فهم توالد المبكر باستخدام المبسطة<em&gt; في الموقع</em&gt; بروتوكول التهجين في<em&gt; القيطم</em

Summary

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Abstract

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Introduction

The expression pattern of a specific gene is an important piece of information in determining the potential role for that gene in the development of a specific organ or cell type. Simply put, if it is not expressed at the right time and place it is unlikely to play a key role. In Xenopus, as in most early embryos, the most commonly used assay for detecting the expression of a gene is whole mount in situ hybridization using labeled antisense RNA probes. The use of antibody staining to assess expression of a gene in Xenopus is becoming more common as researchers discover antibodies, usually raised against mammalian proteins, that cross react to the Xenopus homologue or generate their own ^1-3. However, the vast majority of studies on Xenopus organogenesis still utilize antisense RNA probes. When antibodies are used, each individual antibody often requires optimization for the primary antibody concentration or fixation protocols. In contrast, the protocol for in situ hybridizations is essentially invariant for different probes. The basic concept is relatively simple and an excellent standard protocol has been well established ⁴. Our protocol is a streamlined version of the original protocol ⁴ that still provides excellent detection of gene expression patterns in the early embryo. The embryos are fixed and then prepared for hybridization by changing solutions and temperatures such that it allows for high stringency binding of the labeled antisense RNA probe to its target mRNA. The unbound probe is washed away and the embryos are then prepared for binding of an antibody against the label on the RNA probes. Excess antibody is then washed away and an enzymatic color reaction is used to localize where the RNA probe is bound in the embryo. There are now a number of Xenopus transgenic lines that drive expression of fluorescent proteins in specific tissues and these are available at the Xenopus stock centers such as the National Xenopus Resource in Woods Hole. While very useful for many experiments that require examining organogenesis in living embryos, this option requires separate housing for the transgenic lines.

In situ hybridization can clearly delineate where specific organs or cell types will form in the early embryo (Figure 1). The technique is remarkably sensitive given that one can detect gene expression in a small number of cells in a single embryo ⁵. However, in situ hybridization using the intensity of colorimetric staining is not considered quantifiable because the color reaction is not a linear one. Despite difficulty in quantifying staining intensity, changes in expression are often quite noticeable; particularly when the in situ hybridization shows quantifiable increases or decreases in the size of expression domains ^6,7.

The clear advantages of whole mount in situ hybridization make it a critical assay in the study of early development. However, it is a time consuming one that requires many steps over several days. This protocol is a simplified version of the standard protocol that eliminates several steps without reducing the quality of the in situ result. The simplification also eliminates sources of variability, making trouble shooting easier if an in situ hybridization is not optimal. Specifically, we have eliminated the use of proteinase K and RNAse treatments of the embryo, two steps that can depend on reagent quality and can also reduce signal intensity if overdone. The protocol also provides some degree of cost saving due to eliminating the use of several reagents. Finally, this protocol also provides some simple guidelines for improved capturing of images of in situ hybridization results. Although this protocol is optimized for work in Xenopus embryos, it is likely that at least some of the simplifications will be applicable to in situ hybridization work in other embryo systems.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد الأجنة

1. إذا لم تفعل بشكل روتيني كجزء من ثقافة الجنين، دي هلام الأجنة باستخدام 2.5٪ السيستين، ودرجة الحموضة 8.0 قبل تثبيت ^8. على الرغم من أنه ليس من الضروري على الاطلاق، فمن المفيد أن ثم يدويا إزالة المغلف الإخصاب قبل تثبيت باستخدام ملقط غرامة.
   1. استخدام الماصات الزجاج باستور لنقل الأجنة. ماصة ليست واسعة بما فيه الكفاية لنقل الأجنة وذلك باستخدام قلم الماس لقطع ماصة الزجاج في نقطة واسعة بما يكفي لالتقاط الجنين. القضاء على حواف حادة من الماصات بعد قطع كتبها بسرعة تمرير قطع غيض من خلال شعلة الموقد بنسن لإذابة حواف حادة.
      ملاحظة: العناية يجب أن تؤخذ، والزجاج يمكن أن يكون تزال ساخنة بما يكفي ليسبب حروقا على الرغم من أنه يبدو أن تبرد عن طريق التفتيش البصري.
2. إجراء تثبيت الجنين في مراحل. أولا، إعداد قارورة زجاج للاستخدام في جنين التثبيت. استخدام هذه قارورة لجميع الخطوات بما في ذلك المباراة النهائيةالتخزين. استخدام قارورة التي هي واضحة مع ختم تفلون جيد في الغطاء، مما يسمح لرصد الأجنة خلال جميع مراحل هذه العملية. تسمية قارورة مع المعلومات التجريبية المناسبة باستخدام علامة دائمة ومن ثم تغطية التسمية مع شريط واضح، كما سيتم فقدان حتى علامة دائمة على مدار الإجراء بسبب استخدام الكحول وغيرها من المذيبات.
   1. استخدام Mempfa لإصلاح الأجنة. جعل مخزون من 8٪ امتصاص العرق في دفعات من 50-100 مل في كل مرة. استخدام ما يقرب من 75٪ من H ₂ O المطلوبة والحرارة إلى 50-60 درجة مئوية، والذي هو ضروري للحصول على امتصاص العرق إلى حل.
      ملاحظة: هذا الحل هو مختلف قليلا من Memfa المستخدمة في الإصدارات القديمة بروتوكول المنشورة في أنه يستخدم بارافورمالدهيد بدلا من الفورمالديهايد.
   2. إضافة 2-3 قطرات من 10N هيدروكسيد الصوديوم أو حتى درجة الحموضة ما يقرب من 7.5 (استخدام ورقة الرقم الهيدروجيني للتأكد من درجة الحموضة). بارافورمالدهيد هي سامة جدا، وبالتالي توليد الحل الأسهم في غطاء الدخان. وبمجرد أن الفقرةالفورمالديهايد هو في حل، تصفية حل من خلال ورقة هتما في وعاء الطازجة وإضافة H ₂ O إلى الحجم النهائي. إذا لزم الأمر، وتخزين حل بارافورمالدهيد عند 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع.
   3. تجميع المكونات المتبقية من الحل تثبيت Mempfa (الجدول 1). تأكد من أن تركيز العمل النهائية من بارافورمالدهيد 4٪. تخزين جميع مكونات الحل تثبيت في 4 درجات مئوية كما أسهم.
   4. باستخدام قطع الزجاج ماصة، وتحديد الأجنة عن طريق إضافة الأجنة إلى قارورة من الزجاج وصفت التي تم شغلها مع ما يقرب من 3-4 مل من Mempfa حل (الجدول 1). تجنب تحديد أكثر من 20-30 الأجنة في قارورة. إضافة الأجنة مع حد أدنى من نقل السائل من الجنين المتوسطة. إصلاح الأجنة في حل Mempfa لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   5. لهياكل الأديم الباطن أواخر أداء في بتوضع على معزولة يدويا القناة الهضمية والأديم الباطن المشتقات ^9،10، والذي يسمح لاختراق جيد لجنة التحقيق، وكذلك يتجنب تجويف تلطيخ.
   6. تخزين محلول الميثانول بنسبة 100٪ في -20 ° C. بعد تثبيت بارافورمالدهيد، يستعاض عن حل Mempfa مع ما يقرب من 4 مل من -20 ° C، و 100٪ الميثانول لتخزين الأجنة.
   7. دوامة قارورة بعد إضافة الميثانول لمنع الأجنة من الالتصاق على الزجاج أو الأجنة الأخرى. أيضا، تأكد من أن يتم ختم القنينات بإحكام لأن الميثانول يمكن أن تتبخر في الثلاجة مع مرور الوقت إذا فضفاضة.
      ملاحظة: الأجنة يمكن تخزينها لمدة سنة على الأقل، وعلى الأرجح لفترة أطول، في الميثانول قبل تلطيخ مع عدم فقدان جودة في الموقع التهجين.

2. التحقيق التحضير

1. استخدام 1-2 ميكروغرام من الحمض النووي القالب لجعل تحقيقات المسمى digoxigenin. قطع البلازميد التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي المناسب في نهاية 5 'من الجينات في المصالح مع تقييد انزيم مناسب للثار ناقلات لتوليد تحقيقات العقاقير.
   ملاحظة: يجب أن يكون البلازميد موقع ملزم بوليميريز RNA المناسب (على سبيل المثال T7، T3، أو SP6).
2. السماح للDNA، والمياه، NTP خلط وعازلة البلمرة لتدفئة إلى درجة حرارة الغرفة قبل تجميع رد فعل التوليف التحقيق. إضافة مكونات رد فعل التوليف RNA إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل بالترتيب كما هو موضح في الجدول رقم 2. ضبط حجم الماء المضاف لجلب إجمالي حجم رد الفعل التوليف التحقيق إلى 20 ميكرولتر. تجميع رد فعل في درجة حرارة الغرفة لمكونات المخزن المؤقت البلمرة يمكن أن يعجل قالب DNA عندما تكون في تركيزات عالية والبرد.
3. احتضان رد فعل النسخ لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: حضانات لأطول قليلا من ساعتين يؤدي إلى أي آثار سلبية، ولكن أيضا تظهر زادت قليلا الغلة. إذا المحتضنة لمدة ساعة واحدة، سيتم تخفيض العائد ولكن لا يزال كافيا لجعل التحقيق جيد.
   1. في انتظار رد فعل النسخ إلى النهاية، وجعل جل الاغاروز التي سيتم استخدامها لاختبار نوعية التحقيق. تذوب 1 ميكروغرام من الاغاروز في 100 مل من العازلة 1X TAE (انظر الجدول 1) عن طريق تسخين المحلول إلى نقطة الغليان. إزالة حل من الحرارة عندما مسحوق الاغاروز قد حلت تماما.
   2. إضافة 2 ميكرولتر إيثيديوم بروميد الأسهم الحل (10 ملغ / مل) إلى حوالي 100 مل من agarose هلام عندما يبرد الاغاروز إلى حوالي 60 درجة مئوية للسماح التصور من الحمض النووي الريبي تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) النور.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ هذا الحل agarose هلام في 60 درجة مئوية الحاضنة بحيث يمكن سكب المواد الهلامية في المستقبل دون ذوبان المتكررة. العناية في التعامل مع بروميد إيثيديوم بسبب السمية المحتملة.
4. إضافة 1 ميكرولتر DNAseI (ريبونوكلياز الصف مجانا) إلى رد فعل النسخ بعد حضانة 2 ساعة واحتضان لمدة 10 دقيقة أخرى في 37 ° C للقضاء على الحمض النووي القالب.
5. إزالة 1 ميكرولتر من مزيج رد فعل لاطمئنان على 1٪ الاغاروز-تاي جل وإلى بقية (20 ميكرولتر) إضافة 80 ميكرولتر من 1٪ SDS في TE العازلة (10 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA)، و 10 ميكرولتر من 5M NH ₄ خلات، و 220 ميكرولتر الإيثانول من البرد. دوامة المزيج بقوة ويوضع جانبا على الجليد حتى يتم معرفة نتائج فحص الجودة RNA.
   1. تشغيل ميكرولتر 1 من RNA إزالتها قبل هطول الأمطار على 1٪ الاغاروز-تاي هلام. لتخفيف التحميل على هلام، إضافة 4-5 ميكرولتر من الماء و 1 ميكرولتر من معيار صبغ تحميل لRNA. عرض RNA على هلام باستخدام نقل transilluminator ضوء الأشعة فوق البنفسجية من أجل التحقق من جودة التحقيق (انظر المناقشة).
6. ترسيب RNA المتبقية التي تم تعيينها جانبا على الجليد في الخطوة 2.5 عن طريق الدوران في microcentrifuge بأقصى سرعة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. رسم قبالة طاف مع تعادل خارج ماصة الزجاج والسماح ليجف لفترة وجيزة.
   1. Resuspend والتحقيق مع 1 مل من العازلة RNA التهجين (الجدول 1) في أنبوب إيبندورف. دوامة ورiefly تسخين أنبوب إلى 37 درجة مئوية والدوامة مرة أخرى. نقل الحل التحقيق إلى 15 مل المسمار غطاء أنبوب البوليسترين وملء الى 7-10 مل مع العازلة RNA التهجين. ملاحظة: لجنة التحقيق يمكن أن تضعف مزيد (مزيد من التخفيف 10 أضعاف ما زالت قادرة على العمل) مما أدى في كثير من الأحيان في خلفية منخفضة إلا أن ردود الفعل تلطيخ أيضا يستغرق وقتا أطول.

3. تهجين موضعي

1. خذ الأجنة التي تم تخزينها في -20 درجة مئوية الميثانول والسماح لتسخين إلى درجة حرارة الغرفة. تنفيذ الإجراء بأكمله في قوارير زجاجية. إذا أجنة مختلفة من مجموعة واحدة تسير ينبغي أن ينظر إليه من قبل تحقيقات مختلفة، والاحتفاظ بها في قارورة واحدة حتى قبل تضاف تحقيقات للحد من التقلبات والعمل في اليوم الأول.
   1. ترطيب الأجنة من خلال سلسلة الميثانول على النحو المبين في الجدول 3 (انظر الجدول رقم 1 عن وصفات غسل) تمهيدا لإضافة التحقيق. دوامة بلطف امبرينظام التشغيل بعد كل تغيير للتأكد من أنها لا إصرارها على الجانبين أو بعضها البعض، ويهز الأجنة عن طريق تركيب قارورة على nutator. عند نقل السوائل، والتحقق من الداخل من القبعات لضمان أن الأجنة لم محاصرين هناك.
   2. مرة واحدة في حل التحقيق، هجن الأجنة بين عشية وضحاها كما هو موضح في الجدول رقم 3.
2. إزالة الحل التحقيق. حفظ التحقيق المستخدمة من قبل تخزينها في 15 مل المسمار غطاء أنبوب البوليسترين، مع وضع علامة التاريخ وعدد المرات التي استخدمت في التحقيق، في -20 ° C.
   ملاحظة: نفس التحقيق يمكن إعادة استخدامها عدة مرات لاحقة في التهجين الموقع حتى تبدأ التفاعلات اللونية لأخذ وقت طويل بشكل غير طبيعي لتصل إلى كثافة المطلوب.
   1. وبمجرد أن التحقيق هو إزالتها، وإعداد الأجنة لتلوين الأجسام المضادة ضد التحقيق من خلال سلسلة من يغسل المبينة في الجدول رقم 4. تغيير درجة الحرارة كما هو مطلوب (الجدول 4) عن طريق تحريك رانه nutator، مع قارورة من الأجنة المرفقة، مباشرة في أفران التهجين التي تم تعيينها إلى درجة حرارة مناسبة.
   2. تشكل حجم مناسب من MAB + HTSS + BR + المضادة للحفر الأضداد (الجدول 4) في الوقت الذي الأجنة يجري المحتضنة في MAB + HTSS + BR عرقلة الحل بحيث يتم حظر الأجسام المضادة قبل إضافة إلى الأجنة. جعل الحلول عرقلة جديدة في اليوم من الاستخدام.
3. إزالة حل الأجسام المضادة والبدء يغسل كما هو مبين في الجدول رقم 5 بعد الحضانة بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة. أداء اثني عشر على الأقل 30 دقيقة يغسل من أجل الاستعداد لتلطيخ مع الفوسفاتيز القلوية الركيزة وتقليل الخلفية قدر الإمكان. استخدام إما MAB عازلة أو TBT حل (الجدول 1) للخطوات الغسيل.
   / وأضاف مل من BSA حل TBT هو TTW يحتوي على 2 ملغ: ملاحظة.
   1. استبدال حل غسل الماضي مع BM الأرجواني الفوسفاتيز القلوية الركيزة. أداء REAC تلطيخنشوئها في أي درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: تلطيخ أكثر سرعة عند 37 درجة مئوية ولكن إذا ترك بين عشية وضحاها، ويمكن تلوين الخلفية غير مقبول في كثير من الأحيان يكون نتيجة لذلك. فإن ردود الفعل تلطيخ وغالبا ما تتطلب تلطيخ بين عشية وضحاها ودرجة حرارة الغرفة هو الأكثر أمانا لذلك.
   2. إذا كنت بحاجة مزيد من تلطيخ وتتخذ الحل الأرجواني BM على اللون الأزرق، واستبدال الحل تلطيخ مع الطازجة BM الأرجواني ووضع أنابيب إلى 37 درجة مئوية. إذا كان مرنا الهدف وفيرة جدا، ووضع الأجنة في حل تلطيخ في 4 درجات مئوية خلال الليل ثم نقل الأجنة إلى درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية للسماح بمراقبة أفضل من رد فعل تلطيخ.
   3. مراقبة ردود الفعل جديدة بعناية، حيث أن الوقت لنتيجة النهائية اختلافا كبيرا بين الرنا المستهدفة المختلفة. من أجل التناسق، والتوقف عن رد فعل تلطيخ (انظر 3.4) عندما لا يكون هناك مواقع جديدة للتعبير الناشئة مع أطول الحضانة. الأهم من ذلك، إذا التهجين في الموقع ويجري استخدامها بوصفها الفحصللتجارب تبحث في مجموعات العلاج المختلفة، واستخدام نفس الوقت لردود الفعل اللون بين العلاج والسيطرة الأجنة.
4. وقف رد فعل تلطيخ وإعداد الأجنة لتخزين وتسجيل صورة عن طريق تغيير السوائل على النحو المبين في الجدول 6. لا تهز الأجنة في هذه المرحلة لأن إزالة وصمة عار يمكن تصور مثل التلوين الأرجواني من الميثانول حول الأجنة.
   ملاحظة: في كثير من الأحيان الأجنة لديها تلطيخ الأزرق الفاتح من الحل تلطيخ والميثانول البارد يمكن إزالة جزئيا على الأقل أنه على الرغم من هذا لا يكفي لإزالة الخلفية الثقيلة أو تجويف تلطيخ. يشير الميثانول البارد لالميثانول التي يتم الاحتفاظ في الثلاجة -20 درجة مئوية.
   1. ترطيب الأجنة وإصلاح وصمة عار مع Mempfa (الجدول 6). مرة واحدة ثابتة، وإزالة Mempfa وغسل الأجنة مع 25٪ الميثانول.
   2. إزالة الميثانول بنسبة 25٪ وإضافة محلول التبييض إذا إزالة الصبغة الذاتيةمطلوب. العناية في التعامل مع حل التبييض لأنها يمكن أن تسبب الحروق. مراقبة تبيض عن كثب كما يحدث بسرعة نسبيا ودرجة التبييض يمكن أن تختلف عن تأثيرات مختلفة (الشكل 2).
   3. يذوى الأجنة من خلال سلسلة الميثانول إلى 100٪ الميثانول للتخزين على المدى الطويل بعد التبييض، أو نقلها إلى برنامج تلفزيوني لمدة التخزين على المدى القصير والتصوير لاحقا (انظر الجدول 6).

4. التصوير الأجنة

1. مرة واحدة اكتمال الجنين عملية تلطيخ، صورة الجنين بحيث يتم التقاط معلومات عن مكان يتم التعبير عن هذا الجين من الفائدة لجمهور أوسع. استخدام 1٪ الاغاروز كخلفية لعرض الأجنة المزالة.
   ملاحظة: الاغاروز يعطي الزرقاء / الخلفية الرمادية التي يتناقض بشكل جيد مع الجنين واللون الأزرق للتفاعل تلطيخ. كما أنه يساعد على نزع فتيل الظلال والانعكاسات تشتيت أن تحويل الانتباه عن الجنين.
   1. إضافة الاغاروز في الماء ومن ثم تقديمهم ليغلي حتى الاغاروز هو في حل وثم السماح لتبرد إلى 50 قبل صب في طبق بتري. كما هو الحال مع الحل هلام TAE، وتخزين الحل الاغاروز في 55 ° C حاضنة لاستخدامات متعددة. صب الاغاروز إلى عمق حوالي 2 مم في طبق بتري. إذا لزم الأمر، وضبط عمق الاغاروز أن تسفر عن الظل بشكل مختلف قليلا من الخلفية.
   2. وبعد الإماهة من التخزين في الميثانول إلى محلول مائي (PBS أو TTW)، وذلك باستخدام سلسلة الميثانول، ووضع الأجنة في طبق بتري مع قاعدة الاغاروز (انظر الجدول 6). حافظ على حل نظيفة وإذا لزم الأمر، استخدم تصفية بسيطة للقضاء على الجسيمات الصغيرة التي يمكن أن تعطل الخلفية نظيفة من صور جيدة.
   3. لصورة الأجنة من وجهات نظر بديلة، مثل من الجانب البطني، وقطع قنوات رقيقة في الاغاروز لتناسب الجنين باستخدام ملقط غرامة ووضع الأجنة في تلك القنوات لتوجيه (الشكل 3 ). العناية في التلاعب في الأجنة لأنها تتلف بسهولة.
      ملاحظة: معظم مراحل لديهما موقف مميزة أنهم نفترض عند وضعها في محلول. على سبيل المثال، الأجنة مرحلة الأريمة تميل إلى الجلوس الحيوان حتى الجانب. مرة واحدة تبدأ الأجنة إلى استطال، فإنها تقع على جانبهم.
2. استخدام مصدر ضوء الألياف البصرية لإلقاء الضوء على الجنين من زاوية الضحلة، وخلق الظلال على الجنين التي توفر عمقا في الصورة ومساعدة تمييز هياكل السطح. لأن التبييض يمكن القضاء الصباغ الذي يوفر المعالم مفيدة، استخدم التظليل للأجنة ابيض بقوة.
3. مسح الأجنة لتلطيخ الصورة التي هو في أعماق الجنين، كما هو الحال في الحبل الظهري، الرئة، أو مناطق من الدماغ، (الشكل 4). ولتحقيق ذلك، وضع الأجنة من خلال سلسلة الميثانول حتى في الميثانول بنسبة 100٪.
   1. بعد الغمر الكامل في الميثانول، ونقل الأجنة في حل جزء واحد البنزيل الكحول وقسمين البنزيل يكونnzoate (BABB). سوف الأجنة تطفو على السطح في البداية ولكن كما الميثانول ستختلط مع BABB، وسوف تغرق في BABB. أداء كل خطوة التعامل مع BABB في قوارير الزجاج أو أطباق. سوف BABB تذوب أي البلاستيك أو الطلاء.
   2. مرة واحدة تطهيرها، عرض الأجنة مع الضوء المرسل القادمة من تحت الجنين. ضبط شدة الضوء وكذلك زاوية من الأسفل لتحسين التباين وتوفير أفضل لون.
   3. عندما تثير عرض الأجنة مسح طبق بتري الزجاج الخروج من القاعدة. القيام بذلك ببساطة عن طريق استخدام الآخران الأغطية طبق بتري لرفعه بحيث يتم رفع منطقة الطبق مع الأجنة.
      ملاحظة: هذا له ميزة أخذ قاعدة من التركيز والقضاء على آثار تشتيت من عيوب أو بقع على قاعدة المجهر التي يمكن أن تتداخل مع الصورة.

5. مزدوجة في الموقع التهجين

1. من أجل عرض في وقت واحد نمط التعبير عن TWس جينات مختلفة في جنين واحد، تجميع تحقيقين، واحد لكل من الجينات المختلفة. توليف التحقيق واحد باستخدام DIG-11-UTP كتسمية كما هو موضح أعلاه. تمييع نتاج رد فعل النسخ في المخزن RNA التهجين لانتاج 3X التحقيق أكثر تركيزا مما كانت لاحد في التهجين الموقع.
   1. توليف التحقيق الأخرى ذات الاهتمام باستخدام نفس البروتوكول بالنسبة للDIG المسمى بحثها إلا أن فلوريسئين-12-UTP يجب أن تكون بديلا عن DIG-11-UTP. تمييع نتاج رد فعل النسخ في المخزن RNA التهجين لانتاج 3X التحقيق أكثر تركيزا مما كانت لاحد في التهجين الموقع.
   2. مزج درجتين تحقيقات مركزة في نسبة 1: 1. للحصول على أفضل النتائج، استخدم المسبار المسمى فلوريسئين عن الجينات التي تظهر أقوى تعبير في واحدة البروتوكول الموقع التهجين.
2. استخدام نفس البروتوكول الموقع التهجين في وصفها لاحد في الموقع </ م> التهجين، باستثناء استخدام مسبار مزدوجة (التحقيق الذي يحتوي على خليط 1.5X تتركز تحقيقات digoxigenin المسمى والمسمى فلوريسئين) في نهاية اليوم الأول في مكان واحد الموقع التهجين التحقيق في.
   1. متابعة بروتوكول التهجين واحد في اليوم الثاني من ضعف البروتوكول الموقع التهجين، إلا شظايا استخدام المضادة للفلوريسئين-AP فاب في 1: التخفيف 4،000 بدلا من شظايا مكافحة DIG-AP فاب. تغسل الجسم المضاد الزائد من الأجنة كما هو الحال في واحدة البروتوكول الموقع في وتنفيذ رد فعل اللون الأول باستخدام الركيزة BM-AP الأرجواني.
3. وبعد رد فعل اللون الأول، تعطيل الأجسام المضادة flourescein في 0.1 M جليكاين درجة الحموضة 2.0 لمدة 40 دقيقة تليها خمس عشرة دقيقة يغسل في MAB. منع الأجنة في MAB + HTSS + BR لمدة 90 دقيقة. إضافة الأجسام المضادة لمكافحة DIG في 1: التخفيف 2،000 في MAB + HTSS + BR واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
   1. في اليوم التالي، وغسل الأجنة عشرoroughly في MAB (12 يغسل من 30 دقيقة) لإزالة الأجسام المضادة الزائد.
   2. غسل الأجنة لمدة 10 دقيقة في AP العازلة (الجدول 1) وبعد ذلك وصمة عار مع BCIP (0.5mg / مل في AP العازلة).
      ملاحظة: إن الجمع في الموقع يجب أن تعطي وصمة عار الأزرق الأرجواني الداكن لأول رد فعل اللون وخفيفة رد فعل اللون الأزرق للمرة الثانية (الشكل 5).
   3. وقف رد فعل اللون النهائي عن طريق إزالة عازلة AP وشطف ثلاث مرات مع MAB. إصلاح الأجنة مع Mempfa لمدة 10 دقيقة. غسل الأجنة مع 5 يغسل سريعة في MAB أو TBT.
   4. مع هذا الجمع اللون، واستخدام الميثانول في العلاجات آخر تلطيخ لم يعد ممكنا، كما أنه سيتم القضاء على BCIP وحده اللون. تخزين الأجنة بعد تلطيخ والتثبيت في برنامج تلفزيوني مع 0.02٪ أزيد الصوديوم. يمكن تلطيخ كثافة تكون ضعيفة مع ضعف في موقع المال. إذا كانت هذه هي مشكلة، والحد من يغسل إلى أربعة، كل من 2 مدة ساعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

استخدام تحقيقات محددة الأنسجة يمكن أن توفر معلومات العالقة في ما يخص حالة التنمية لأجهزة محددة. في الأمثلة التالية، ويستند مرحلة الجنين على الطاولة انطلاق Nieuwkoop وفابر ^11. إذا كان أحد يستخدم الجينات شكل تحقيقات وأعرب بعد التمايز، تروبونين القلب أنا في مرحلة...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

القدرة على استخدام الموقع التهجين لتصور نمط التعبير عن جينات معينة لا تزال الطريقة الأكثر شيوعا لتحديد أجهزة معينة أو أنواع الخلايا في الجنين القيطم. وذلك لأن العديد من المزايا التي توفرها هذه التقنية. التعبير عن الجينات يمكن تحديد هياكل محددة جيدا قبل أي ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labguake Tube Shakers	VWR	17-08-2011
VWR Vials	VWR	10-07-2012
L-Cysteine	BioShop	CYS342.500
Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM	Roche	11277057001
Digoxigenin-11-UTP	Roche	11209256910
Rnase inhibator (Rnase OUT)	Invitrogen	10777-019
T7 RNA Polymerase	Fermentas	EPO111
T3 RNA Polymerase	Fermentas	EPO101
SP6 RNA Polymerase	Fermentas	EPO131
Dnase 1	Invitrogen	18047-019
Sheep Serum	Wisent	31150
Blocking reagent	Roche	11096176001
BM purple Ap Substrate	Roche	11442094001
Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments	Roche	11093274910
Methanol	VWR	CAMX0485-7
NaCl	BioShop	SOD002.10
SDS	EM	7910
EDTA	BioShop	EDT001.500
Tris	BioShop	TRS003.5
Tween-20	EM	9480
MgSO4	Sigma	M-2643
Mops	BioShop	MOP001.250
EGTA	Sigma	E-3889-25G
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.500
Formamide	VWR	CAFX0420-4
RNA	Roche	10109223001
Maleic Acid	VWR	CAMX0100-3
tri-Sodium Citrate	BioShop	CIT001
Hydrogen Peroxide (30% Solution)	EM	HX0635-2
BSA	BioShop	ALB001.100
PVP-40	ICN	195451
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10
Benzyl Alcohol	Sigma	B-1042
Benzyl Benzoate	Sigma	B-6630
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500