JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Abstract

فيروسات يلفها تستخدم بروتينات سكرية غشاء على سطحها للتوسط الدخول إلى الخلايا المضيفة. التحليل البنيوي ثلاثي الأبعاد للبروتين سكري هذه "المسامير" في كثير من الأحيان تحديا تقنيا ولكنها مهمة لفهم المرضية الفيروسية وتصميم الأدوية. هنا، يتم تقديم بروتوكول للالفيروسي تحديد هيكل من خلال ارتفاع المتوسط ​​الحسابي لبيانات البرد الإلكترون التصوير المقطعي. الإلكترون البرد المقطعي هو أسلوب في المجهر الإلكتروني يستخدم لاستخلاص ثلاثية الأبعاد للتصوير الشعاعي الطبقي حجم عمليات إعادة البناء، أو tomograms، العينات البيولوجية متعدد الأشكال مثل الفيروسات الغشاء في دولة المجمدة-رطب شبه مواطن. هذه tomograms تكشف هياكل الفائدة في ثلاثة أبعاد، وإن كان في دقة منخفضة. المتوسط ​​الحسابي من وحدات التخزين الفرعية، أو tomograms الفرعية، هو ضروري للحصول على دقة أعلى من تكرار التفاصيل الزخارف الهيكلية، مثل ارتفاع بروتين سكري الفيروسية. نهج الحسابية مفصل لعليويرد gning والمتوسط ​​tomograms الفرعية باستخدام حزمة البرامج Jsubtomo. هذا النهج يمكن تصور هيكل بروتين سكري المسامير الفيروسية إلى قرار في حدود 20-40 ألف والدراسة من أجل الدراسة من أعلى ارتفاع إلى ارتفاع التفاعلات على غشاء الفيريون. يتم عرض نتائج نموذجية لفيروس بونيامويرا، يلفها فيروس من عائلة الفيروسات البنياوية. هذه العائلة هي مجموعة متنوعة هيكليا من مسببات الأمراض التي تشكل خطرا على صحة الإنسان والحيوان.

Introduction

الإلكترون البرد المقطعي هو أسلوب التصوير الإلكترون المجهري البرد السماح للحساب وثلاثي الأبعاد (3D) اعادة اعمار العينات البيولوجية المعقدة. وتتراوح عينات مناسبة من مجمعات تنقية الجزيئات 1، 2 خيوط، حويصلات المغلفة 3، والفيروسات غشاء متعدد الأشكال 4 إلى خلايا أولية النواة كلها 5 وحتى المناطق رقيقة من الخلايا حقيقية النواة كلها 6. بعد جمع البيانات من سلسلة الميل، وحجم المقطعي 3D، أو tomograms، قد تحسب باستخدام العديد من حزم البرامج المعمول بها، بما في ذلك Bsoft 7 و 8 IMOD.

جانبين الملازمة لدراسة العينات البيولوجية بواسطة الحد الإلكترون البرد المقطعي التفسير البيولوجي للمجلدات المقطعي المقابلة. أولا، بسبب جرعة الإلكترون المحدودة التي يمكن تطبيقها على المواد البيولوجية قبل إدخال أضرار الأشعة كبير، SIGNAل إلى الضجيج في نسب البيانات للتصوير الشعاعي الطبقي وعادة ما تكون منخفضة جدا. ثانيا، نتيجة عينة محدودة الهندسة الميل أثناء جمع البيانات، بعض وجهات النظر من وجوه لا تزال غائبة، مما يؤدي إلى ما يسمى قطعة أثرية "إسفين مفقود 'في حجم المقطعي. ومع ذلك، كل من هذه القيود يمكن التغلب عليها إذا كان حجم المقطعي يحتوي على تكرار هياكل مماثلة، مثل المجمعات الجزيئات، التي يمكن أن تكون بنجاح متوسط ​​9-12.

قبل المتوسط ​​من إعادة بناء هياكل مقطعية، والأشياء ذات الأهمية يجب إيجاد ومحاذاة إلى نفس التوجه. تحديد مكان هذه الهياكل يمكن تحقيقه عن طريق عبر الارتباط من هيكل القالب في حجم المقطعي باستخدام نهج غالبا ما يشار الى قالب مطابقة 13. القالب المستخدم في هذه العملية مطابقة يمكن أن تستمد من الإلكترون المجهري البرد أو البرد الإلكترون التصوير المقطعي جنبا إلى جنب مع 3D إعادة الإعمار، أو أنها يمكن أن تكون خريطة كثافة محاكاة منهيكل الذري. وقد وضعت عدة مجموعات الحسابية لتنفيذ هذه المهام 11.

في المتوسط ​​من ارتفاع بروتين سكري من الفيروسات الغشاء، مثل HIV-1، وكان نهجا ناجحا بشكل خاص لدراسة بنيتها 14-16. فهم جزء لا يتجزأ هيكل للكشف عن كل من الأساس الجزيئي للفيروس التفاعلات المضيف وتوجيه التنمية تصميم المضادة للفيروسات واللقاحات. بينما البلورات الجزيئات هو الأسلوب المفضل لعالية الدقة (عادة أفضل من 4 Å) التحليل البنيوي من البروتينات السكرية الفيروسية الفردية والمجمعات، والهياكل الأشعة السينية الناتجة من هذه الطريقة هي من البروتينات المعزولة من البيئة الطبيعية غشائي على الفيريون . وبالتالي، تفاصيل مهمة مثل الهندسة المعمارية ترتيب أعلى من البروتينات السكرية الفيروسية، في سياق الفيريون، تبقى موجودة. من ناحية أخرى، والإلكترون المجهري البرد وإعادة الإعمار جسيم واحدمن الفيروسات يلفها بالكامل يقتصر على virions مع التماثل متعدد السطوح 17،18. وهكذا ظهرت الإلكترون cryotomography جنبا إلى جنب مع المحاذاة حجم الفرعي كتقنية مكملة السماح دراسة طفرات بروتين سكري من غير منتظمة الشكل، والفيروسات متعدد الأشكال في الموقع.

قمنا بتطوير برنامج يدعى Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) للكشف، والمحاذاة، والمتوسط ​​للتصوير الشعاعي الطبقي مجلدات فرعية. وقد استخدمت Jsubtomo في تحديد هيكل عدد من الهياكل الخلوية والفيروسية 19-26. هنا، ونحن الخطوط العريضة لبروتوكول مفصلة، ​​والتي تمكن من تحديد الهياكل ارتفاع الفيروسي أرض. للتحايل على مدى صقل الهياكل المتوسط ​​عن طريق الربط بين الضجيج، واعتمد مخطط "الذهب القياسية" صقل 10،27. أخيرا، وتناقش استراتيجيات التصور وتفسير النتائج النموذجية.

Protocol

ويبين بروتوكول مفصل لمحاذاة الحسابية والمتوسط ​​لاحق من طفرات بروتين سكري الفيروسية. بروتوكول يتبع سير العمل موضح في الشكل (1) ويجمع بين البحث الآلي للطفرات باستخدام هياكل قالب الأولية وبنية صقل الذهب القياسية.

إدخال البيانات لهذا البروتوكول هو مجموعة من عمليات إعادة البناء تصوير الشعاعي الطبقي من virions. مقطعية واحدة يحتوي على واحد أو أكثر من virions. في البداية، مجموعة فرعية صغيرة من المسامير يتم انتقاؤها وكانت حوالي وصقل نموذجين مستقلة يدويا. وتستخدم هذه النماذج لتحديد موقع تلقائيا المسامير على كل من virions. أخيرا، يتم تشغيل اثنين من التحسينات مستقلة وتتم مقارنة المتوسطات الناتجة عنها، والجمع بين لإنتاج الهيكل النهائي.

ويتجلى النهج الصقل باستخدام البرامج من حزمة Jsubtomo. وتستخدم البرامج من حزمة Bsoft 28 للصورة العامة صيستخدم و rocessing المهام والرسومات الجزيئية حزمة UCSF الوهم 29 إلى تصور النتائج. يتم الرمز أسماء البرامج الفردية تعطى بخط مائل وتنسيقات الملفات مع ملحقات اسم الملف الكبيرة.

figure-protocol-1257
الشكل 1:. الاستراتيجية العامة لتحديد هياكل من بروتين سكري المجمعات ارتفاع من الفيروسات غشاء متعدد الأشكال والأرقام تتوافق مع الأقسام المختلفة في بروتوكول الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. استخراج الفيروسات مجلدات الفرعية من كامل حجم Tomograms

  1. اختيار جزيئات الفيروس يدويا في tomograms.
    1. فتح ملف مقطعية في bshow. تحديد مركز تنسيق لفيروس particلو باستخدام أداة التقاط الجسيمات. كرر هذه الخطوة حتى يتم معالجة كافة virions. ينسق حفظ الفيروس في ملف النجوم.
    2. كرر الخطوة 1.1.1 حتى يتم معالجة كافة tomograms. جعل علما قطر الفيريون بالبكسل.
      ملاحظة: إذا المسامير من الصعب أن نرى في tomograms، استخدم bfilter لتمرير منخفض تصفية tomograms إلى 80 قرارا (المعلمة "-bandpass 80،10000").
  2. تشغيل jsubtomo.py في وضع مستخلص (المعلمة "استخراج --mode") لاستخراج كميات الفيريون الفرعية لملفات حجم الفردية. استخدام الملفات ستار بحفظه في الخطوة 1.1.1 وملفات الإدخال.
    1. إعطاء حجم (المعلمة "--size") ~ 25٪ أكبر من أكبر الفيريون في مجموعة البيانات. على سبيل المثال، إذا كان الفيريون هو ~ 200 بكسل في القطر، واستخدام حجم 250 × 250 × 250 بكسل.
    2. سوف ملفات الإخراج وحدات التخزين الفيريون يكون في MAP-الشكل. وبالإضافة إلى ذلك، إنشاء المرافق STAR-ملف لكل وحدة تخزين الفيريون (parameثالثا "--output").
  3. تطبيع حجم الفيريون في BIMG (المعلمة "0،1 -rescale").

2. من الجيل الثاني المستقلة النماذج الأولية

  1. اختيار مجموعة فرعية من المسامير في مجلدات فرعية الفيريون.
    1. فتح ملف MAP الفيريون الفرعية في حجم bshow. تحديد مركز تنسيق لارتفاع باستخدام أداة الجسيمات قطف، يمكن الوصول إليها عن طريق نافذة مربع الأدوات. كرر هذه الخطوة حتى يتم معالجة كافة طفرات متميزة بوضوح. حفظ بتنسيق ارتفاع في ملف النجوم.
    2. إذا لزم الأمر، كرر الخطوة 2.1.1 لvirions أخرى إلى أن يتم معالجة حوالي 200 طفرات بروتين سكري. ملاحظة أبعاد الارتفاع بالبكسل.
      ملاحظة: ~ 200 المسامير هي المبدأ التوجيهي الخام وأكثر من ذلك قد تكون هناك حاجة لبعض التطبيقات. إذا كان ذلك ممكنا، وتهدف لاختيار المسامير في اتجاهات مختلفة. تجنب اختيار أعلى وجهات النظر فقط.
  2. تعيين ناقلات الرأي الأولي إلى المسامير عن طريق تشغيل jviews.pذ. استخدام الملفات ستار إنشاؤها في الخطوة 2.1.1 وملفات الإدخال.
    ملاحظة: هذا الرأي ناقلات يقارب اتجاه ارتفاع مع الإشارة إلى الفيريون.
    1. استخدام تنسيق مركزية لتعيين وجهات النظر لالفيريون كروية. على سبيل المثال، إذا يتركز الفيريون (بعد الخطوة 1.2) في علبة بحجم 250 × 250 × 250 بكسل، ووسط تنسيق غير 125125125 بكسل (الخيار "--Radial 125125125").
    2. لتعيين الآراء لالفيريون الخيطية، فتح كل الفيريون حجم الفرعية في bshow باستخدام ملف ستار المعرفة في الخطوة 2.1.1 وملف الإدخال. تحديد نقطتين نهاية خيوط باستخدام أداة التقاط خيوط وحفظ الملف النجوم. كرر هذه الخطوة حتى يتم تحديث كافة ملفات نجوم وتشغيل jviews.py باستخدام ملفات ستار تحديث كملفات المدخلات (--option القطاع).
  3. توليد قناع الفضاء الحقيقي باستخدام jsubtomo_create_mask.py. تأكد من أن قناع الفضاء الحقيقي هو من نفس dimensأيونات كما ستستخدم لهيكل المتوسط ​​(انظر 2.6.2) وكبيرة بما يكفي لاحتواء كل من ارتفاع ورقعة من الغشاء الأساسي.
  4. توليد قناع الفضاء المتبادل باستخدام jsubtomo_create_wedgemask.py. يستخدم قناع الفضاء المتبادل لاستبعاد المناطق في 'إسفين مفقود' المنطقة الناتجة عن محور واحد جمع البيانات الشعاعي الطبقي. ضمان أن تكون من نفس الأبعاد كما سيتم استخدامها لهيكل المتوسط ​​(انظر 2.6.2).
  5. إنشاء ملف اختيار (ملف SEL) تحديد virions ينتمون إلى مجموعات "1" و "2" باستخدام jsubtomo_evenodd.py والملفات ستار إنشاؤها في الخطوة 2.2.
  6. توليد متوسطين الأولية باستخدام jsubtomo_create_averages.py.
    1. استخدام ملف SEL إنشاؤها في الخطوة 2.5 مثل ملف الإدخال.
    2. إعطاء حجم (المعلمة "--size") 32 بكسل على الأقل أكبر من البعد أكبر من الارتفاع. على سبيل المثال، إذا كان ارتفاع هو ~ 40 بكسل طويلة، استخدام حجم 72 × 72 × 72 بكسل.
    3. تطبيق التماثل عالية (على سبيل المثال، C100) إلى المتوسطات (المعلمة "C100 --symmetry")، لتقريب متوسط ​​أسطواني حول المحور الطويل للارتفاع. استخدام symmetrization للحد من الضوضاء في المعدلات الأولية.
    4. توفير اسم فريد لملفات الإخراج للمشروع (المعلمة "--suffix").
    5. استخدام قناع الفضاء الحقيقي إنشاؤها في الخطوة 2.3 لإخفاء بعيدا الخلفية (المعلمة "--mask"). استخدام قناع الفضاء المتبادل إنشاؤها في الخطوة 2.4 لحساب فقدان إشارة عرضته وجود إسفين المفقود (المعلمة "--Mask").

محاذاة التكرارية 3. الذهب القياسية والمتوسطات من اثنين من النماذج الأولية سبايك

محاذاة تكرارا ومتوسط ​​اثنين من النماذج الأولية ولدت في القسم 2 مع jsubtomo_iterate_gold.py.

  1. مرحلة I. إن الهدف من هذه المرحلة هو لصقلاتجاه الرأي النواقل. ملف الإدخال هو ملف SEL إنشاؤها في الخطوة 2.5.
    1. استخدام العينات الزاوي 8 درجة (المعلمة "--angles 8،8،8").
    2. السماح بالتغييرات 16 درجة في اتجاه وجهة ارتفاع ناقلات (المعلمة "--thetaphilimit 16") ولكن يبقى زاوية حول ارتفاع المحور الطويل ثابتة (المعلمة "--alphalimit 0").
    3. سماح التحولات متعدية صغيرة (على سبيل المثال، 5 بكسل) لمراعاة عدم دقة في قطف اليدوي للكعب (المعلمة "--shiftlimit 5").
    4. تطبيق التماثل عالية (على سبيل المثال، C100) إلى المتوسطات (المعلمة "C100 --symmetry")، لتقريب متوسط ​​أسطواني حول المحور الطويل للارتفاع.
      يستخدم Symmetrization للحد من الضوضاء في المتوسطات: ملاحظة.
    5. استخدام قناع الفضاء الحقيقي وقناع الفضاء المتبادل ولدت في الخطوات 2.3 و 2.4 لإخفاء بعيدا المسامير المحيطة والحساب لإسفين مفقودة (معلمات "--mتسأل "و" --Mask "، على التوالي).
    6. استخدام الملفات MAP اثنين ولدت في 2.6 (الرمز بالسمات "حتى" و "الغريب" في اسم الملف) كقوالب (معلمات "--Template1" و "--Template2"، على التوالي).
    7. تطبيق مرشح تمرير منخفض في 50 قرارا (المعلمة "--resolution") لمنع التحيز المحاذاة.
    8. تطبيق عامل من 2 بن لتسريع الصقل (المعلمة "--bin 2").
    9. تشغيل 5 تكرارات المواءمة والمتوسط ​​(معلمات "--firstiter 1 --lastiter 5").
  2. المرحلة الثانية. الهدف من هذه المرحلة هو لتحسين زاوية عرض حول النواقل. ملف الإدخال هو ملف SEL الناتج من الخطوة 3.1.9.
    1. قياس أبعاد دقيقة للارتفاع خلال فتح المنخفضة تمرير ملف MAP تصفيتها ولدت في التكرار الماضي في الخطوة 3.1.9 (الرمز بواسطة البطاقات "_lp" في اسم الملف) في bshow. توليد حقيقي جديدقناع الفضاء بالمثل 2.3 إلى الخطوة التي تحدد ارتفاع لكنه يستثني معظم الغشاء المجاورة والمسامير.
      ملاحظة: الحجم الأمثل للقناع يعتمد على حجم وملامح من ارتفاع.
    2. استخدام 8 درجة أخذ العينات الزاوي (المعلمة "--angles 8،8،8") كما كان من قبل.
    3. السماح بالتغييرات 180 درجة في زاوية حول ناقلات رأي سنبلة (المعلمة "- alphalimit 180") ولكن الحفاظ على ثيتا والزوايا الثابتة PHI (المعلمة "--thetaphilimit 0").
    4. لا تسمح لأي تحولات متعدية (المعلمة "--shiftlimit 0").
    5. لا تنطبق على أي التماثل المتوسطات (حذف المعلمة "--symmetry").
    6. استخدام قناع الفضاء المتبادل إنشاؤها في الخطوة 2.4 لحساب إسفين في عداد المفقودين.
    7. استخدام الملفات MAP اثنين ولدت في التكرار الأخير من خطوة 3.1.9 دون التماثل (الرمز بالسمات "even_nosym" و "odd_nosym" في اسم الملف) كقوالب (معلمات R20؛ - Template1 "و" --Template2 "، على التوالي).
    8. تطبيق مرشح تمرير منخفض في 50 قرارا (المعلمة "--resolution") في التكرار الأول لمنع التحيز المحاذاة. ضبط المعلمات مرشح في التكرارات اللاحقة تلقائيا (المعلمة "--adaptivefilter") على أساس معيار الذهب فورييه شل الارتباط (FSC) بين اثنين من المتوسطات مستقلة. استخدام معيار 0.143-(المعلمة "--fsccrit 0.143"). لا تسمح صقل الماضي أول الصفر وظيفة نقل النقيض (CTF) (المعلمة "--minhires")، إلا إذا تم تطبيق التصحيح CTF إلى tomograms.
    9. تشغيل 5-10 تكرار المواءمة والمتوسط ​​(على سبيل المثال، المعلمات "--firstiter 6 --lastiter 15"). رصد التغيرات في القرار المبلغ عنها. عندما يلاحظ أي تغييرات كبيرة، يمكن إيقاف العملية.
  3. تقييم درجة التماثل في بنية بواسطة examiniنانوغرام الناتجة المنخفضة تمرير ملف MAP تصفيتها (الرمز بواسطة البطاقات "_lp" في اسم الملف) في الوهم. على سبيل المثال، إذا كان ارتفاع هو مجمع مثلوثي، ينبغي أن يكون التماثل 3 أضعاف واضح.
  4. المرحلة الثالثة. الهدف من هذه المرحلة هو لتحسين زاوية عرض حول ناقلات أخرى مع التماثل الصحيح. ملف الإدخال هو ملف SEL الناتج من الخطوة 3.2.9. المعلمات هي نفسها كما في الخطوة 3.2 مع وجود استثناءات قليلة:
    1. تسمح التغييرات المناسبة في زاوية الرأي حول ارتفاع النواقل. على سبيل المثال، إذا كان لديه هيكل التماثل 3 أضعاف، تسمح التغييرات من 60 درجة في زاوية ألفا (المعلمة "--alphalimit 60").
    2. تطبيق التماثل الصحيح (على سبيل المثال، C3) إلى المتوسطات (المعلمة --symmetry C3 ").
    3. استخدام الملفات MAP اثنين ولدت في التكرار الماضي في الخطوة 3.2.9 (الرمز بالسمات "حتى" و "غريبة" في اسم الملف) وملفات قالب المدخلات (معلمات "--Template1" و--Template2).
    4. تشغيل 5-10 تكرار المواءمة والمتوسط ​​(على سبيل المثال، المعلمات "--firstiter 16 --lastiter 25"). رصد التغيرات في القرار المبلغ عنها. عندما يلاحظ أي تغييرات كبيرة، يمكن إيقاف العملية.
  5. المرحلة الرابعة. الهدف من هذه المرحلة هو لصقل بدقة جميع الزوايا الثلاثة في وقت واحد. ملف الإدخال هو ملف SEL الناتج من الخطوة 3.4.4. المعلمات هي نفسها كما في الخطوة 3.4 مع وجود استثناءات قليلة:
    1. السماح بالتغييرات 8 درجة في زاوية الرأي حول ارتفاع ناقلات (المعلمة "- alphalimit 8") والتغيرات 8 درجة في اتجاه وجهة ارتفاع ناقلات (المعلمة "--thetaphilimit 8"). صقل توجهات لدقة 4 درجة (معلمات "--angles 8،8،8 --iterate 2").
    2. تسمح تحولات صغيرة (على سبيل المثال، 5 بكسل) لحساب عدم دقة في الخطوات السابقة المحاذاة (المعلمة "--shiftlimit 5").
    3. Uحد ذاتها الملفات MAP اثنين ولدت في التكرار الماضي في الخطوة 3.4.4 (تدل بالسمات "حتى" و "الغريب" في اسم الملف) وملفات قالب المدخلات (معلمات "--Template1" و--Template2).
    4. تشغيل 5-10 تكرار المواءمة والمتوسط ​​(على سبيل المثال، المعلمات "--firstiter 26 --lastiter 35"). رصد التغيرات في القرار المبلغ عنها. عندما يلاحظ أي تغييرات كبيرة، يمكن إيقاف العملية.

4. الجيل والمواءمة من بذور للفيروس السطحية لقالب مطابقة

  1. توليد البذور تقع بالتساوي على سطح الفيريون لقالب مطابقة وتعيين ناقلات عرض أولي للبذور عن طريق تشغيل jviews.py. استخدام الملفات ستار إنشاؤها في الخطوة 1.2.2 وملفات الإدخال. توليد ما يقرب من 1.5 مرات أكثر البذور من العدد المتوقع من المسامير.
    ملاحظة: هذا الرأي ناقلات يقارب اتجاه ارتفاع الأقرب إلى كل نقطة البذور.
    1. لتوليد البذور موزعة بالتساوي على الفيريون كروية تقريبا (المعلمة "--Even")، وإعطاء دائرة نصف قطرها (المعلمة "--radius")، والفصل الزاوي (على سبيل المثال، 20 درجة) من البذور (المعلمة "--angle 20" ) ووسط تنسيق من الفيريون. على سبيل المثال، إذا يتركز الفيريون (بعد الخطوة 1.2) في علبة بحجم 250 × 250 × 250 بكسل، ووسط تنسيق غير 125125125 بكسل (الخيار "--origin 125125125") .
    2. لتوليد البذور موزعة بالتساوي على الجسيمات الخيطية، استخدم المعلمة "--Filament" وتحديد كل دائرة نصف قطرها والمعلمات التماثل حلزونية (صعود وتطور).
      ملاحظة: يتم استخدام المعلمات التماثل حلزونية هنا فقط كوسيلة مريحة لتحديد المواقف البذور موزعة بالتساوي وأنها لا تحتاج لتعكس الترتيب الفعلي للطفرات على خيوط.
  2. توليد متوسطين مستقلة من سطح الفيروس كما explaineد في القسم 2.
    1. إنشاء ملف تعريف SEL virions ينتمون إلى مجموعات "1" و "2" باستخدام jsubtomo_evenodd.py والملفات ستار إنشاؤها في الخطوة 4.1.
      ملاحظة: لضمان استقلال مجموعات البيانات، أي التنازل السابق للvirions إلى مجموعات يجب "1" و "2" تبقى نفسها.
  3. حدد موقف البذور.
    1. اتبع الإرشادات في الخطوة 3.1 ما لم يذكر خلاف ذلك. استخدام ملف SEL إنشاؤها في الخطوة 4.2.1 وملف الإدخال.
    2. السماح للبذور لتحويل فقط على طول الطبيعي أن الغشاء (المعلمة "--zshiftlimit"). ضبط المبلغ المسموح به من التحول تبعا لمدى تنحرف عن virions من الهندسة الكروية المثالية (على سبيل المثال، --zshiftlimit المعلمة 25 ").
    3. استخدام الملفات MAP اثنين إنشاؤها في الخطوة 4.2 (الرمز بالسمات "حتى" و "الغريب" في اسم الملف) وملفات قالب المدخلات (معلمات "--Template1 "و--Template2).
    4. استخدام لاحقة فريدة لتجنب الكتابة فوق الملفات ستار المدخلات الأصلي (على سبيل المثال، المعلمة "--suffix _seeds").
    5. استخدام binning من 4 إلى تسريع العملية الحسابية (المعلمة "--bin 4") ومرشح تمرير منخفض (مثل المعلمة "--resolution 50").
  4. إنشاء ملفات علامة الوهم (CMM) من الملفات المكررة ستار البذور باستخدام jviews.py (المعلمة "--cmm"). فحص البذور عن طريق فتح ملفات CMM (والملفات المرتبطة الفيريون MAP) في الوهم. تأكد من أن بذور المكررة يتم محاذاة بشكل صحيح النسبي لغشاء الفيروس.
    ملاحظة: ألوان مختلفة يمكن استخدامها للتمييز بين مجموعات منفصلة من علامات (المعلمة "--color"). بدلا من علامات المكررة يمكن الملونة استنادا على الصليب معامل الارتباط (على سبيل المثال، المعلمة "--fomcolor 0.1،0.3").

5. الذهب قائممحاذاة ارض التكرارية والمتوسطات للهيكل سبايك

تحديد موقع تلقائيا كل المسامير في الفيريون مجلدات فرعية باستخدام القالب المحلي مطابقة حول البذور المكررة ومواءمة والمتوسط ​​المسامير الموجودة. استخدام المتوسطات الناتجة عن مجموعة فرعية من المسامير اختار يدويا كقوالب الأولية.

  1. أداء القالب المحلي مطابقة حول البذور في المتوسط ​​كل المسامير باستخدام jsubtomo_iterate_gold.py البرنامج. اتبع الإرشادات في الخطوة 3.5 ما لم يذكر خلاف ذلك.
    1. ملف الإدخال هو ملف SEL للبذور المكررة إنشاؤها في الخطوة 4.3.
    2. استخدام حد كبير بما فيه الكفاية لزاوية عرض النواقل. على سبيل المثال، إذا تم إنشاؤها البذور كل 20 درجة (الخطوة 4.1)، استخدم زاوية أكبر قليلا من نصف هذه القيمة (المعلمة "--thetaphilimit 12"). تسمح التغييرات المناسبة في زاوية الرأي حول ارتفاع النواقل.
    3. تسمح بذور للتحول في الطائرة من غشاء (معلمة"--xyshiftlimit"). على سبيل المثال، إذا كانت المسافة البذور إلى البذور هي 25 بكسل، استخدم التحول الكلي أكثر قليلا من نصف هذا (على سبيل المثال، المعلمات "--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10").
      قد تكون هناك حاجة إضافية التحولات متعدية إذا تتركز الملفات MAP إنشاؤها في الخطوة 3.5 على مسافة مختلفة من وسط الفيريون من البذور: ملاحظة.
    4. استخدام الملفات MAP اثنين إنشاؤها في الخطوة 3.5 (الرمز بالسمات "حتى" و "الغريب" في اسم الملف) وملفات قالب المدخلات (معلمات "--Template1" و--Template2).
    5. استخدام القرار الحالي من الملفات MAP إنشاؤها في الخطوة 3.5 (المعلمة --resolution).
    6. تشغيل 5-10 تكرارات من قالب مطابق، والمحاذاة والمتوسط ​​(على سبيل المثال، المعلمات "--firstiter 1 --lastiter 10"). رصد التغيرات في القرار المبلغ عنها. عندما يلاحظ أي تغييرات كبيرة، يمكن إيقاف العملية.
    7. بعد كل التكراراستبعاد تداخل الفعالية. على سبيل المثال، إذا كان العرض من ارتفاع 30 بكسل، استبعاد النقرات التي هي أقرب من 30 بكسل إلى الضربات الأخرى (المعلمة "--mindist 30").
    8. استبعاد النقرات مع انخفاض الارتباط عبر التعاون الفعال. على سبيل المثال، تشمل أفضل المسامير 75٪ لكل الفيريون (المعلمة "--topp 75").
      ملاحظة: الفعالية مع انخفاض الارتباط عبر التعاون كفاءة من المحتمل أن تمثل الفعالية إيجابية كاذبة.

6. التصور من نتائج

  1. فتح هيكل المكرر من ارتفاع في الوهم التصور وتركيب هياكل ذرية.
    1. استخدام المنخفضة تمرير ملف MAP تصفيتها (الرمز بواسطة البطاقات "ليرة لبنانية") التي تم إنشاؤها في التكرار النهائي في الخطوة 5.1.6 وملف الإدخال.
    2. استخدام الدقة المشار إليها في خطوة ل5.1.6 عبر الارتباط القائم المناسب في الوهم "صالح في خريطة" أداة.
  2. خلق نموذج مركب من virioن استخدام jsubtomo_create_model.py.
    1. استخدام المنخفضة تمرير ملف MAP تصفيتها (الرمز بواسطة البطاقات "ليرة لبنانية") التي تم إنشاؤها في التكرار النهائي في الخطوة 5.1.6 وملف الإدخال خطة عمل البحر المتوسط ​​(المعلمة "--Template").
    2. استخدام ملف ستار ولدت في التكرار النهائي في الخطوة 5.1.6 وملف الإدخال النجوم.
    3. استخدام ملف قناع إنشاؤها في الخطوة 3.2.1 لحساب كثافة التداخل في نموذج مركب (المعلمة "--mask").
    4. تشير إلى حجم الملف الفيريون خريطة لتوليد نموذج مركب من نفس الحجم (المعلمة "--size").
  3. فتح نموذج مركب لتصور في الوهم.

النتائج

نحن لشرح تطبيق سير العمل المتوسط-مقطعية الفرعية المذكورة أعلاه للمجمع المغلف بروتين سكري فيروس بونيامويرا (Orthobunyavirus، الفيروسات البنياوية) باستخدام البيانات المنشورة من قبل مجموعة 24. وترد المعلمات جمع البيانات والصقل في الجدول 1. يظهر أحد مقطعية تمثيلي في الشكل 2.

المعلمة (وحدة) قيمة
جمع البيانات
الجهد (كيلو فولت) 300
التكبير معايرة (X) 111،000
حجم بكسل (Å) 5.4
جرعة تقدر (ه - / 2) 100
Underfocus (ميكرومتر) 4.0-4.5
تمويل الإرهاب الصفر الأول (أ) 26-30
مجموعة الميل (درجة) -60-60
الميل أخذ العينات (°) 3
البيانات والصقل
Tomograms 11
Virions 29
البذور في الفيريون 106
إجمالي عدد البذور 3،074
الكشف عن المسامير 1،346
المسامير بعد إزالة التداخلات 1،401
المسامير بعد اختيار عبر الارتباط القائم 1،022
المسامير المدرجة في المعدل النهائي 1،022
التماثل C3
أخذ العينات الزاوي (درجة) 8
قرارالنطاق المستخدم في صقل (Å) 42-334
قرار التقدير النهائي (Å) ب 35

الجدول 1: جمع البيانات والإحصاءات بونيامويرا الصقل.
وCTF، نقل وظيفة التباين.
ب المحسوبة باستخدام فورييه قذيفة العلاقة بين هيكلين المكررة بشكل مستقل على عتبة 0.143.

figure-results-2255
يشار إلى شريحة مقطعية من خلال virions بونيامويرا عدة آراء الجانب ارتفاع واضح في هامش كل الفيريون مع النصال: الشكل 2. كانت مقطعية المنخفضة تمرير تصفيتها إلى 60 Å. مقياس شريط 100 نانومتر.

أولا، نحن المكرر نموذج أولي باستخدام المسامير 205 التقطت يدويا ( الشكل 3). كان التماثل ثلاثة أضعاف من مركز أقصى ارتفاع واضح دون تطبيق أي التماثل (الشكل 3B) وفرض في الجولات اللاحقة من الصقل (الشكل 3C). للكشف عن جميع المسامير تلقائيا على أسطح الفيريون، فإننا لدت 106 بذور لكل الفيريون في دائرة نصف قطرها 43 نانومتر والمباعدة بين 20 درجة (الشكل 4A) والمكرر تكرارا مواقفها بالنسبة إلى غشاء (الشكل 4B).

figure-results-3239
الشكل 3: صقل هيكل القالب الأولي. (A) إسطوانيا المتوسط ​​(C100) قالب شيدت من المواقف المحددة يدويا من المسامير. (B) وبلغ متوسط ​​الكثافة بعد خمس جولات من الصقل دون أي التماثل (C1) المفروض يعرض مع ارتفاع ثلاثة أضعافميزات متماثل. القرار من هذا النموذج هو 48 Å. تم حلها (C) من متوسط ​​الارتفاع في 41 Å بعد خمس جولات من الصقل مع تماثل ثلاثة أضعاف.

figure-results-3853
وتظهر صقل بذور AB) مجموعة فرعية من البذور قبل (A) وبعد (B) الصقل على كثافة الفيريون واحد من البذور في الشكل 2 (B) كانت مرمزة على أساس العابرة منها: الشكل 4. معاملات الارتباط (الأزرق، والارتباط المنخفض، والأحمر، والارتباط مرتفع).

واستخدمت لحساب المعدل النهائي، وأفضل ربط بروتين سكري بقع سنبلة (~ 1،000 المسامير أعلى 75٪ بعد إزالة التداخل). تم حل المتوسط ​​إلى 35 قرارا (الشكل 5). وكشف هيكل ارتفاع مثلوثي في ​​الوسط، فيبالإضافة إلى مساهمة بعض من المسامير ستة المجاورة. نماذج مركبة من virions، وتحسب عن طريق وضع هيكل في المواقف المعروفة، كشف وضع المسامير على سطح الفيريون (الشكل 6A). في بعض الأحيان، كانت بقع أمر محليا من المسامير واضحة (الشكل 6B).

figure-results-4890
الرقم 5: هيكل المكرر من رقعة من طبقة بروتين سكري ارتفاع القالب بعد مطابقة. وترد (AB) اثنين من خرائط "حتى" و "الغريب"، بناؤها من نصفين من البيانات. تظهر الخرائط اثنين درجة كبيرة من التشابه، والتحقق من validness النهج. التوجه حول محور ارتفاع الطويل هو مختلف حيث تم بناؤها الخرائط اثنين بالكامل بشكل مستقل عن بعضها البعض. يظهر (C) متوسط ​​الخرائط اثنين علىالقرار النهائي من 35 Å.

figure-results-5521
الرقم 6: تنسيب المسامير على الفيريون بونيامويرا. (A) نموذج مركب من الفيريون. عرض نواقل (العصي) تشير توجهات المسامير. الألوان تشير إلى الارتباط المتبادل بين كل مسمار وهيكل قالب (الأزرق، والارتباط المنخفض، والأحمر، والارتباط مرتفع). (ب) عن قرب من التصحيح أمر من المسامير.

Discussion

معرفة الفيروسي هيكل بروتين سكري ارتفاع على غشاء الفيريون ضروري لفهم تكاثر الفيروس وتطوير علاجات لعلاج ومنع العدوى. وقد برز الإلكترون المجهري البرد جنبا إلى جنب مع واحد المتوسط ​​الجسيمات كأسلوب الأكثر استخداما على حل هياكل جزيئات الفيروس يلفها، بما في ذلك ارتفاع بروتين سكري. ومع ذلك، هذا الأسلوب يقتصر على icosahedrally الفيروسات متماثل. هنا، من خلال تطبيق الإلكترون البرد المقطعي وsubtomogram المتوسط ​​في Jsubtomo، وقد أوجزنا بروتوكول عام لتحديد طفرات بروتين سكري متعدد الأشكال على يلفها الفيروسات التي ليست قابلة للطرق البيولوجيا الهيكلية الحالية الأخرى. وتظهر نتائجنا التمثيلية أن حل هذه الطريقة كافية لتكشف عن نظرة ثاقبة العمارة المجال oligomerization، وارتفاع التنظيم ترتيب طفرات بروتين سكري على virions سليمة.

jove_content "> الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو بناء نموذجين انطلاق موثوقة أن تكون مستقلة إحصائيا عن بعضها البعض. التنفيذ الناجح لهذه الخطوة يفترض أن ارتفاع بروتين سكري هي كبيرة بما فيه الكفاية وليس ضد بعضهم البعض معبأة بإحكام جدا، بحيث يمكن طفرات فردية يتم الاعتراف بصريا ويدويا التقطت في tomograms، وبلغ متوسط ​​نموذجين مستقلة. إذا لم يكن هذا ممكنا، وهما تعديلات على بروتوكول يمكن حاول أولا، نموذجين عشوائية مستقلة يمكن بناؤها من خلال تحديد أول اثنين من مجموعات فرعية عشوائية من subtomograms ثم حساب متوسط ​​subtomograms داخل هذه المجموعات الفرعية 30. ثانيا، إذا استمدت هيكل من ارتفاع معزولة بوسائل أخرى، على سبيل المثال بواسطة البلورات بالأشعة السينية، يمكن استخدامه كنموذج البداية، ولكن يجب توخي الحذر لالمنخفض مرشح تمرير هذا النموذج باستخدام منخفضة الدقة قطع (50-70 أ)، عن اثنين من النماذج الناتجة في الجولة المقبلة من الصقل سوفتكون مستقلة إحصائيا فقط وراء هذا القرار. ونتيجة لهذا التحذير، ويوصى النهج السابق.

القرار يمكن الحصول عليها من هذا البروتوكول يعتمد على أربعة عوامل رئيسية: ط. استراتيجية جمع البيانات ونوعية البيانات المدخلة، ثانيا. عدد subtomograms، والثالث. دقة محاذاة subtomograms، والرابع. عدم تجانس الهياكل. في حين أن القيد الأول والثاني يمكن التغلب عليها إلى حد كبير باستخدام إشارة إلى الضوضاء عالية للكشف عن مباشرة الإلكترون جنبا إلى جنب مع CTF تصحيح المقطعي وجمع البيانات الآلي، وتتأثر دقة محاذاة أبعد من حجم وشكل هيكل الفائدة نفسها. عند تطبيق هذا البروتوكول على المسامير الصغيرة التي تفتقر إلى السمات البارزة، قد يكون من المفيد ربط شظايا فاب للارتفاع لتحسين دقة المحاذاة، وبالتالي قرار 31. وأخيرا، إذا الهياكل أن متوسط ​​المعرض التشكل متعددة، التصوير المقطعي الفرعييمكن استخدام أساليب تصنيف صباحا إلى متوسط ​​التشكل مختلفة بشكل منفصل. تحقيقا لهذه الغاية، Jsubtomo يتكامل مع حزمة دينامو، وتقدم تصنيف subtomogram قوية 9.

بروتوكول أعلاه هو مكمل لالبلورات بالأشعة السينية من البروتينات السكرية الفيروسية المعزولة. يمكن تركيب الهياكل البلورات في المتوسطات مقطعية الفرعي للحصول على التوجيه الدقيق للبروتين سكري فيما يتعلق غشاء الفيريون. سيتم تطبيق هذه المنهجية تستمر بلا شك في تسليط الضوء على بنية فيروس يلفها والبيولوجيا المرضية.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Jsubtomo (ver 1.3.1)University of Oxfordn/awww.opic.ac.uk/jsubtomo
Bsoft (ver 1.8.7)NIAMS, NIHn/absoft.ws
UCSF ChimeraUCSFn/awww.cgl.ucsf.edu/chimera

References

  1. Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography. Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).
  2. Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography. Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).
  3. Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly. Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).
  4. Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
  5. Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor. Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).
  6. Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  7. Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).
  8. Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  9. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).
  10. Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).
  11. Fernández, J. J. Computational methods for electron tomography. 43 (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).
  12. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging). Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).
  13. Frangakis, A. S., et al. Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).
  14. Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ. PLoS pathogens. 2 (8), (2006).
  15. Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455 (7209), (2008).
  16. Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
  17. Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).
  18. Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids. Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).
  19. Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).
  20. Arranz, R., et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins. Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).
  21. Karotki, L., et al. Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold. Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).
  22. Pietilä, M. K., et al. Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea. Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).
  23. Huiskonen, J. T., et al. Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses. Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).
  24. Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike. PLoS pathogens. 9 (5), (2013).
  25. Maurer, U. E., et al. The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction. Structure. 21 (8), London, England. 1396-1405 (1993).
  26. Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes. Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).
  27. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature. 9 (9), 853-854 (2012).
  28. Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).
  29. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).
  30. Faini, M., et al. The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions. Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).
  31. Wu, S., et al. Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins. Structure. 20 (4), London, England. 582-592 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

92 subtomogram

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved