التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة

Summary

الموصوفة هنا هو بروتوكول للتصوير شبه الآلي من مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزرد.

Abstract

الأجنة الزرد هي أداة قوية لفحص واسعة النطاق من جزيئات صغيرة. وكثيرا ما تستخدم الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية مراسل لتحديد المواد الكيميائية التي تعدل التعبير الجيني. شاشات الكيميائية التي مقايسة مضان في الزرد يعيش غالبا ما تعتمد على تكلفة، والمعدات المتخصصة لفحص نسبة عالية. نحن تصف الإجراء باستخدام المجهر epifluorescence معيار مع مرحلة الآلية تلقائيا صورة الأجنة الزرد وكشف مضان الأنسجة محددة. باستخدام الزرد المعدلة وراثيا التي تبلغ عن نشاط مستقبلات هرمون الاستروجين عن طريق التعبير عن GFP، وضعنا الداخلي شبه الآلي للكشف عن بروابط مستقبلات هرمون الاستروجين التي تنشط مراسل بطريقة الأنسجة محددة. في هذا الفيديو وصفنا إجراءات arraying الأجنة الزرد في 24-48 ساعة بعد الإخصاب (HPF) في لوحة 96 جيدا وإضافة جزيئات صغيرة التي تربط مستقبلات الاستروجين. في 72-96 HPF والصور من كل بئر منيتم جمع لوحة بأكمله تلقائيا وتفتيشها يدويا لمضان الأنسجة محددة. يوضح هذا البروتوكول القدرة على اكتشاف هرمون الاستروجين التي تنشط المستقبلات في صمامات القلب ولكن ليس في الكبد.

Introduction

وقد وضعت الزرد المعدلة وراثيا التي تسمح لرؤية مباشرة من النشاط في مسارات الإشارات، مثل عوامل نمو الخلايا الليفية ^1، حمض الريتينويك ² و ³ الاستروجين، في الأجنة الحية. هذه الأدوات تمكين الكشف عن المواد الكيميائية التي التشويش على مسارات إشارات (يعاير مثل تغير في كثافة مضان) أو المواد الكيميائية التي تعدل يشير بطريقة الأنسجة محددة (تغيير في مضان التعريب) ^4. التقاط الصور الآلي يزيد من الإنتاجية بشكل كبير من شاشات الكيميائية ^5،6. الشاشات التي مضان فحص تلقائيا في الزرد يعيش غالبا ما تعتمد على تكلفة، والمعدات المتخصصة. يوفر ما يسمى الفرز الفائق محتوى صالح ارتفاع القرار، والتصوير الكمي ولكن على حساب من استخدام لوحة القراء المتخصصة المجهزة لالمجهري متحد البؤر ^7،8. الهدف من هذا الأسلوب هو تلقائيا مقايسة مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزردفي لوحة 96 جيدا باستخدام مجهر epifluorescence القياسية. ويمكن تمييز مضان الأنسجة محددة باستخدام هذه التقنية، وربما يكون نهجا معقولا للمختبرات التي تفتقر إلى الوصول إلى القراء لوحة المتخصصة أو معدات الفحص العالية المحتوى.

في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم التصوير الآلي للكشف عن الأنسجة محددة مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) منبهات في الزرد حية في 3 أيام بعد الإخصاب (DPF). خط المعدلة وراثيا تيراغرام (5xERE: GFP) ^c262/c262 يحتوي على 5 جنبا إلى جنب استجابة هرمون الاستروجين تسلسل الحمض النووي عنصر (موسوعة الدين و الأخلاق) المنبع من البروتين الفلورية الخضراء (GFP) ^3. في غياب يجند، المتطلبات البيئية عادة ما تكون غير نشطة. يجند ملزم يتسبب في تغيير متعلق بتكوين جزئي، مما يسمح للمستقبلات لربط ااا الحمض النووي وتنظيم النسخ ^9. 5xERE: الأسماك GFP يمكن استخدامها لفحص المكتبات الكيميائية لجهري ER، ويمكن استخدامها لفحص عينات المياه للملوثات البيئية استروجين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على هذا البروتوكول من جامعة ألاباما في جنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية برمنغهام.

1. تربية اسماك الزرد ومجموعات البيض

1. قبل ثلاثة أيام من بداية التعرض للمواد الكيميائية وتجميع الدبابات تربية مع فواصل للذكور والإناث منفصلة. ملء كل منتصف الطريق خزان المياه مع نظام تربية الأحياء المائية. باستخدام صافي، ونقل تيراغرام (5xERE: GFP) الأسماك ^c262/c262 إلى خزانات تربية، ووضع 2 ذكور و 3 إناث في كل خزان مفصولة المفرق. وضع غطاء على كل خزان وتسمية مع التاريخ والسلالات إلى أن عبروا.
2. في صباح اليوم التالي، وإزالة كافة الحواجز والميل يحير لإنشاء منطقة ضحلة في نهاية واحدة من خزان التربية. السماح الزرد لزميله، وجمع الأجنة في 10 دقيقة فترات لضمان انطلاق التنموية دقيقة. البيض نظيفة من قبل الشطف من خلال مصفاة الشاي باستخدام E3B المتوسطة والأجنة تدفق برفق في أطباق بتري. العودة الأسماك البالغة لدائمةالدبابات.
3. باستخدام مجهر تشريح والفرز والعد، وإزالة أي أجنة غير مخصبة، والشاذ أو التالفة. المكان الأجنة في أطباق بتري في E3B المتوسطة ومنزل في 28.5 درجة مئوية مع ضوء 14:10: دورة الظلام. كثافة الجنين يمكن أن تؤثر على التنمية. وضع ما لا يزيد عن 100 ملم الأجنة في صحن 100 × 35 و لا يزيد عن 50 الأجنة في 60 × 15 مم طبق.
4. بنسبة 24 HPF، استبدال وسائل الإعلام مع E3B تحتوي على 200 ميكرومتر 1-2-فينيل ثيويوريا (PTU). PTU يمنع تشكيل الصباغ ويحافظ الأجنة الزرد واليرقات شفافة لتحسين وضوح الصورة. تنبيه: الأسهم PTU تتركز خطرة؛ ارتداء القفازات عند اتخاذ الحل E3B + PTU.
5. في الإخصاب آخر 1 يوم (DPF)، يدويا إزالة المشيماء من كل جنين باستخدام ملقط غرامة. لا يظهر المشيماء أن تؤثر تغلغل هرمون الاستروجين، ولكن إزالة يعزز وضوح الصورة. ليست هناك حاجة لإزالة chorions من وسائل الإعلام. ملاحظة: كبديل لdechorionation دليل، دفعات من الأجنة يمكن تشيdechorionated mically باستخدام 1 ملغ / مل pronase العلاج، كما هو موضح سابقا ^11.

2. العلاج الكيميائي للأجنة

1. اليوم قبل العلاج، وإعداد الحلول الأسهم من كل مادة كيميائية في تركيز 1،000 أضعاف في DMSO (أو المذيبات المناسبة). على سبيل المثال، لفضح الأجنة إلى 10 ميكرومتر ثنائي الفينول أ (BPA)، وإعداد محلول المخزون 10 ملي BPA في 100٪ DMSO. وهذا يضمن تركيز DMSO موحدة في كل معاملة ويسمح للغير سامة 1:1،000 التخفيف من DMSO لتكون بمثابة السيطرة على السيارة. حلول تخزين السهم عند -20 درجة مئوية. لهذا البروتوكول، سوف يتعرض الأجنة إلى 1 ميكرومتر و 10 ميكرومتر BPA، نانومتر 18.5 و 1.85 ميكرومتر الجينيستين، 367 نانومتر استراديول (مراقبة إيجابية) وسيارة (0.1٪ DMSO، ومراقبة سلبية).
   تنبيه: المواد الكيميائية مثل BPA واستراديول هي خطرة ويمكن أن يكون لها آثار ضارة على الجنين البشري. معالجة اختلال الغدد الصماء مع الرعاية ودائما استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
2. في يوم من العلاج، أعدت ذوبان المحاليل الكيميائية الأسهم. تمييع 1:1،000 بواسطة pipetting 1 مل + E3B PTU في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وإضافة 1 ميكرولتر من محلول المخزون الكيميائية. دوامة بقوة. تمييع DMSO 1:1،000 في E3B + PTU بمثابة السيطرة على السيارة. استخدام 1 مل + E3B PTU في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل كعنصر تحكم غير المعالجة.
3. باستخدام ماصة كبيرة تتحمل نقل البلاستيك، ونقل الأجنة من أطباق بتري في كل بئر من لوحة 96 جيدا، 3 أجنة لكل بئر، 3 آبار في الشرط. لمنع التبخر خلال فترة العلاج لفترات طويلة، حذفت الأجنة من الصفوف والأعمدة الخارجي من لوحة (الصفوف A و E، والأعمدة 1 و 12). يمكن ملء الآبار الخارجي مع 300 ميكرولتر من E3B + PTU. تسمية لوحة غطاء مناسب.
4. إزالة وسائل الإعلام من كل بئر مع غرامة يميل نقل البلاستيك ماصة. العمل بسرعة لتجنب جفاف الأجنة.
5. إضافة 200 ميكرولتر من محلول معالجة في المقابلة أيضا. وضع غطاء underneath لوحة كدليل لضمان إضافة العلاجات المناسبة في الآبار. دوامة كل أنبوب قبل pipetting لتوزيع هذه المادة الكيميائية في المحلول. تأكيد بصريا كل جنين في الحل العلاج. إذا الأجنة على جانب البئر، واستخدام الماصة نقل نظيفة لغسلها في البئر مع الحل العلاج.
6. وضع لوحة في الحاضنة في 28.5 درجة مئوية. وسيتم تحليل الأجنة لمضان في 72 HPF.

3. التصوير الآلي من الأجنة في لوحات 96 جيد

1. تخدير الأجنة عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 4 ملغ / مل تريكين إلى كل بئر.
   ملاحظة: تخدير الأجنة قبل التصوير. في 24-96 HPF، الزرد يحمل حركة عفوية وردود الفعل المفاجئة لمصدر الضوء المتغيرة أثناء التقاط الصور. التخدير الأجنة يقلل من الحركة أثناء التصوير.
2. وضع لوحة 96 جيدا في مرحلة الآلية ومعايرة المرحلة. باستخدام زايس زن الأزرق 2011 برنامج للفحص المجهري ومحوالسيطرة على، حدد الخيار الناقل العينة وتحديد multiwell 96. اختر معايرة. اتبع الإرشادات خطوة بخطوة لمعايرة المرحلة.
   ملاحظة: لا إلغاء الزر البلاط بعد هذه الخطوة. إذا كان الزر البلاط غير محددة، قد يتم فقدان إعدادات المعايرة وسيتعين على لوحة 96 جيدا أن تعديلها.
3. باستخدام الهدف 10X وbrightfield (BF) وضع وتحديد الجنين مراقبة إيجابية وتعيين إعدادات التعرض بشكل مناسب لBF وقنوات GFP، والتأكد من أن إشارة مضان لا تشبع الكاميرا. التركيز على الجنين واحد وبرنامج المجهر للحصول على إجمالي 3 Z-أقسام وصورة واحدة 50 ميكرون أعلاه واحدة 50 ميكرومتر تحت البؤري الحالي.
   ملاحظة: نظرا لأن أنسجة مختلفة تشغل طائرات التنسيق المختلفة، وهذا سوف يضمن ليتم التقاط كل الصور الزرد مع القلب والكبد في التركيز.
4. تعيين المعلمات البرمجيات للحصول على صورة من البلاط باستخدام GFP وBF CHANNEليرة سورية. تحت علامة التبويب الاستحواذ، حدد الإعداد المتقدمة. حدد المناطق البلاط، ثم البلاط. اختر الخيار الدائرة أيضا.
   ملاحظة: يتم استخدام التبليط لخلق صورة مركب من كل بئر. وجهة نظر ميدانية من واحد يلتقط سوى جزء صغير من كل بئر. وظيفة تبليط يمكن التقاط تلقائيا متعددة الحقول المتاخمة للرؤية من كل جانب، وخلق صورة مركبة من البئر بأكمله. وبالتالي فإنه من الممكن التقاط الصور تلقائيا 96 مركب في لوحة، حيث يحتوي كل صورة مركب عشرات الصور الفردية من بئر واحدة.
5. حدد الناقل وملء عامل 90٪. واختيار عامل تعبئة 90٪ من التقاط صور متعددة من آبار مختارة مثل التي من شأنها أن 90٪ من مساحة كل بئر تكون مرئية في الصورة المركبة.
   ملاحظة: عند اختيار عامل تعبئة، سيتم عرض رسم بياني يمثل المنطقة المراد تصويرها. تحديد النسبة التي سوف تشمل منطقة البئرغير مناسبة للتجربة.
6. ضمن خيارات، حدد مقدار التداخل المطلوب.
   ملاحظة: عند ترقيع البلاط للحصول على صورة ممثل واحد، تداخل من 5-10٪ يسمح لالتماس السلس بين الصور. ومع ذلك، إذا الصورة خياطة لا لزوم لها، وذلك باستخدام التداخل 0٪ سوف يقلل وقت التصوير. باستخدام 90٪ عامل تعبئة و 5٪ التداخل، صورة مركبة من بئر واحد يتكون من 59 الصور الفردية.
7. بدء التصوير. سوف المجهر الحصول على صور تلقائيا.
8. تفقد الصور مركب من كل بئر لمضان الأنسجة محددة (الشكل 1) يدويا.
9. ملاحظة: فمن الأفضل أن تبدأ مع مراقبة إيجابية للتأكد من أن التعرض للمواد الكيميائية عملت قبل مراقبة الآبار العلاج التجريبي.

4. دليل التقاط الصور من الأجنة في 96 لوحة جيدا

ملاحظة: لتأكيد النتائج، استخدم الهدف 20X مسافة العمل الطويلة لميلانكراس الصور أكثر تفصيلا يدويا (الشكل 2).

1. باستخدام الهدف 20X وbrightfield (BF) وضع وتحديد الجنين مراقبة إيجابية وتعيين إعدادات التعرض للقنوات BF وGFP بشكل مناسب، والتأكد من أن إشارة مضان لا تشبع الكاميرا.
2. تحديد الأجنة الفردية والتقاط الصور يدويا.
   ملاحظة: مرة واحدة وقد تم اختيار إعدادات التعرض لالجنين مراقبة إيجابية، لا تغير من الإعدادات. هذا يسمح للمقارنة بين كثافة مضان كما يتم التقاط كل صورة في ظل ظروف موحدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويبين الشكل 1 الصور المركبة من الآبار الفردية لوحة 96 جيدا. وتتكون كل صورة مركب من 59 الصور الفردية مع 5٪ صورة التداخل. لاحظ أن الزرد الحية موجهة عشوائيا داخل كل بئر، ولكن نحن قادرون على التمييز مضان في قلب من الكبد. الصور Brightfield مفيدة كمرجع لتقييم التوجه الزرد و?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يصف هذا البروتوكول وسيلة مباشرة لتلقائيا صورة مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزرد. وقد تم تطوير بروتوكول باستخدام زايس محوري المراقب. Z1 مع زن الأزرق 2011 برنامج، ولكن هذه التقنية يمكن تكييفها باستخدام أي مجهر مقلوب مع مرحلة الآلية وبرامج التحكم المجهر التي يمكن أن تؤدي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic transfer pipettes; wide bore	Fisher	13-711-23
Plastic transfer pipettes; fine tip	Fisher	13-711-26
96-well, round, flat bottom plates	Fisher	21-377-203
100 x 35 mm plates	Fisher	08-757-100D
35 x 60 mm plates	Fisher	08-757-100B
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	A5040-25G	see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629-10G	Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss		Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage
20x long working distance objective	Carl Zeiss		We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance
Axiocam HRm digital camera	Carl Zeiss
ZenBlue 2011 microscope control software	Carl Zeiss		Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage
Methylene Blue	Sigma Aldrich	MB-1; 25 grams	make 2% solution in RO water for use in E3B (below)
E3B			60X E3 SOLUTION: NaCl                    - 17.2 grams KCl                       - 0.76 grams CaCl2-2H2O     - 2.9 grams MgSO4-7H2O  - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3      150 ml 2% methylene blue     100 μl  Bring to 9 liters with Milli-Q water