منتبذ المخاطي Engrafting إجراءات تسليم المخدرات مباشرة الى المخ في الفئران

Summary

وقد تم تطوير نموذج الفأر من بالمنظار إعادة الإعمار قاعدة الجمجمة البشرية التي تخلق واجهة نصف نافذ بين الدماغ والأنف باستخدام الطعوم المخاطية الأنفية. يسمح هذا الأسلوب للباحثين لدراسة التسليم إلى النظام العصبي المركزي للعلاجات عالية الوزن الجزيئي التي تستبعد خلاف ذلك حاجز الدم في الدماغ عندما تدار بشكل منتظم.

Abstract

وأعاق إيصال العلاجات إلى الدماغ عن وجود حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​الذي يقيد مرور مركبات الوزن الجزيئي القطبية وارتفاع من مجرى الدم وإلى أنسجة المخ. وقد تحقق بعض النجاح التسليم المباشر في البشر من خلال زرع القسطرة عبر الجمجمة؛ ولكن هذا الأسلوب هو الغازية للغاية ويترافق مع مضاعفات عديدة. وثمة بديل أقل الغازية لتكون جرعة الدماغ من خلال زرع جراحيا، غشاء نصف نفوذ مثل الغشاء المخاطي للأنف الذي يستخدم لإصلاح العيوب الجمجمة قاعدة التالية بالمنظار transnasal جراحة إزالة ورم في البشر. نقل المخدرات على الرغم من أن هذا الغشاء تجاوز بشكل فعال ومنتشر BBB مباشرة الى الدماغ والسائل المخي الشوكي. مستوحاة من هذا النهج، وقد وضعت نهجا الجراحية في الفئران التي تستخدم الأغشية المخاطية المغروسة المانحة الحاجز أكثر من خارج القحف الجراحية عيب BBB. وقد تبين هذا النموذج على نحو فعالتسمح بمرور المركبات عالية الوزن الجزيئي في الدماغ. منذ العديد من المرشحين المخدرات غير قادرين على عبور BBB، وهذا النموذج هو قيمة لأداء اختبار قبل السريرية لعلاجات جديدة للأمراض العصبية والنفسية.

Introduction

علاج الأمراض العصبية والنفسية وأعاقت بشدة من وجود حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​الذي يمنع أكثر من 95٪ من جميع وكلاء الدوائية المحتملة من الوصول إلى الجهاز العصبي المركزي ^1-3. على سبيل المثال، الدبقية مشتقة عصبية عامل (GDNF) وقد تبين أن تكون فعالة في علاج مرض باركنسون عند حقنه مباشرة في الدماغ، ولكن غير فعالة عند تسليمها بشكل منتظم لأنه لا يمكن اختراق BBB ^4-6.

العديد من اقترب وضعت في محاولة للتحايل على هذه المشكلة. وقد أظهرت تحسنا في تسليم النظامية من neurotheraputics باستخدام تقارن المخدرات التي تحتوي على الأجسام المضادة للبروتينات النقل انتقائية تقع على البطانة الشعرية الدماغ؛ ومع ذلك لم يظهر هذا الأسلوب لتكون قابلة للتطبيق لمجموعة واسعة من المستحضرات الصيدلانية ^7،8. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام افتتاح الاسموزي من BBB العيادةحليف، ومع ذلك تعاني هذه الطريقة من الجرعات النظامية المخدرات في مقابل تسليم أكثر مباشرة إلى منطقة الدماغ التي تهم ^9. وقد بذلت جهود كبيرة في تحسين تسليم transnasal على أمل تستهدف الدماغ ^10-12 مباشرة. على الرغم من تحقيق بعض النجاح، وفقط تم الحصول على نتائج قاطعة عن الأدوية التي تمتلك مستقبلات الذاتية، مثل الأنسولين ^13،14. وعلاوة على ذلك كانت آلية التسليم transnasal مثيرة للجدل مع أدلة تشير إلى دخول غير مباشرة الى الدماغ عن طريق حاسة الشم امتصاص الخلايا العصبية أو من خلال مجرى الدم ^11. وقد تحقق المباشر، والتسليم عبر الجمجمة باستخدام القسطرة زرع، ولكن هذا الإجراء هو الغازية للغاية ويرتبط مع العديد من المضاعفات ^15،16. حتى الآن، لا يوجد، طريقة مينيملي العامة لتقديم مركبات عالية الوزن الجزيئي في الدماغ.

الواردة في هذه الوثيقة هو إجراء العمليات الجراحية الفئرانالذي يخلق واجهة نصف نافذ مع الدماغ. ويتم إنجاز ذلك عن طريق engrafting على الغشاء المخاطي ازدراع ¹⁷ على عيب حج القحف الجراحية في الماوس. باستخدام هذا الإجراء فقد تبين أن مركبات قابلة للذوبان تصل إلى 500 كيلو دالتون يمكن تسليمها في النظام العصبي المركزي (الدماغ مباشرة في حمة وكذلك في السائل النخاعي) في كل وقت والوزن الجزيئي تعتمد الأزياء ^18. هذا الأسلوب من تجاوز BBB هو نموذج لإصلاح عيب قاعدة الجمجمة في البشر والذي يستخدم ترقيع الغشاء المخاطي أوعية دموية لإصلاح ثقوب في الجمجمة التالية transnasal الجراحة بالمنظار ^19،20.

Protocol

قبل الجراحة تأكد من الموافقة على جميع الإجراءات التي تتم عن طريق IACUC وأية سلطات أخلاقية أو قانونية إضافية واستخدام الممارسات علاج الحيوان إنسانية. وهذا يشمل استخدام الظروف الجراحة المعقمة، التخدير باستخدام الماوس وافق IACUC الأسلوب، التشحيم عيون الفئران مع مرهم الطبيب البيطري أثناء الجراحة، وتوفير الرعاية بعد الجراحة. لا المضي قدما في عملية جراحية إذا كان هناك أي سؤال حول ما إذا تمت الموافقة على جوانب الإجراء. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تؤدى في هذه الوثيقة من قبل لجنة جامعة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام بوسطن.

1. إعداد الحيوانات واللوازم الجراحية

1. الأوتوكلاف كل أداة جراحية التي سيتم استخدامها أثناء الجراحة.
2. تأكد من الموافقة على جميع التقنيات التي سيتم تنفيذها من قبل الهيئات التنظيمية الحيوان.

2. حصاد المخاطي الكسب غير المشروع

1. اختار الماوس متطابقة وراثيا من العمر مماثلة لالماوس التجريبية والموت ببطء في طريقة IACUC المعتمدة (هنا: الاختناق isoflurane وتليها خلع عنق الرحم).
2. باستخدام مقص جراحي، وإزالة الجلد حول منطقة الأنف من الرأس الماوس تعريض الجمجمة.
3. مع هوائي الحفر، مع علامة ثلاثة خطوط اثنان منها الجناح أفقيا منطقة الأنف وثالثة تمشيا مع عيون الذي يربط بين خطين عموديا.
4. انتقل لأسفل البطني من أجل فصل الحاجز الأنفي من الأنسجة المحيطة بها. وهناك مسار أوسع منع تلف الغشاء المخاطي لكنه سيجعل الأمر أكثر صعوبة أيضا لعزل الغشاء. ينصح قطع الضيق أقرب إلى خط الوسط.
5. استخدام مقص لقطع الحاجز خالية من أي نوع من الأنسجة انضمت إليها وتخزينها في محلول ملحي معقم. في هذا الوقت يمكن تنظيفها الكسب غير المشروع حتى إزالة أي نوع من الأنسجة المتصلة. الوضع المثالي هو أن يكون الأغشية المخاطية التالفة تعرض على جانبي الحاجز الغضروف. واحد غرامالخلف ان نورد الغشاء لمدة الفئران وفرت المساحة السطحية للغشاء هي كافية لتغطية مواقع حج القحف. فمن المستحسن أن يستخدم الكسب غير المشروع في أسرع وقت ممكن والعائدات الباحث إلى الخطوة 3 حالما يتم عزل الكسب غير المشروع.

3. زرع الجراحي لالمخاطي الكسب غير المشروع

1. باستخدام والإجراءات الجراحية الفئران العقيم القياسية، تخدير وجبل ماوس في إطار stereological. استخدام ما يقرب من 2٪ isoflurane والأكسجين النقي في استخدام آلة التخدير القوارض.
2. لشل حركة الماوس في جهاز التجسيمي بقضبان الأذن والأنف حامل. تطبيق مرهم للعين للعيون وفرك فروة الرأس مع بتدين و 75٪ من الإيثانول لمدة ثلاث جولات. باستخدام مقص أو الانتهازي الشعر، إزالة الفراء على رأسه. فضح الجمجمة بشفرة حلاقة ومستوى الرأس. إجراء حج القحف فوق موقع الدماغ التي سيتم مداوي. على سبيل المثال، عند استهداف المخطط قطع 1.25 ملمقطر ثقب دائري في الجمجمة (تركزت في AP: 1.00 مم؛ ML: 0.88 مم) باستخدام الحفر بالهواء المضغوط. الرطب منطقة حفر مع ملحي معقم واستخدام شفرة حلاقة لإزالة الجمجمة.
3. إزالة بعناية الجافية باستخدام غيض من إبرة. بالإضافة إلى ذلك، وهذا يمكن أن يتحقق من خلال تطبيق الحد الأدنى من الأنسجة لاصقة على سطح الجافية رطبة. مرة واحدة وشددت هذه الطبقة، الحركة الجانبية مع طرف شفرة حلاقة يمكن استخدامها لإزالة الغشاء.
4. وضع الغشاء المخاطي فوق سطح الدماغ مع الحرص الشديد للحفاظ على الجانب الظهارية التي تواجه بعيدا عن الجرح. من الأفضل القيام بذلك عن طريق نقل الحاجز بأكمله على سطح الجمجمة المجاورة لموقع حج القحف مع ملاقط. استخدام غيض من زوج من مقص جراحي، وسحب الغشاء الخروج من الغضروف وعلى الجمجمة والدماغ السطح. لا تدع غشاء تجف أو لمسها مع أي مادة ماصة. الكسب غير المشروع يجب أن تتداخل بسخاء كل الحواف العظمية من ليالي حج القحفالفنار.
5. تغطية الكسب غير المشروع مع قطعة معقمة من النتريل. هذا يعمل على منع التصاق الجلد إلى الكسب غير المشروع خلال الشفاء. والنتريل يحتاج إلى أن تكون كبيرة بما يكفي لتغطية الغشاء المخاطي بأكمله. تقليم الغشاء المفرطة إذا لزم الأمر. تجنب أي حركة النتريل مرة واحدة قد حان في اتصال مع الكسب غير المشروع.
6. إغلاق الجلد مع تشغيل 5-0 خياطة العقيمة والسماح للماوس على التعافي لمدة 3-7 أيام قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. والحرص على عدم التشويش على حاجز النتريل أو الكسب غير المشروع المخاطية أثناء إغلاق الجلد.

4. إدارة الجرعات الحل

1. بعد تأمين الماوس تخدير في إطار التجسيمي، وقطع مع مقص خياطة وإزالة الجلد الزائد حول الجمجمة.
2. إزالة حاجز النتريل وتنظيف سطح الجمجمة. استخدام العقيمة المالحة والقطن مسحات لتنظيف المنطقة حتى الكسب غير المشروع مرئيا. قد يكون من الضروري لخفض الكسب غير المشروع بشفرة الحلاقة لو نمت أكبر من دesired مساحة السطح.
3. إذا كانت التجربة سوف تكون أطول من بضعة أيام، وأنه من الحكمة لزرع ما لا يقل عن اثنين من مسامير الجمجمة لتعزيز عملية الزرع الرأس.
4. وضع أعلى بكثير من الكسب غير المشروع بحيث حواف على اتصال مع الجمجمة. تطبيق لاصقة cyanoacrylate عند تقاطع بين البئر والجمجمة. ملء البئر مع ملحي معقم وتحقق للتأكد من عدم وجود تسرب. مصنوعة من الآبار الإبر قطع حقنة.
5. تطبيق الأسمنت العظام في الجمجمة لتأمين البئر في المكان.
6. إزالة الملوحة من البئر مع ماصة. يغسل عدة مرات للتحقق جيدا لم تسربت بأن لاصقة فيها إضافة إلى الحل المنشود؛ في هذه الحالة يتم استخدام 50 ميكرولتر من ديكستران الفلورسنت. ومن المتوقع أن المركبات القابلة للذوبان المياه من قطبية مماثلة سوف تتصرف نفس ديكستران. لم يتم استكشافها تسليم مركبات مسعور أو تعليق مع هذا الأسلوب.
7. سقف أعلى البئر باستخدام قطعة دائرية من النتريل تأمين لأعلى باستخدام فورية الغراء اللاصق. تأكد من أن لاصق لا تأتي في اتصال مع محتويات جيدا.

5. تحليل Transmucosal التسليم

1. بعد المبلغ المطلوب من الوقت قد انقضى، تخدير الماوس وتبادل محتويات جيدا بمحلول صبغة زرقاء ايفان. ويستخدم هذه الصبغة للتحقق من أن الكسب غير المشروع كان سليما.
2. بعد 30 دقيقة، تخدير الماوس بشكل كبير، وإزالة محلول الصبغة، والموت ببطء عبر قطع الرأس.
3. إزالة يدويا الزرع وإزالة المخ باستخدام مقص جراحي. توخي الحذر للحفاظ الكسب غير المشروع في المكان.
4. إزالة مرة واحدة، وتبريد فلاش تجميد الدماغ في حل من الأيزوبيوتان في حمام الثلج الجاف.
5. تضمين الدماغ في درجة الحرارة المثلى للقطع (أكتوبر) حل وشريحة في 50 ميكرون.
6. وضع شرائح المطلوب مباشرة على شريحة المجهر.
7. صورة شريحة باستخدام مجهر الإزهار في أقرب وقت الحل أكتوبر قد جفت.

النتائج

الحصول على كبيرة بما يكفي الأنف الحاجز ازدراع هو أمر حاسم لخطوات لاحقة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق حفر في الموقع على الجمجمة الماوس المانحة هو مبين في الشكل 1A. وقطع على طول هذا الطريق إنتاج النباتى من حجم كاف كما هو مبين في الشكل 1B. إذا كان عمق الحفر ليست...

Discussion

الخطوة الأكثر صعوبة من الإجراء الموصوفة هنا هو النقل الناجح للغشاء المخاطي الحجم بشكل كاف على سطح الدماغ. يرصد هذه الخطوة أسهل بكثير إذا كان الحاجز الأنفي تحصد كبيرة بما فيه الكفاية وتنظيفها جيدا. إذا تم اقتطاع جزء بطني من الحاجز، وينبغي الحصول على الكسب غير المشروع ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Taconic	C57BL/6
Isoflurane	Piramal Healthcare
Student fine scissors	Fine Science Tools	91461-11
Pneumatic drill	MTI Dental	333-CB
Drill bit
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP	Abbott Laboratories	4925
Polystyrene Petri dish	Fisher	08-757-12	for temporarily storing graft
Bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Oxygen/Isoflurane System	SurgiVet	V720100
Temperature Control System	Physitemp	TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument	KOPF	Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators	Fisher	23-400-106
7.5% Providone iodine			Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless	Feather	2976#10
Scalpel handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
3% Hydogen peroxide			for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Needles	Becton, Dickinson and Company	305176	needle tip cut off and used as well
Syringes	Becton, Dickinson and Company	309597
Nitrile gloves	Denville Scientific Inc	G4162	for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder	Fine Science Tools	91201-13
Cyanoacrylate adhesive			commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque	Stoelting	51458
Isobutane (2-methylbutane)	Aldrich	M32631	for dry ice bath
Dry ice