وسم الخلية وحقن في تطوير الجنينية الماوس قلوب

Summary

نحن تصف سلسلة من الطرق لحقن الأصباغ وناقلات الحمض النووي، والفيروسات، والخلايا من أجل رصد كل من مصير الخلية والنمط الظاهري من الخلايا الذاتية والمطعمة المشتقة من الخلايا الجنينية أو المحفزة داخل أجنة الفئران في اليوم الجنينية (E) 9.5 و مراحل لاحقة التنمية.

Abstract

اختبار مصير الجنينية أو الجذعية المحفزة الخلايا في المختبر المشتقات في بروتوكولات أدى إلى نتائج مثيرة للجدل والتي لا تعكس بالضرورة في الجسم الحي المحتملة. ويفضل، ينبغي أن توضع هذه الخلايا الجنينية في بيئة سليمة من أجل الحصول على النمط الظاهري محددة. وعلاوة على ذلك، ظلت نسب خلية تتبع الدراسات في الماوس بعد وضع العلامات الخلايا مع الأصباغ أو ناقلات فيروسات محدودة معظمها إلى أوائل أجنة الفئران المرحلة مع أجهزة تزال ضعيفة. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتصميم بروتوكولات القياسية وحقن مكروي بوساطة الموجات فوق الصوتية لحقن عوامل مختلفة في المناطق المستهدفة من القلب في أجنة فئران في مراحل لاحقة E9.5 والتنمية. يزدرع الجنينية أو الأجنة ثم مثقف أو اليسار لمزيد من التطور في الرحم. وتشمل هذه العوامل الأصباغ الفلورية، فيروس، shRNAs، أو الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الاصلية. نهجنا يسمح الحفاظ على فوnction للجهاز في حين رصد الهجرة ومصير الخلايا المسمى و / أو حقن. هذه التقنيات يمكن أن تمتد إلى الأجهزة الأخرى، وسوف تكون مفيدة جدا لمعالجة المسائل الرئيسية في علم الأحياء البيولوجية للتنمية.

Introduction

منذ أكثر من عقد من الزمان، والخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HuESCs) قد استمدت من مثانات بلاستولية الإنسان ^1. منذ ذلك الحين، أصبحت هذه الخلايا موضوع حقل مهم من الأبحاث التي تتناول المسائل التي لم تتم تلبيتها في البيولوجيا التطورية الإنسان. وقد وفرت HuESCs علاوة على ذلك الآمال في الطب التجديدي. في السنوات الأخيرة، تم إنشاؤها الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (iPSCs) من الخلايا الجسدية المريض محددة، وتوفير نماذج من مرض وراثي ^2. العديد من البروتوكولات في المختبر لتمايز الخلايا الجنينية الجذعية المحفزة أو المستحثة نحو مختلف الأنساب الخلية، بما في ذلك القلب الأنساب ^3، تم الإبلاغ عنها. وغالبا ما phenotyped خلايا متمايزة عن طريق تحليل الحمض النووي الريبي والبروتينات التعبير، المناعية، و / أو في اختبارات الوظائف المختبر. ومع ذلك، المحفزة مشتقات الخلايا الجذعية يجب أن توضع في بيئة الجنينية المناسبة من أجل اختبار ما إذا يكتسبون تماما سلل مصير نظيرتها الجنينية وما إذا كانت ألخص في الجسم الحي وظيفة حقيقية في استجابة لمنبهات الإقليمية. بينما هندسة الأنسجة واعدة، فإنه لا يوفر بعد كل الاشارات المعروفة وغير المعروفة من السليم في الجسم الحي الأنسجة الجنينية النامية ^4،5.

وسم الخلية مع الأصباغ أو ناقلات فيروسات في الأجنة، بما في ذلك أجنة الفئران، جلبت معلومات هامة فيما يتعلق بمنشأ الجنينية الأنساب الخلية أثناء التطور القلب ^6. على سبيل المثال، صبغ الحقن في الفضاء التامور من أجنة الفئران فيفو السابقين، تليها الثقافة في المختبر من قلوب معزولة، وكان يستخدم لتسمية الخلايا النخابية وذريتهم ^7. ومع ذلك، صبغ ووسم الخلية فيروسات طبقت معظمها لأجنة الفئران في وقت مبكر مع أجهزة تزال ضعيفة، أو أجنة الدجاج، والتي هي أكثر يمكن الوصول إليها بسهولة ^8. استثناء هو الدماغ، وهو أسهل لاستهداف في البريدmbryos ^9،10. لم يتم حتى الآن تطبيق هذا النهج لضرب قلب الجنينية الماوس.

لاستكمال وضع العلامات مباشرة مع الأصباغ أو الفيروس وإجراء النسب التتبع في أكثر تقدما أجنة الفئران والجرذان مرحلة الكبار، وقد تم الجمع بين نهج وضع العلامات الخلية مع تحليل الفئران المعدلة وراثيا باستخدام التكنولوجيا لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن. إلا أن نهج لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن ¹¹ ملامح بعض القيود بسبب خصوصية الزمانية المكانية للمناطق التنظيمية الجيني يستخدم لدفع التعبير عن recombinase، وكفاءة إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية / لوكس ^12. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج لا يعالج تماما الأسئلة محددة من الخلايا اقتناء يحركها هجرة مصير الخلية كما يمكن تسمية فقط السلائف بعد تفعيل المنطقة التنظيمية المستخدمة لدفع لجنة المساواة العرقية التعبير. فإنه أيضا لا يمكن أن تنطبق على الأجنة البشرية من أجل قضايا أخلاقية واضحة.

ونظرا لهذه القيود، قمنا بتصميم سلسلة من ع جديدةrotocols لحقن مجموعة متنوعة من وكلاء وسم الخلية مثل الأصباغ الفلورية، فيروس، جهري التعبير الجيني مثل shRNAs وناقلات توسيم الخلايا المعتمدة على الحمض النووي، أو الخلايا في الجنين الماوس في E9.5 ومراحل لاحقة من التنمية في المناطق المستهدفة من القلب.

حقن الحمض النووي / خلية استخدام stereomicroscope وجهاز حقن مكروي بسيطة جنبا إلى جنب مع فيفو السابقين الثقافة الجنين تصل إلى 48 ساعة، أو القلب معزولة أو الثقافة يزدرع الجنينية ل48-72 ساعة. نحن أيضا تقريرا بروتوكول حقن مكروي بوساطة الموجات فوق الصوتية في قلوب الماوس الجنينية في الرحم، وهذا الأسلوب يسمح رصد تطور الأجنة ¹³ ويسمح على المدى الطويل متابعة من injectates و / أو الخلايا المسمى.

وجدنا أن هذه المناهج الحفاظ على وظيفة الجهاز وتوفير بيئة أكثر من ممثل في المختبر اختبار إمكانات الخلايا الجذعية. كما يوفر الفرصة لمتابعة الهجرةمن وصفت و / أو حقن خلايا لرصد مصيرهم. في نهاية المطاف، وهذا ينبغي أن تسفر عن فهم أفضل للتنميط الأنسجة الإقليمية والعمليات البيولوجية الرئيسية.

Protocol

1. إعداد

إجراءات الحيوان

الحصول على موافقة من لجنة أخلاقية الحيوانية واتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية للعمل مع الفيروس، HuESC و / أو التوجيهية (عند الاقتضاء)، وكذلك التعامل مع الماوس، والحصول على أجنة الفئران، وإجراء العمليات الجراحية الماوس. لتوقيت التزاوج، وتعتبر اليوم من المكونات اليوم الجنينية (E) 0.5 / 0.5 أيام تال للجماع.

1. الإبر حقن مكروي:
   لالسابقين الرحم حقن مكروي، وسحب الماصات الزجاج (1.2 ملم أنابيب قطرها الخارجي البورسليكات الشعرية) باستخدام مجتذب ماصة / beveller للحصول على 1 أو 10 ميكرون قطر الحافة الداخلية وحادة ومخروطي الشكل تلميح لحقن الحمض النووي أو الخلايا، على التوالي. لحقن بوساطة الموجات فوق الصوتية، واستخدام الإبر المعقمة المخصصة، والتي يبلغ قطرها الخارجي / الداخلي (OD / ID) من 1.14 مم mm/0.53، مع تلميح 50/35 ميكرون OD / ID.
2. السيليكون مملوءة أطباق بتري:
   إعداد السيليكون كما هو موضح في الدليل. شغلطبق بتري زجاجي نظيف 60 مم مع طبقة من المطاط الصناعي ~ 1 سم. تجنب فقاعات الهواء.
3. الأدوات:
   إبقاء جميع الأدوات الجراحية المعقمة قبل وأثناء العملية.
4. إعداد الحمض النووي:
   إضافة 3 ميكروغرام DNA و 12 ميكرولتر غروب MEM في أنبوب واحد. إضافة 3 ميكرولتر Lipofectamine 2000 و 12 ميكرولتر غروب MEM في أنبوب آخر. احتضان لمدة 5 دقائق على RT وتخلط كل من الحلول. استخدامها على الفور.
5. إعداد الخلايا:
   إعداد تعليق 10 ⁶ خلية / مل DMEM (Dulbecco والنسر متوسطة، ارتفاع نسبة الجلوكوز و 50٪ مصل الفئران). 50 ميكرولتر من تعليق خلية النهائية يكفي لمدة 8-10 الأجنة.
6. صبغ إعداد:
   استخدام الفلورية الخضراء CDCFDA-SE بنسبة 25 ملغ / مل DMSO. إعداد 20 ميكرولتر مأخوذة وتخزينها في -20 درجة مئوية. تمييع 1:100 / 1:200 في ملحي معقم أو برنامج تلفزيوني قبل الاستخدام.
7. إعداد الفيروس:
   استخدام الجيل ^الثالث 3-PGK التجارية، معربا عن GFP الفيروسة البطيئة مع عيار ⁹ ~ 10 -10 ¹⁰ هيئة تنظيم الاتصالاتnsducing وحدة / مل DMEM. لإعداد الفيروسة البطيئة، انظر Tiscornia وآخرون ¹⁴ ارتداء معدات الوقاية الشخصية واستخدام بأمان والتخلص من الفيروس.

2. جمع E9.5 E10.5 الأجنة وللخارج الحي حقن

1. الموت ببطء ماوس حاملا في اليوم الجنينية 9.5 أو 10.5.
2. تعقيم الصدر والبطن من الفأر مع الايثانول 70٪.
3. جعل شق خط الوسط بطني لفتح البطن واسترداد قرن الرحم في RT في برنامج تلفزيوني وتحويلها بعد سنتين يغسل PBS إلى طبق بتري مليئة سيليكون مع M16 المتوسط.
4. دبوس قرن الرحم مع دبابيس الحشرات إلى طبقة السيليكون بحيث الجانب أوعية دموية الرحم في الجزء السفلي.
5. قطع سطح الرحم مع ملقط غرامة، وقبعة من الساقط في 1 ملم تحت سطح الأرض.
6. بلطف استرداد الجنين في الكيس المحي من خلال نشر خارج جدران الساقط.
7. تخزين الأجنة عند 37 درجة؛ مئوية في المتوسط ​​M16 قبل حقن الخلايا. للحقن، يتم نقل كل جنين إلى الطبق سيليكون مليئة M16 المتوسطة في مرحلة ما قبل حرارة 37 درجة مئوية.

3. الحمض النووي أو حقن الخلايا تحت Stereomicroscope

1. ملء ماصة الزجاج من الخلف مع حقنة هاميلتون وتهز ماصة لإزالة فقاعات في الطرف.
2. تعيين ماصة على حامل حقن مكروي؛ ضبط ضغط عقد إلى 50 (DNA) أو 30 (خلايا) HPA، وضغط الحقن إلى 150 (DNA) إلى 300 (خلايا) HPA. ضبط الوقت الحقن إلى 0.2 ثانية (DNA) أو 0.5 ثانية (الخلايا). قد تختلف هذه الإعدادات قليلا وفقا لنوع microinjector وماصة.
3. دبوس الجنين إلى أسفل سيليكون من خلال الكيس المحي دون لمس الجنين السليم. مشاهدة منطقة القلب وفتح الكيس فقط فوق هذه المنطقة.
4. إضافة 4 دبابيس حول الجنين لمنع أي حركة أثناء حقن الخلايا.
5. باستخدام مياداة مجهرية (تعيين إلى دليل)، ببموقف ذ غيض ماصة في زاوية من 45 درجة فوق التأمور، وذلك فوق منطقة القلب التي سيتم حقن (الشكل 1).
6. نقل ماصة في المنطقة من اهتمام ويؤدي الحقن. إخراج ماصة في أسرع وقت ممكن. تأكد من أن القلب ينبض بشكل صحيح بعد حقن الحمض النووي / خلية.

4. الأجنة، القلب معزولة، ويزدرع الثقافة

1. ثقافة الأجنة E9.5 في 25٪ M2 المتوسطة و 75٪ مصل الفئران، على أن تستكمل مع البنسلين / الستربتوميسين، قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية والاوكسيجين مع 40٪ O _2.
2. إضافة 2 مل مستنبت في أنبوب زجاجي 25 مل، إضافة بلطف الجنين، والأوكسجين مع 40٪ O ₂ قبل الشد الغطاء على أنبوب. احتضان تصل إلى 36 ساعة عند 37 درجة مئوية في حين تناوب أو الهز (30 تناوب / دقيقة).
3. في نقطة الوقت المطلوب (على سبيل المثال 24 ساعة)، تشريح قلوب بعناية مع ملقط غرامة، دون لمس قلوب، من خلال أول ديcapitating الأجنة؛ قلب من السهل أن المكوس عن طريق سحبها خارج باستخدام تدفق المسالك البعيدة.
4. الثقافة قلب معزولة لساعة أخرى 36-48 في DMEM مع FCS 50٪ على إدراج Matrigel المغلفة مجموعة في 12 لوحة جيدا. انظر داير وباترسون (2013) لبروتوكول تحسين الثقافة القلب ^15.
5. جعل أي ازدراع المنطقة من الفائدة. كمثال على ذلك، تشريح القناة الأذين البطين (AVC) والثقافة لمدة 48 ساعة على نوع الكولاجين 1 هلام ^16.

5. حقن الموجات فوق الصوتية الموجهة في القلب أنا ن الرحم

1. الإعداد من جهاز الموجات فوق الصوتية وmicroinjector:
   1. استخدام نظام الموجات فوق الصوتية عالية الدقة مع محول 40 ميغاهيرتز والإعداد حقن مكروي على السكك الحديدية.
   2. تعيين حجم الحقن على microinjector في 69 NL في الحقن. راجع كتيب حقن مكروي الشركة المصنعة لبرمجة microinjector.
2. إعداد microiالإعداد njection وحقن:
   1. وضع micropipette الزجاج في microinjector. لضمان كفاءة الحقن، ومعطف الأولى الجانب الداخلي من ماصة مع الزيوت المعدنية بواسطة الشفط يصل إلى أقصى حجم. ثم إخراج النفط مرة أخرى، وترك 1-2 ملم من النفط داخل إبرة.
   2. نضح injectate حتى يتم التوصل إلى الحد الأقصى لحجم. يجب الحرص على عدم لمس أي الأسطح مع طرف الإبرة لأن هذا سوف تخفف من حدة غيض وجعل حقن أكثر صعوبة.
   3. لتحقيق الاستقرار في قرن الرحم الذي يحتوي على الأجنة خلال الحقن، واستخدام طبق بتري تعديل مع وجود ثقب في منتصف (2.5 سم القطر)، عن طريق غشاء السيليكون رقيقة مع شق صغير في وسط قطع تغطيتها، ووضعه فوق موقع شق . تحقيق الاستقرار في طبق بيتري على الطاولة التعامل مع الماوس عن طريق وضع كتل من الطين 3-4 تحت حواف الطبق.
3. إجراء الحقن:
   1. حلق البطن من ماوس الحوامل (في المرحلة الجنينية المطلوب) قبل تخديرسيا لإزالة الشعر. علاج البطن مع وكيل إزالة الشعر الكيميائية لإزالة الشعر المتبقي وتعقيم مع الايثانول 70٪.
   2. تخدير ماوس الحوامل مع الأكسجين / isoflurane وعبر قناع الوجه. استخدام 3-5٪ isoflurane والأكسجين في 100٪ للتخدير الأولي، تليها 1-1.5٪ خلال الفترة المتبقية من هذا الإجراء. ضمان أن الفأر هو تخدير كاف عن طريق معسر بلطف الكفوف و / أو الذيل.
   3. ضع الماوس مستلق على الطاولة التعامل مع الماوس (تعيين لتسخين عند 37 درجة مئوية) وتغطية العينين مع زيوت التشحيم لمنع جفاف القرنية.
   4. تطبيق هلام الكهربائي على الأقطاب والشريط الكفوف إلى الأقطاب لرصد معدل ضربات القلب، ومعدل التنفس، وتخطيط القلب. ضع ميزان حرارة المستقيم لمراقبة درجة حرارة الجسم.
   5. تحقق أولا من أن الفأر هو الحامل من خلال وضع تصور والفرز الأجنة بواسطة الموجات فوق الصوتية. تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية على البطن ووضع مسح الرأس فوق المثانة. من أجل التناسق، تصور المثانة الأولى،وتعول الأجنة في اليسار وقرون الرحم اليمنى، بدءا من موقف المثانة. ضمان قلوب الجنينية والضرب بشكل طبيعي.
   6. إذا كان الماوس الحوامل، ضع طبق بيتري فوق موقع شق المستقبل مع الطين. اضغط الطبق قليلا على البطن بحيث الطبق هو في اتصال مباشر.
   7. إزالة الطبق وتعقيم البطن مرة أخرى. جعل 1.5-2 سم خط الوسط بطني شق، ما يقرب من 0،75 حتي 1 سم فوق المهبل، لفتح البطن والصفاق. تجنب إصابة الأعضاء الداخلية.
   8. من الداخل للظاهر اليسار أو اليمين الرحم القرن بالملقط، وسحب بلطف من خلال غشاء السيليكون من الطبق، وتحقيق الاستقرار في طبق على الطين مرة أخرى. منع اسعة سحب أو التلاعب، لأن هذا قد يسبب النزيف في الأوعية الرحم والوفاة المبكرة من الإناث و / أو الأجنة.
   9. عد الأجنة مرة أخرى للتأكد كافية حفظ السجلات التي تم حقن الاجنة.
   10. تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية على شأبواق terine لصورة القلب ومنع الجفاف.
   11. صورة الجنين الأولى ليتم حقنه. تحقق الضرب العادي القلب الجنينية والاحتفاظ بسجلات للتوجه الجمجمة، الذيلية واليسار واليمين من الجنين. إذا لزم الأمر، إعادة قرن الرحم قليلا لضمان التوجه السليم. إذا هذا يثبت صعبة، والانتقال إلى الجنين القادم.
   12. ثقب الرحم بعناية مع إبرة حقن مكروي لوضع إبرة في زاوية 45 درجة فوق الجنين، قليلا خارج التامور (الشكل 3). لوصفها الخلايا النخابية، صورة قلب في طريقة عرض أربعة الغرفة ووضع الإبرة بحيث يشير نحو الأخدود الأذين البطين (الشكل 3). إذا يحتاج إلى أن يتم ضبط زاوية، وسحب الإبرة، وإعادة. لا ضبط زاوية مع إبرة داخل الرحم، لأن هذا قد كسر الإبرة. تجنب ثقب الأنسجة الأخرى، مثل أطرافه أو المشيمة.
   13. تحريك الإبرةعلى الجدار التامور وثقب ذلك مع اقتراح لطيف، ولكن سريع. بشكل عام، وسوف يكون هناك بعض المقاومة، ولكن تتحرك الإبرة سريع جدا قد يتسبب في طرف الإبرة لثقب القلب نفسه. يجب أن ينتهي الطرف حتى في الفضاء التامور الأخدود الأذين البطين. في حالة النزيف التامور، سوف خلايا الدم تكون مرئية كنمط مثل الثلج الأبيض. إذا كان هذا هو الحال، والتوقف عن حقن الجنين والانتقال إلى الجنين آخر.
   14. حقن injectate. ضخ الحد الأقصى 700 NL في الفضاء التامور لمنع التأثير السلبي على التنمية القلوب. رصد الحقن بواسطة طفيف، وتورم الزمني للكيس التامور.
   15. بعد الحقن، وسحب الإبرة خارج وتأكيد أن injectate لا يزال من الممكن إخراجه للتأكد من أن الإبرة لم انسداد بواسطة شظايا الأنسجة.
   16. إعادة الجدول مناولة لصورة وحقن الجنين القادم. الحفاظ على عدد من الأجنة حقن ل3-4 الحد الأقصى (في واحدة قرن الرحم) لمنعتمديد التخدير، للسماح للأجنة التحكم في قرن الرحم معارضة، وضمان أن الإجراء لم تخل التطور الجنيني.
   17. بعد حقن العدد المطلوب من الأجنة، وإزالة هلام الموجات فوق الصوتية الزائدة ووضع بلطف قرن الرحم مرة أخرى في البطن في موقعها الصحيح.
   18. إغلاق البطن الأمهات باستخدام طبقة واحدة من خياطة لالصفاق والعضلات في منطقة البطن، وطبقة ثانية من خياطة للبشرة.
   19. حقن الفأر مع الجرعة الأولى من الدواء الألم. استخدام حقنة واحدة من 0.05-0.1 ملغ / كغ البوبرينورفين 15 دقيقة قبل إنهاء التخدير وثلاث حقن إضافية مع 12 فترات ساعة.
   20. وقف التخدير ومراقبة الماوس لاسترداد كافية من الإجراء. منزل الماوس الحوامل في قفص الفردية لمدة المرجوة من المتابعة.

النتائج

باستخدام بروتوكولات الحقن المذكورة أعلاه، وخلايا يمكن أن توصف و / أو حقنها في قلب الفأر الجنينية. كدليل على المفهوم، وتظهر العديد من الأمثلة التي بروتوكول الحقن وفيفو السابقين AVC ازدراع والقلب معزولة، أو ثقافة الجنين كلها كانت مجتمعة (الشكل 1).

Discussion

تم تصميم السابقين بروتوكولات حقن الجسم الحي داخل القلب المذكورة أعلاه للحفاظ على وظيفة عضلة القلب لمدة 48 ساعة على الأقل في منتصف مرحلة (E9.5-E11.5) أجنة الفئران. هذه الأساليب تسمح للحقن حقن استهدفت مكانيا من الحمض النووي أو الخلايا. وبعض الأمثلة هو مبين في ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Setups/Hardware
40 MHz Transducer	VisualSonics	MS550S
Microinjector	VisualSonics
Microinjector	Eppendorf	5242
Micromanipulator	Eppendorf	5171
Nitrogen			required to pressurize the injector
Rail system	VisualSonics
rotator			to rotate glass tube with embryos inside the incubator
Standard incubator			5% CO2, 37 °C
stereomicroscope	Zeiss	Discovery. V8
Vevo 2100	VisualSonics
Microinjection
Borosilicate capillary tubes	World Precision Instrument	KTW-120-6	1.2-μm external diameter
Pipette puller	Sutter	Model P87
Microinjection needles	Origio-Humagen	C060609	OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip
Hamilton syringes
Petri dishes			10-cm diameter
Mineral oil	Sigma	M8410
Silicon membrane	Visualsonics		4.3 x 4.3 cm
Play-Doh
Isoflurane	Vet One
hair removal agent	Nair
Eye lubricant	Optixcare	31779
Electrode gel (Signa)	Parker
Suture	Sofsilk 5-0	S1173
Ultrasound gel	Aquasonic
Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-1	0.05-0.1 mg/kg in saline
Other
Silicone Elastomer	Dow Corning	Sylgard 184
Glass petridishes	Fine Science Tools		60-mm diameter
Insect pins	Fine Science Tools	26002-20
Media and culture reagents
Optimem medium	Life Technologies	51985026
M2 medium	Sigma	M7167
Dulbecco’s Eagle Medium	Lonza	BE12-640F	high glucose and 50% rat serum
M16 medium	Sigma	M7292
Rat serum	Janvier	ODI 7158
Pennicilin/streptomycin	Life Technologies	15140-12
oxygen 40%	Air liquid		required to oxygenate the embryo culture medium
Fetal calf serum	Fisher	RVJ35882
Matrigel	BD	356230
Collagen type I	BD	354236	to coat culture dishes for explant culture
Culture dishes	Dutcher /Orange	131020
Injectates
CDCFDA-SE	Invitrogen/Molecular Probes	C1165	25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use.
PGK-GFP-expressing lentivirus			~8E9 transducing units/ml DMEM
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019