JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

SIVQ-LCM هو نهج المبتكرة التي يسخر خوارزمية الكمبيوتر، مكانيا ثابتة ناقل تكميم (SIVQ)، لدفع التقاط الليزر تسليخ مجهري (LCM) العملية. سير العمل SIVQ-LCM يحسن كثيرا من سرعة ودقة تسليخ مجهري، مع تطبيقات في كل من البحوث والمرافق الصحية.

Abstract

SIVQ-LCM هو منهجية جديدة بأتمتة ويبسط عملية تشريح الليزر التي تعتمد على المستخدم أكثر تقليدية. انها تهدف الى خلق المتقدمة، تخصيص بسرعة منصة تكنولوجيا تشريح الليزر. في هذا التقرير، ونحن تصف التكامل بين برامج تحليل الصور الثابتة مكانيا ناقل تكميم (SIVQ) على الصك ArcturusXT. يحتوي على نظام ArcturusXT كلا من الأشعة تحت الحمراء (IR) والأشعة فوق البنفسجية (UV) ليزر، مما يسمح للخلية معينة أو تشريح منطقة واسعة. الهدف الرئيسي هو تحسين السرعة والدقة، واستنساخ تشريح الليزر لزيادة الإنتاجية عينة. هذا النهج رواية يسهل تسليخ مجهري كل من الحيوانات والأنسجة البشرية في مجال البحوث وسير العمل السريري.

Introduction

وضعت أصلا في منتصف 1990s، التقاط الليزر تسليخ مجهري (LCM) تمكن المستخدم من التقاط أدق خلايا معينة أو المناطق الخلوية من قسم الأنسجة النسيجية عن طريق التصور المجهرية 1، 2. العديد من الدراسات المقارنة بين التحليل الجزيئي للLCM مقابل الورطات الأنسجة توضيح قيمة الأسلوب 3-12. بالإضافة إلى ذلك، هناك ثلاثة منشورات بروتوكول الفيديو على التكنولوجيا المتوفرة للعرض 13، 14. ومع ذلك، على الرغم من قيمته ثبت، ويمكن أن تكون مملة LCM وشاقة عندما يكون الهدف من الفائدة هو السكان الخلية المتفرقة في قسم الأنسجة غير المتجانسة، أو عندما يطلب أعداد كبيرة من الخلايا للتطبيقات المصب محددة مثل البروتينات. العبء الملقى على عاتق المشغل الإنسان أدت بنا إلى وضع نهج تشريح شبه الآلي للLCM من خلال الجمع بين قوية خوارزمية تحليل الصور لتوجيه عملية LCM 15.

<ع الطبقة = "jove_content"> وبالتعاون مع جامعة ميتشيغان، مختبرنا في المعاهد الوطنية للصحة مددت وضعت سابقا وذكرت ثابتة مكانيا ناقلات تكميم (SIVQ) خوارزمية بطريقة تسمح لها شبه أتمتة عملية الاختيار الأنسجة الذاتية لل تسترشد تسليخ مجهري، وبالتالي إتاحة أداة مع الطبيب الشرعي أو عالم الحياة في الاعتبار. ثابتة مكانيا ناقلات تكميم (SIVQ) هو خوارزمية التي تسمح للمستخدم ببساطة "فوق" على ميزة النسيجية التي تهم إنشاء عصابة ناقلات (ميزة صورة أصلية) التي يمكن استخدامها للبحث في صورة النسيجية بأكمله، وضبط عتبة الإحصائية حسب الحاجة 16-21. خريطة الحرارة الناتجة يعرض نوعية المباريات إلى ميزة الصورة الأصلية الأولية ويتم تحويلها لاحقا إلى لون واحد (الأحمر) خريطة الشرح التي يمكن استيرادها إلى الصك LCM. ثم يتم استخدام البرنامج الاختيار الآلي، AutoScanXT، لرسم خريطة مقرهاعلى الشرح SIVQ في توجيه القبض على الخلايا المستهدفة من عينة الأنسجة. يصف بروتوكول مفصلة أدناه تنفيذ SIVQ في سير العمل تسليخ مجهري.

Protocol

كان يعمل بروتوكول صفها وفقا للقواعد المعاهد الوطنية للصحة على استخدام عينات الأنسجة البشرية.

1. إعداد الأنسجة

  1. قبل البداية، الحصول على عينات الأنسجة البشرية وفقا لمجلس المراجعة المؤسسية (IRB) البروتوكولات.
  2. اختيار نوع من كتلة الأنسجة / خلية والمقابلة طريقة معالجة [الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE)، والمجمدة، أو الثابتة الإيثانول (EFPE) جزءا لا يتجزأ من البارافين]. يوفر التثبيت الفورمالين الأنسجة الأمثل، تليها تثبيت الإيثانول وفلاش المجمدة. ومع ذلك، يمكن تثبيت والأنسجة طرق المعالجة تؤثر على الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، وكمية البروتين والجودة للتحليل الجزيئي المصب وينبغي النظر فيها.
  3. قطع المقاطع كتلة الأنسجة / خلية على نوع الشريحة (الزجاج، والزجاج الغشاء، أو إطار معدني الغشاء) في الاختيار. تحليل SIVQ يعمل بشكل جيد على قدم المساواة على جميع أنواع الشرائح الثلاث. يرجى ملاحظة أن الطريقة الزائفة ساترة (موضح أدناه) مع الزيلين وايثانرأ لا يمكن أن يؤديها على الشرائح غشاء إطار معدني منذ يجب مقلوب الشريحة على المسرح.
  4. حدد وصمة عار الأنسجة الكيميائية أو بناء IHC لتحديد الخلايا من الاهتمام من الخلفية. ملاحظة يمكن أن تؤثر أيضا على أساليب تلطيخ DNA، RNA، ونوعية البروتين وكمية من الأنسجة. اختبار الأنسجة بعد تلطيخ لتقييم جودة خط الأساس من الجزيئات الحيوية قبل الشروع في البروتوكول. وقد تم تنفيذ SIVQ-LCM على شرائح الأنسجة / علم الخلايا ملطخة: المناعية (IHC) مع DAB 15، المناعي، والأحمر بسرعة، دي نوفو الأحمر، الأزرق طولويدين، والهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) (بيانات غير منشورة).

2. عينة التصوير

  1. تحميل الشرائح على خشبة المسرح الآلية الصك تسليخ مجهري وإطلاق البرامج ذات الصلة. حدد خانات الاختيار لتعيين مواقف الشرائح تحميل الملفات والتأكد من الصورة الملتقطة هي ليتم حفظها بتنسيق JPEG.
  2. تحسين ايمجودة العمر عن طريق ضبط السطوع وتركيز الصورة على الشاشة، وذلك باستخدام إما عجلة التركيز اليدوي أو من خلال برامج الصك تشريح لل.
    1. باستخدام أدوات الصورة داخل البرنامج أداة تشريح، وضبط سطوع المصباح وكاميرا ربح مناسب. القيم هي المثال سطوع = 60 وكسب = 220، مع الناشر.
    2. تركز إما يدويا أو مع ميزة التركيز التلقائي في البرنامج.
  3. التقاط صورة نظرة عامة المصغرة في الشريحة لتوفير خارطة طريق لعملية تشريح.
    1. للحصول على جودة الصورة المثلى لشريحة uncoverslipped، واستخدام الناشر أدناه المكثف على الصك، أو إضافة كمية صغيرة (~ 30 ميكرولتر) إما الإيثانول أو الزيلين لتحسين مؤشر الحرارية (الزائفة ساترة). عند استخدام الزيلين، أن ندرك ويجب استخدام تدابير السلامة السامة والسليم لها، بما في ذلك استخدام غطاء الدخان ومعطف المختبر واقية، ونظارات العيون، وقفازات.
    2. لا تضع غطاء على الشريحة LCM حتى حل الإيثانول أو الزيلين وتطهيرها بالكامل أو سيتم مشوهة البوليمر على الغطاء.
  4. التنقل الشريحة والتقاط الصور من المجالات التي سيتم تشريح في 10X، 20X، 40X أو التكبير. إذا لزم الأمر، وتعزيز صورة مع البرمجيات مثل التصحيح التلقائي (في Microsoft Office مدير صورة) كما هو موضح سابقا 22. يجب التقاط الصور بصيغة JPEG للسماح لهم أن أعيد استيراد في البرنامج اختيار الآلية.

3. تحليل خوارزمية للصورة

  1. القبض على نقل الصور من أداة تسليخ مجهري إلى المجلد SIVQ. تثبيت وفتح حزم البرمجيات ArcturusXT، اوتوسكان وSIVQ على الكمبيوتر تعلق على صك تشريح. للوصول إلى البرنامج SIVQ، يرجى الاتصال بالدكتور يوليسيس باليس (ulysses@med.umich.edu).
  2. مفتوحة SIVQ وتحميل الصورة التي تم التقاطها (JPEG) من الفائدة.
  3. انتقل إلى مجال الاهتمام و / أو ضبط حجم نوافذ العرض (منفذ العرض 5 و 6). في البرنامج SIVQ، منفذ العرض 5 يظهر الصورة السابقة للتجهيز ومنفذ العرض 6 يظهر الصورة بعد المعالجة 16.
  4. اختيار حجم ناقلات حلقة وعدد الحلقات التي سيتم استخدامها.
  5. حدد ميزة الصورة الأصلية ليتم القبض عن طريق النقر على الحق في ذلك في إطار العرض 6.
  6. انقر على زر "مسح" لتحليل الصورة.
  7. ضبط الاحتمال الإحصائي للصورة مطابقة باستخدام اثنين من قضبان الانزلاق. شريط العلوي يضبط خصوصية الشاملة ناقلات، ويستخدم لاستبعاد المنطقة من الفحص الأولي (مع حساسية على النحو المحدد من قبل "ستات" متغير مختارة) التي قد تمثل المنطقة شملت المفرطة. على العكس، يستخدم أقل المنزلق لزيادة الحساسية، وبعد إجراء الفحص، بقصد زيادة المساحة التي تصنف على كونها المباراة. كل من هذه الضوابط المنزلق التهاب المسالك البوليةليز على "ستات" المتغير كما عتبة حساسية خط الأساس الأولي.
  8. لحفظ الصورة، انقر فوق "حفظ ك JPEG" (يتم حفظ الصورة الآن في ج :/ vq_test مجلد / صورة).
  9. تحليل الصورة مع الخوارزمية. الناتج من تحليل الخوارزمية يحتاج أن ينتج في صورة مشروحة لذلك لاستخدامها في SIVQ-LCM. في الوقت الحاضر، والإصدار الحالي من المحرك الأساسي SIVQ هو في مرحلة تجريبية إصدار الاختبارات مع توقع أن النسخة الإنتاج الكامل (متاح Q1) 2014 ستضم مجموعة كاملة تطوير البرمجيات (SDK) واجهة برمجة التطبيقات (API) للتكامل مبسطة المرشحات المكانية المقدم من المستخدمين وخطوات سير العمل معالجة البيانات المصب مع المحرك الأساسي حلقة مطابقة. وسيتم توزيع هذا SDK مع مجموعة كاملة من الوثائق.
    1. تأكد من أن heatmap SIVQ يتم تغيير إلى لون أحمر موحدة.
  10. تصدير الصورة. فمن الضروري لإعادة ترسيخ-الإحداثيات الموضعية في عمعاهدة الفضاء الخارجي تحليل صورة JPEG باستخدام محرر HEX للصق في رأس الملف من الصورة أداة تشريح الأصلي. ويمكن الاطلاع على البيانات المناسبة بين "بداية الصورة" علامة (عشرية 0xFF، 0xD8) وأول "تعريف الجدول تكميم" علامة (عشرية 0xFF، 0xDB).

4. تسليخ مجهري

  1. وضع غطاء LCM في مركز المنطقة من الفائدة، حيث تم القبض على الصور لتحليل SIVQ.
  2. معايرة وضبط الجودة (QC) الليزر الأشعة فوق البنفسجية / الأشعة تحت الحمراء وتحسين المعلمات، بما في ذلك الطاقة، والمدة، مواقع ليزر، وسرعة القطع الأشعة فوق البنفسجية (على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة). تنفيذ هذه المعايرة قبل إعادة المستوردة للصورة تحليلها.
  3. مفتوحة AutoScanXT (البرمجيات الاختيار الآلي) واستيراد الصورة تحليلها من ج :/ vq_test مجلد / بلدان جزر المحيط الهادئ.
  4. تدريب البرنامج الاختيار الآلي للاعتراف الشرح SIVQ وخلق خريطة تشريح.
    1. لإنشاء تريملف نينغ، حدد أربع مناطق من الفائدة (تميزت "الدوائر الزرقاء") على "طلاء أحمر" من SIVQ صورة تحليلها.
    2. حدد المناطق الخلفية (تميزت "المربعات الحمراء") التي هي في عدم تشريح.
    3. انقر على زر "تحليل" لإنشاء ملف التدريب، والتي يمكن حفظها لاستخدامات لاحقة.
  5. أداء تسليخ مجهري باستخدام (UV) وأشعة الليزر المناسب والأشعة تحت الحمراء (IR) و / أو الأشعة فوق البنفسجية.
    1. نسخ مناطق مختارة على "العيش" الصورة.
    2. في "microdissect" الأدوات، حدد التقاط الأشعة تحت الحمراء المناسبة أو أزرار القطع الأشعة فوق البنفسجية.
  6. بعد تشريح كاملة، حرك غطاء LCM إلى محطة مراقبة الجودة والتقاط صورة للتشريح الأنسجة / الخلايا. نهج آخر هو وضع غطاء على منطقة خالية في الشريحة قبل نقله إلى محطة مراقبة الجودة، وهذا يتيح للمستخدم التقاط الصور في تكبير مختلفة.
  7. التقاط صورة للمنطقة الأنسجة من الاهتمام بعد تسليخ مجهري لمواصلة تقييم ورفع الكفاءة.
  8. إذا كان قد تم تشريح الخلايا المطلوب بنجاح، انقر على زر "المرحلة الحالية" في البرنامج ArcturusXT وإزالة الغطاء LCM للشروع في إجراء استخراج الجزيئية لتحليل المصب.

النتائج

تم immunostained قسم أنسجة الثدي الإنسان FFPE لcytokeratin AE1/AE3 باستخدام بروتوكول قياسي IHC 23. بعد تلطيخ، وضعت الشريحة الأنسجة على المسرح ArcturusXT وبدأ بروتوكول SIVQ-LCM كما هو موضح أعلاه. منذ الأنسجة لا يمكن لcoverslipped تسليخ مجهري، يمكن للخلايا IHC + ملطخة يكون من الصعب تمييز بصريا (?...

Discussion

نقدم بروتوكول لتطبيق SIVQ-LCM إلى microdissect الخلايا الظهارية immunostained من FFPE أنسجة الثدي البشري. استخدام خوارزمية تحليل الصور، مثل SIVQ، يقلل من كمية التدريب العملي على الوقت اللازم لعملية تسليخ مجهري. هذا يمثل تقدما مهما محتملا للحقل منذ وقت مشغل والجهد هو عادة الحد من معدل خط...

Disclosures

مايكل ر إيميرت-باك هو المخترع على براءة اختراع عقد NIH-يغطي الليزر التقاط تسليخ مجهري ويتلقى المدفوعات القائمة على الملوك من خلال برنامج نقل تقنية المعاهد الوطنية للصحة.

Acknowledgements

وأيد هذه الدراسة في جزء من برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان، ومركز أبحاث السرطان.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Positive Charged Glass SlidesThermo Scientific4951Plus-001
Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis Sigma Aldrich247642CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.
Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, AnhydrousThe Warner-Graham Company6.505E+12CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.
Arcturus CapSure Macro LCM CapsLife TechnologiesLCM0211
ArcturusXT Laser Microdissection InstrumentLife TechnologiesARCTURUSXT
AutoScanXT SoftwareLife TechnologiesAn optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.
Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)University of MichiganThis tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]

References

  1. Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
  3. Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. (8), (2007).
  4. El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).
  5. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature. 1, 586-603 (2006).
  6. Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).
  7. Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).
  8. Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).
  9. Eberle, F. C., et al. Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).
  10. Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC medical genomics. 4, 48 (2011).
  11. Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC medical genomics. 2, 13 (2009).
  12. Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine. PloS one. 8, e53711 (2013).
  13. Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. J Vis Exp. (74), (2013).
  14. Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. (39), (2010).
  15. Hipp, J., et al. SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling. Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).
  16. Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology. J Pathol Inform. 2, 13 (2011).
  17. Hipp, J., et al. Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm. Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).
  18. Hipp, J., et al. Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification. Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).
  19. Hipp, J., et al. Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ. Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).
  20. Cheng, J., et al. Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies. Journal of pathology. 2, 37 (2011).
  21. Roy Chowdhuri, S., et al. Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples. Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).
  22. Hipp, J., et al. Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool. Journal of pathology. 2, (2011).
  23. Hanson, J. C., et al. Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments. Nature. 6, 457-467 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

89 SIVQ LCM ArcturusXT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved