية وإزالة glycans من أجل البروتينات السطحية باستخدام LC-MS. تضم حلها N-glycoproteome على الوقود النووي المشعormation من هوية البروتين وكمية وكذلك مواقعهم من ارتباط بالغليكوزيل. وقد تم تطبيق هذا الأسلوب لسلسلة من الدراسات في المناطق بما في ذلك السرطان، والخلايا الجذعية، وسمية الدواء. الحد من الأسلوب يكمن في وفرة منخفضة من البروتينات الغشاء السطح، بحيث كمية كبيرة نسبيا من العينات المطلوبة لهذا التحليل مقارنة مع الدراسات التي تركز على البروتينات عصاري خلوي.

Introduction

بروتينات سطح الخلية تتفاعل مع البيئة خارج الخلية والتي ستحول الاشارات من الخارج إلى داخل الخلية. وبالتالي، هذه البروتينات، بما في ذلك البروتينات المصفوفة خارج الخلية، وتلعب أدوارا حاسمة في جميع جوانب البيولوجيا الخلوية وعلم وظائف الأعضاء بدءا من الانتشار والنمو، والهجرة، والتمايز إلى الشيخوخة وهكذا دواليك. البروتينات السطحية تعمل من خلال التفاعل مع الخلايا الأخرى، والبروتينات والجزيئات الصغيرة ^1-3. التوصيف الجزيئي للبروتينات سطح الخلية هي ذات أهمية كبيرة ليس فقط لعلماء الأحياء ولكن أيضا لشركات الأدوية، كما يتم استهداف أكثر من 60٪ من الأدوية لبروتينات سطح الخلية ^4.

جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS)، مع حساسيتها الفائقة والدقة والإنتاجية لتحديد البروتينات والببتيدات كانت، أداة قوية لدراسات البروتين ^5،6 العالمية. حتى الآن، والبروتينات السطحية تشكل تحديات كبيرة لالبروتيوميات يستند إلى MS-، ووتوجد معظم البروتينات السطحية بكميات منخفضة ومع التعديلات الثقيلة. المناطق التي تمتد غشاء من البروتينات السطحية جعلها مسعور؛ هذا هو الحال بالنسبة للبروتينات عبر الغشاء المتعددة الدخول على وجه الخصوص. بالتالي فمن الصعب حل بروتينات الغشاء في المحاليل المائية دون مساعدة من المنظفات؛ ولكن استخدام المنظفات يقمع عموما أداء HPLC وMS ^1،7،8 في تحديد البروتين. وبالتالي، بروتينات غشاء اتسمت ضعيفا في البروتينات المباشرة القائمة LC-MS.

ارتباط بالغليكوزيل هي واحدة من التعديلات بعد متعدية أهم وفيرة تجري في البروتينات على سطح الخلية ^9. التعقيد الهائل وعدم التجانس من glycans تعوق الببتيدات 'MS إشارة ^10. ومع ذلك، قد استخدمت عدة أساليب البروتين هذا التعديل فريدة من نوعها لإثراء البروتينات السطحية والأنصاف لإزالة السكر من البروتينات قبل تحليل LC-MS. هذه الطريقةو تشمل القائمة على كتين القبض على تقارب ¹¹ ومقرها حمض البوريك أو التقاط الكيميائية المستندة إلى هيدرازيد ¹² وكذلك فصل اللوني ماء ^8،13. إزالة glycans يحول البروتينات الغشاء إلى البروتينات العادية ويبسط توصيف MS بشكل كبير. بسبب ارتباط بالغليكوزيل أيضا يحدث في البروتينات يفرز التي لديها القابلية للذوبان عالية على النقيض من غشاء بروتينات، يتم تحسين العديد من الطرق لglycoproteomic البروتينات القابلة للذوبان، وتميل إلى أن تكون أقل الانتقائية ببتيد سكري وحساسية عندما يتم نشرهم في غشاء بروتينات ^8،14. توجد أساليب أخرى أيضا لإثراء، على وجه الخصوص، البروتينات على سطح الخلية، مثل تلك التي تستخدم تنبيذ فائق ¹⁵ واستراتيجيات التوسيم ^16. وقد أجريت مقارنة تفصيلية بين طريقتنا والأساليب القائمة الأخرى لوصف البروتينات الغشاء مؤخرا ^17، وأشارت النتائج إلى أن طريقة لدينا يمكن أن تؤدي بشكل جيد على قدم المساواة، إن لم يكنأفضل، من جميع الطرق البروتينات الغشاء مقارنة، ولكن مع ارتفاع البساطة.

للمساعدة في استخدام هذه الطريقة الباحثين، ونحن هنا بالتفصيل بروتوكول عام. هذا الأسلوب يدمج العديد من المزايا استراتيجيات glycoproteomics القائمة وضعت خصيصا للبروتينات سكرية الغشاء، إلا أن الأسلوب يعمل بشكل جيد على قدم المساواة للبروتينات يفرزها. خصائص هذا الأسلوب ما يلي: 1) الانحلالية كاملة من البروتينات الغشاء، 2) إثراء glycopeptides بدلا من بروتينات سكرية للقضاء على عائق الفراغية المحتملة عند استخدام اسر الركيزة الصلبة، 3) استخدام الكيمياء هيدرازيد لتكوين روابط تساهمية بين glycopeptides والركيزة اسر، مثل أن glycopeptides المستعبدين يمكن أن يتسامح يغسل صرامة لglycoselectivity عالية، و 4) القدرة على إجراء الإجراء التقاط بأكمله في أنبوب واحد لتخفيض فقدان العينة وتقصير مدة الإجراءات. بعد تنفيذ هذا الأسلوب لدراسة فاريإيتي من العينات البيولوجية بما في ذلك الخلايا والأنسجة، لاحظنا انتقائية عالية (> 90٪) لبروتينات سكرية ^8،17،18.

Protocol

1. حصاد الأغشية

1. إضافة ناقص التوتر العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 10 ملي بوكل، 1.5 ملي MgCl _2، ودرجة الحموضة 8.0) مع مثبط البروتياز كوكتيل على بيليه الخلية (~ 10 ⁸ خلايا) واحتضان لمدة 15-30 دقيقة على الجليد. ليز الخلايا عن طريق تمرير العينة عن طريق الإبر المحاقن (5-10 يمر) أو المجانسة على عينة من الخالط Dounce (15-30 السكتات الدماغية). استخدام عدادة الكريات وتلطيخ الأزرق التريبان للتحقق من كفاءة تحلل.
2. الحصول على جزء الميكروسومي قبل الطرد المركزي المغاير للالمحللة في 3،000 GX 15 دقيقة ثم على 100،000 GX 2 ساعة. الطرد المركزي الأول يحصل على بيليه الذي هو جزء النووية، والطرد المركزي لاحقة من طاف يولد بيليه الثاني، الذي هو جزء الميكروسومي الذي يحتوي على غشاء البلازما وكذلك غشاء محدد العضيات ^8. طاف الأخير هو جزء عصاري خلوي. تخزين الكسور الميكروسومي في الفريزر -80 درجة مئوية لمزيد من analysهو على النحو المبين أدناه.

2. حل، تفسد، ودايجست بروتينات الغشاء

1. حل جزء الميكروسومي في المخزن المؤقت تمسخ (40 ملي تريس، EDTA 10 ملي و 10 ملي TCEP، 0.5٪ Rapigest، ودرجة الحموضة 8) ثم احتضان الحل عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
2. تبريد حل تسخينها إلى درجة حرارة الغرفة، إضافة فائقة النقاء مسحوق اليوريا إلى حل ل8 M تركيز النهائي واحتضان العينة على 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. إضافة محلول المخزون iodoacetamide للعينة إلى 15 ملي تركيز النهائي، واحتضان الحل في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ليؤلكل على ثيول حرة في العينة. إضافة DTT الحل الأسهم إلى العينة إلى 10 ملي تركيز النهائي واحتضان الحل لمدة 10 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة لإرواء iodoacetamide المفرطة.
4. تمييع الحل تم الحصول عليها مع 10X 40 ملي تريس العازلة في درجة الحموضة 8، وبعد ذلك إضافة إلى التربسين العينة بنسبة 01:20 من trypsiن إلى البروتين الكلي. الحفاظ على رد فعل الهضم في ليلة وضحاها الفرن 37 درجة مئوية لضمان اكتمال التفاعل.
5. إنهاء عملية الهضم عن طريق المحمضة الحل عينة لدرجة الحموضة 1 مع حمض الهيدروكلوريك، وهو الشرط الذي يكسر أيضا أسفل المنظفات، أي Rapigest. تدهور Rapigest عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، وإزالة هطول ضعت بواسطة الطرد المركزي.
6. تنظيف طاف يحتوي على الببتيدات عينة من قبل C-18 استخراج المرحلة الصلبة (SPE) خرطوشة وتجفيف العينة التي حصلت عليها speedvac.
7. إجراء تحليل SDS-PAGE العينات قبل وبعد عملية الهضم التربسين لتأكيد كفاءة الهضم.

3. ببتيد سكري لقطة

1. حل الببتيدات تنظيفها في المخزن المؤقت اقتران (100 ملي خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.5). إضافة بريودات الصوديوم في حل الببتيد في 10 ملي تركيز النهائي لمدة 30 دقيقة في الظلام، في درجة حرارة الغرفة. وهذا أكسدة المجموعات رابطة الدول المستقلة ديول في glycans إلى الألدهيدات، والتي تسمح للglycans لزوجين إلى الراتنج من خلال الكيمياء هيدرازيد. إخماد بريودات المفرطة من جانب سلفيت الصوديوم في 20 ملي تركيز النهائي ودرجة الحموضة 5 لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
2. أعرض الراتنج derivatized هيدرازيد في حل الببتيد في نسبة 1:4 (الراتنج إلى الحل) لglycopeptides الزوجين إلى الراتنج. احتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام مع نهاية إلى نهاية الدوران للاقتران كاملة.
3. إزالة الببتيدات غير منضم عن طريق الغسيل الراتنج مرتين مع 1 مل من كل من العناصر التالية: الماء DI، 1.5 M كلوريد الصوديوم، و 80٪ الميثانول أسيتونتريل. أخيرا، وغسل 3X الراتنج مع 1 مل من 100 ملي NH ₄ HCO ₃ في الرقم الهيدروجيني 8 لتبادل المخزن المؤقت للنظام ل100 ملي NH ₄ HCO _3.
   1. جمع طاف ويغسل لتحليل الببتيدات غير منضم (اختياري).
4. الافراج عن N-glycopeptides من الراتنج التي كتبها PNGase F في الحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية معن نهاية إلى نهاية الدوران. جمع الببتيدات سراح بواسطة الطرد المركزي وغسل أسيتونتريل 80٪. تجف الحل التي تم الحصول عليها في speedvac لتحليل LC-MS.

4. مزيد من التقطير (اختياري)

لمزيد من تبسيط التعقيد العينة، يجزئ في الحصول على N-glycopeptides. على سبيل المثال، تنحل الببتيدات المجففة إلى 10 ملي فورمات الأمونيا، ودرجة الحموضة 3 مع 20٪ أسيتونتريل واستخدام تبادل الأيونات الموجبة قوية (SCX) اللوني ليجزئ الببتيدات. تجفيف شاطف الحصول عليها، ومن ثم تحليل الكسور الببتيد التي حصل عليها عكس المرحلة LC-MS ^8،17،18.

5 تنظيف من الاصدار N-glycopeptides (اختياري)

إذا ارتفعت المخاوف بشأن التلوث المحتمل من الببتيدات، تنحل الببتيدات المجففة إلى حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ واستخدام عمود MCX SPE لمزيد من تنظيف الببتيدات قبل العكسية مرحلة التحليل LC-MS.

ملاحظة: معلمات البحث في قاعدة البيانات.

خلال الانقسام الانتقائي للN-glycopeptides قبالة الراتنج، PNGase F تحويل أسباراجين-N غليكان مرتبطة حمض الأسبارتيك. وبالتالي، هناك 0.9840 دا التحول الشامل للالمحررة N-glycopeptides. لتحديد بدقة هذه الببتيدات، يحتاج هذا التعديل إلى أن تضاف إلى معلمات البحث جنبا إلى جنب مع تعديلات مشتركة مثل carbamidomethylation من السيستين والميثيونين أكسدة.

النتائج

وتتلخص مخطط تدفق ممثل الإجراء التجريبي في الشكل 1. وسم ومزيد من الخطوات تجزئة اختيارية ويتم وصفها من التفاصيل في منشور صدر مؤخرا ^18. خيار آخر هو تحليل الببتيدات غير معدلة، والتي لا تتفاعل مع الراتنج. وتشمل مزايا تحليل الببتيدات معدلة تحديد إمكانات الببت...

Discussion

ونحن هنا نقدم استراتيجية ببتيد سكري التقاط لالتنميط بروتينات سطح الخلية. طريقة يمكن تطبيقها على دراسة بروتينات يفرزها، مثل تلك الموجودة في الدم، وكذلك في سوائل الجسم الأخرى أو في الخلية سائل الإعلام والثقافة.

نجاح الأسلوب يعتمد...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Iodoacetamide	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Sodium periodate	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Hz hydrazide gel	Bio-Rad	153-6047
Trypsin	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak C-18 cartridge	Waters	WAT054955
Oasis MCX cartridge	Waters	186000252
Protease inhibitor coctail	Sigma	P8340
Urea	Amersco	568
Sodium sulphite	Caledon	8360-1
Invertase	Sigma	I0408
α-1 trypsin	Sigma	F2006
Ribonulease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovalbumin	Sigma	A5503
Conalbumin	Sigma	C0755