الليزر التي يسببها انهيار الطيفي: نهج جديد لرسم الخرائط جسيمات متناهية الصغر والكمي في الجهاز الأنسجة

Summary

الليزر التي يسببها انهيار الطيفي التي أجريت على الجهاز رقيقة وأنسجة الورم بنجاح الكشف عن العناصر الطبيعية وحقن الجادولينيوم مصطنع (ش ج)، صدر من مقرها النانوية ش ج. وصلت الصور من العناصر الكيميائية قرار من 100 ميكرون والكمية حساسية الفرعية ملي. توافق الإعداد مع المجهر الضوئي القياسية ويؤكد قدرته على تقديم صور متعددة من نفس الأنسجة البيولوجية.

Abstract

تم تطبيق التحليل الطيفي الانبعاثات من البلازما التي يسببها الليزر لتحليل العناصر من العينات البيولوجية. الليزر التي يسببها انهيار الطيفي (LIBS) التي أجريت على أقسام رقيقة من الأنسجة القوارض: الكلى والأورام، يسمح للكشف عن عناصر غير عضوية مثل (ط) نا، الكالسيوم، النحاس، والمغنيسيوم والفوسفور، والحديد، موجودة بشكل طبيعي في الجسم و (ب) سي وكلمة المدير العام، الكشف عن بعد حقن جزيئات الجادولينيوم القائم. الموت الرحيم كانت الحيوانات 1-24 ساعة بعد الحقن في الوريد من الجسيمات. تفحص ثنائي الأبعاد من العينة، التي أجريت باستخدام المصغر مرحلة 3D بمحرك، سمحت شعاع ليزر الأشعة تحت الحمراء استكشاف السطح مع قرار الجانبية أقل من 100 μ م. تم الحصول على الصور العنصر الكيميائي والكمي كلمة المدير العام داخل الجهاز مع حساسية الفرعية ملي. يقدم LIBS طريقة بسيطة وقوية لدراسة توزيع المواد غير العضوية دون أي labeli محددةنانوغرام. وعلاوة على ذلك، وتوافق الإعداد مع المجهر الضوئي القياسية ويؤكد قدرته على تقديم صور متعددة من الأنسجة البيولوجية نفسه مع أنواع مختلفة من الاستجابة: عنصري، الجزيئية أو الخلوية.

Introduction

وحث تطوير واسعة من التطبيقات البيولوجية النانوية لتحسين موازية من التقنيات التحليلية لتحديد قيمتها والتصوير في العينات البيولوجية. عادة ما تكون مصنوعة الكشف ورسم الخرائط من الجسيمات النانوية في الأجهزة عن طريق مضان المجهري متحد البؤر أو. للأسف هذه الأساليب تتطلب وضع العلامات من الجسيمات النانوية عن طريق صبغة الأشعة تحت الحمراء القريبة التي يمكن تعديل biodistribution من الجسيمات النانوية، وخاصة بالنسبة للجزيئات صغيرة جدا وذلك بسبب خصائصه مسعور. الكشف عن الجسيمات النانوية المسمى، وخصوصا جزيئات صغيرة جدا (حجم <10 نانومتر)، وبالتالي قد تتداخل مع biodistribution بهم على نطاق الجسم كله ولكن أيضا على الصعيدين الأنسجة والخلايا. تطوير أجهزة جديدة قادرة على الكشف عن الجسيمات النانوية دون أي وسم يقدم إمكانيات جديدة لدراسة سلوكهم وحركية. وعلاوة على ذلك، فإن دور العناصر النزرة مثل الحديد والنحاس في الدماغ والأمراض لوالأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر د ^1، مينكس ^2،3، أو ⁴ ويلسون توحي الفائدة لدراسة وحصر هذه العناصر في الأنسجة.

وقد استخدمت تقنيات مختلفة لتوفير الخرائط عنصري أو التحليل الدقيق من مواد مختلفة. في ورقة استعراضها نشرت في عام 2006، R. Lobinski وآخرون. تقديم لمحة عامة عن التقنيات القياسية المتوفرة عن التحليل الدقيق عنصري في البيئة البيولوجية، واحدة من أكثر البيئات تحديا للعلوم التحليلية ^5. ومسبار مجهري الإلكترون، الذي يتكون من الطاقة التشتت التحليل الدقيق للأشعة السينية في المجهر الإلكتروني النافذ، يمكن تطبيقها على العديد من الدراسات إذا كان تركيز عنصر غير كافية (> 100-1،000 ميكروغرام / غرام). لتصل إلى أقل حدود الكشف، وقد استخدمت الأساليب التالية:

• شعاع ايون مجهري باستخدام الجسيمات الناجمة عن الأشعة السينية الانبعاثات μ-عنصورة (1-10 ميكروغرام / غرام) ⁶
• SYNchrotron التحليل الدقيق الإشعاع μ-SXRF (0.1-1 ميكروغرام / غرام) ⁷
• SIMS الثانوية مطياف الكتلة ايون (0.1 ميكروغرام / غرام) ⁸
• التذرية الليزر بالحث مطياف الكتلة ICP-LA-MS (وصولا الى 0.01 ميكروغرام / غرام) ^9،10

توفير التقنيات المذكورة أعلاه القرار المصغر كما هو مبين في الجدول رقم 1 المستخرجة من Lobinski وآخرون.

ويمكن أيضا أن تقترح إعادة الإعمار 3D التحقيقات 2D المسلسل لإعادة بناء الأنسجة العميقة ^11. ومع ذلك، وجميع الأجهزة والأنظمة تتطلب كل من المهنيين المؤهلين، معتدلة الى معدات باهظة الثمن للغاية وتجارب طويلة الأمد (عادة أكثر من 4 ساعات للحصول على 100 ميكرون × 100 ميكرون لμ-SXRF و 10 ملم × 10 ملم لLA-ICP-MS ) ^12. تماما، هذه المتطلبات تجعل التحليل المجهري عنصري تقييد جدا ومتوافق مع أنظمة التصوير الضوئي التقليدية،المجهر مضان أو غير الخطية المجهري. نقطة أخرى أننا يمكن أن نذكر هنا هو أن القدرة على القياس الكمي لا يزال محدودا للغاية، ويعتمد على توفر معايير المختبر مطابقة مصفوفة. فإن التعميم مزيد من استخدام التحليل المجهري عنصري في عمليات الصناعة والجيولوجيا والبيولوجيا وغيرها من المجالات من تطبيقات توليد اختراقات المفاهيمية وتكنولوجية كبيرة.

الغرض من هذا المخطوط هو اقتراح حلول لرسم الخرائط عنصري الكمي (أو التحليل الدقيق عنصري) في الأنسجة البيولوجية مع الأجهزة المكتبية متوافقة تماما مع المجهر الضوئي التقليدية. ويستند نهجنا على انهيار الطيفي المستحث بالليزر (LIBS التكنولوجيا). في LIBS، وتركز نبضة ليزر على عينة من الفائدة لخلق انهيار والشرارة للمادة. يتم تحليل الإشعاع الذري المنبعث في البلازما في وقت لاحق من قبل مطياف وelemenويمكن استرجاع تركيزات التل مع معايرة أداء مسبقا ^13،14. وتشمل مزايا LIBS حساسية (ميكروغرام / غرام تقريبا لجميع العناصر)، الاكتناز، وإعداد العينات الأساسية جدا، وعدم وجود اتصال مع العينة، استجابة فورية وموضعية على وجه التحديد (الصغرى) تحليل السطح. ومع ذلك، فإن تطبيق التصوير كيميائية في أنسجة يبقى تحديا منذ التذرية الليزر من الأنسجة يجب أن يسيطر على أداء ناعما خرائط لقرار مكانية عالية جنبا إلى جنب مع حساسية في ميكروغرام / g نطاق ^15،16.

مع مثل هذا الحل، ليست هناك حاجة لتجاور من استشفاف أو وكلاء وضع العلامات، والذي يسمح الكشف عن العناصر غير العضوية مباشرة في بيئتها الأصلية في الأنسجة البيولوجية. الصك LIBS ضعت في مختبرنا يقدم القرار الحالي أقل من 100 ميكرون مع حساسية المقدرة لكلمة المدير العام أقل من 35 ميكروغرام / غرام، أي ما يعادل 0.1 ملي ^16، والذي يسمحرسم خرائط لعينات كبيرة (> 1 سم ²⁾ في غضون 30 دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، برامج محلية الصنع يسهل اقتناء واستغلال البيانات. يتم استخدام هذه الأداة للكشف عن، الخريطة، وتحديد توزيع الأنسجة من الجادولينيوم النانوية (ش ج) المستندة إلى ^17-18 في الكلى وعينات الورم من الحيوانات الصغيرة، من 1 إلى 24 ساعة بعد الحقن في الوريد من الجسيمات (حجم <5 نانومتر) . العناصر غير العضوية، والتي ترد في جوهرها في الأنسجة البيولوجية، مثل الحديد، الكالسيوم، الصوديوم، و ف، كما تم الكشف عن وتصويرها.

Protocol

1. إعداد نموذج البيولوجي

تمت الموافقة على جميع التجارب الموضحة في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام لCECCAPP (ليون، فرنسا) (إذن LYONSUD_2012_004 #)، وأجريت التجارب تحت إشراف الأفراد المصرح لهم (L. Sancey، DDPP إذن # 38 05 32).

1. إضافة 1 مل من H ₂ O إلى 100 ​​ميكرومول النانوية المستندة إلى الجادولينيوم (ش ج)، وانتظر 15 دقيقة، وإضافة 20 ميكرولتر من HEPES 50 ملي، كلوريد الصوديوم 1.325 M، و CaCl ₂ 20 ملي إلى 100 ​​ميكرولتر من H ₂ O و 80 ميكرولتر من الحل الأساسي للالنانوية يستند GD-للحصول على حل 200 ميكرولتر في 40 ملي جاهزة للحقن (المدينة: فيلوربان، في المختبر).
2. حقن جزيئات حل يستند GD-200 ميكرولتر عن طريق الوريد إلى تخدير القوارض الحاملة للورم (المدينة: ليون سود (Oullins)، على بعد 15 كم من المختبر).
3. 1-24 ساعة بعد الحقن، والتضحية الفئران ود وضع العينات البيولوجية في نظير البنتان تبريده بواسطة النيتروجين السائل. تخزين العينات في - 80 ° C (المدينة: ليون سود (Oullins)، على بعد 15 كم من المختبر).
4. شريحة العينة (المدينة: عادة غرونوبل، و 100 كم من المختبر؛ سأحاول أن يكون لها وصول ليون في الجنوب) في 100 ميكرون سميكة شرائح ووضع الشرائح البيولوجية على أطباق بلاستيكية معينة (طبق بيتري). المحل في -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: الأطباق البلاستيكية هي في الأساس عينة البوليمر نقية جدا. يتم استخدامها لتجنب التداخل مع العناصر الواردة في الأنسجة.

2. إعداد نموذج للمعايرة

1. إعداد قارورة مع زيادة جرعة من جسيمات متناهية الصغر استنادا GD-في الماء (0 نانومتر، 100 نانومتر، 500 نانومتر، 1 ميكرومتر، ميكرومتر 5، 10 ميكرومتر، ميكرومتر 50، و 100 ميكرومتر، 500 ميكرومتر، 1 ملم، و 5 ملم).
2. وضع ميكرولتر الإفلات 5 من كل حل متباعدة بصورة منتظمة من قبل 3 ملم على طبق بيتري.
3. الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

3. LIBS التجربة

1. تهيئة الإعداد LIBS
   1. إعدادات الليزر. بعد التبديل على الصكوك، انتظر 10-20 دقيقة لتحقيق الاستقرار الطاقة نبضة ليزر وتهدئة للكاميرا ICCD إلى -20 درجة مئوية. ضبط الطاقة النبض مع المخفف.
      ملاحظة: المعلمات الليزر الأمثل لأنسجة رسم الخرائط هي 5 NSEC مدة النبضة، 1،064 نانومتر الطول الموجي، والطاقة نبض حوالي 4 ميغا جول. الليزر يستخدم هو بدون تاريخ النموذجية: YAG الليزر نانوثانية.
   2. LIBS إعدادات. تعيين موضع التركيز ليزر (مع الاحترام لسطح العينة) للحصول على فوهة قطرها أصغر (حوالي 50 ميكرون أو أقل).
      ملاحظة: هذا يناظر تبؤر نبضة ليزر 100 ميكرومتر تحت سطح العينة.
   3. إعدادات مطياف. استخدام مطياف تشيرني تيرنر جنبا إلى جنب مع 1،200 خطوط / مم صريف والزمانية كاميرا عالية الدقة ICCD. السيطرة على جميع هذه الأجهزة عن طريق الكمبيوتر. تعيين قيمة فتحة المدخلات إلى 40 ميكرون. إعادة تعيين نطاق الطيفيصة عنصر ليتم تحليلها. استخدام النطاق الطيفي تغطي 325-355 نانومتر لكشف كلمة المدير العام مع حساسية عالية، وكذلك نا، والنحاس والكالسيوم. تعيين المعلمات ICCD مع تأخير ل300 NSEC، بوابة من 2 μsec، ومكسب من 200.
2. قياس رسم الخرائط
   1. وضع عينة بيولوجية على صاحب العينة LIBS آلية.
   2. ضبط ارتفاع العينة وفقا للموقف تركيز الليزر.
   3. اتخاذ عالية الدقة صورة للشريحة العينة.
   4. تعيين وحدة رسم الخرائط من برنامج الحصول على LIBS لتنفيذ خريطة مع عادة 100 × 100 نقطة القياس متباعدة بقرار من حوالي 100 ميكرون.
   5. بدء عملية الاستحواذ. من هذه النقطة أتمتة كل شيء؛ المتحرك تسلسل فضلا عن تسجيل الطيف والادخار. ويلزم 40 دقيقة للتعيين من 10،000 نقطة (أي ما يعادل 1 سم ² للقرار 100 ميكرون). إعادة تجميع كل أطياف سجلت في ملف واحد.
   6. عندما وinished، التقاط صورة الثاني من شريحة عينة
3. قياس المعايرة

مع نفس المعلمات التجريبية، وقياس عينات المعايرة (للحصول على تفاصيل إعداد، انظر القسم 2). تنفيذ خريطة أو سجل 25 الأطياف (تم الحصول عليها من مواقع القياس في مركز من جانب انخفاض) في كل من قطرات المعايرة.

4 LIBS تحليل الطيف: انشاء الصور الكيميائية

1. سجل كل أطياف LIBS من تعيين الأنسجة وتحميلها في تحليل البرامج LIBS. طرح خط الأساس لكل الطيف وبناء الصور الكيميائية مع مقياس الكثافة النسبية باستخدام لون كاذبة.
   ملاحظة: خوارزمية باسترداد شدة سطر معين، مثل كلمة المدير العام، النحاس، الصوديوم، الكالسيوم أو.
2. تنفيذ نفس العملية على قياس الأطياف من عينة معايرة للسماح حساب منحنيات المعايرة (العلاقة بين كثافة وتركيز) وبناء عبد القديرخريطة uantitative أو صورة لكلمة المدير العام (أو عنصر آخر من الفائدة).
3. تطبيق العلاج الكافي للصور الكيميائية، مثل الاستيفاء أو تمهيد. حفظ شدة أو تركيز الخرائط في شكل صورة (صورة نقطية).

النتائج

كما هو مبين في الشكل 1، وشعاع من الثانية: YAG الليزر وتركز في الطول الموجي الأساسية لل1،064 نانومتر رأسيا لأسفل على شريحة الأنسجة بواسطة عدسة الكوارتز 50 مم المسافة البؤرية. كان نبض الطاقة 4 ميغا جول هرتز ومعدل الرسوب 10. من أجل تجنب توليد البلازما في الهواء، وتركز ...

Discussion

تطبيقها على عينة بيولوجية، وهذا الأسلوب يسمح التصوير الكيميائية، أي التعيين والتحديد الكمي، من كلمة المدير العام وسي من حقن جزيئات مقرها كلمة المدير العام في الأجهزة المختلفة. من إعدادات الحرجة الرئيسية، والسيطرة على خصائص الليزر (الطول الموجي والطاقة النبض، ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser nanosecond Nd:YAG	Quantel	Brillant	5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm
Spectrometer	Andor Technology	Shamrock 303	with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating
Detector ICCD	Andor Technology	Istar	2 nsec temporal resolution
LIBS Unit	ILM		Homemade Instrumentation
Gd-based nanoparticles	Nano-H		particles
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	for particle's dilution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21108	for particle's dilution
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	for particle's dilution
Mice	Charles River	depending of animal breeding
Isoflurane	Coveto / Virbac		for anaesthesia - Isofluranum
Isopentane	Sigma-Aldrich	59060	to froze the sample  slowly
Liquid nitrogen	Air Liquide		to cool down the isopentane
Cryostat	Leica	CM-3050S	to slide the samples
Petri dishes	Dutscher	353004	to stick the sample