فحوصات مراسل المتوازية نطاق واسع في خلايا الثدييات مثقف

Summary

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Abstract

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

Introduction

فحوصات مراسل المتوازية (MPRA) تتيح قياس المضاعفة من الأنشطة التنظيمية النسخي الآلاف إلى مئات الآلاف من تسلسل الحمض النووي ^{1- 7.} تنفيذا الأكثر شيوعا، ويتم تحقيق مضاعفة من قبل اقتران كل تسلسل تهم جين مراسل الاصطناعية التي تحتوي على علامة تحديد تسلسل المصب من إطار القراءة المفتوح (ORF، الشكل 1). ترنسفكأيشن التالية، والعزلة RNA وتسلسل عميق الغايات 3 'من النصوص الجين المراسل، أنشطة النسبية للتسلسل جانب يمكن أن يستدل من الوفرة النسبية للعلامات تحديد بهم.

نظرة عامة على الشكل 1. MPRA. مكتبة مراسل MPRA يبني هي التي شيدت من قبل اقتران متواليات التنظيمية المفترضة لالاصطناعيةمراسل الجينات التي تتكون من "خامل" ORF (مثل GFP أو وسيفيراز)، يليه علامة تحديد التسلسل. وtransfected المكتبة بشكل جماعي إلى السكان من الخلايا المستزرعة ويتم استرداد كتب مراسل مرنا في وقت لاحق. يستخدم التسلسل العميق لحساب عدد تكرارات كل علامة بين من mRNAs مراسل وtransfected البلازميدات. نسبة مرنا تعول على التهم البلازميد يمكن استخدامها للاستدلال على نشاط التسلسل التنظيمي المقابلة. مقتبس بإذن من ميلينكوف، وآخرون ^2.

MPRA يمكن تكييفها لمجموعة واسعة من التصاميم التجريبية، بما في ذلك 1) الطفرات شاملة من العناصر التنظيمية الجينات الفردية، 2) المسح الضوئي لعناصر تنظيمية جديدة عبر موضع الاهتمام، 3) اختبار تأثير التباين الوراثي الطبيعي في مجموعة من المفترضة المروجين، والقدرة أو كواتم الصوت، و4) الهندسة شبه عقلانية من العناصر التنظيمية الاصطناعية. لىيمكن أن تتولد braries من المتغيرات تسلسل باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب، بما في ذلك تركيب مكتبة قليل النوكليوتيد (OLS) على ميكروأرس برمجة ^2،3،6،7، والتجمع من أليغنوكليوتيد] المنحطة ^1،4، ربط اندماجي ⁸ و تفتيت الحمض النووي الجيني ^5.

يصف هذا البروتوكول بناء مكتبة من المروج المتغيرات باستخدام OLS وpMPRA1 وpMPRAdonor1 ناقلات (Addgene معرفات و49349 49352 على التوالي؛ http://www.addgene.org)، ترنسفكأيشن عابرة من هذه المكتبة في خلايا الثدييات مثقف والكميات اللاحقة الأنشطة التي كتبها مروج تسلسل عميق من الأكواد المرتبطة بها (TAG-يليها). تم استخدام الإصدارات السابقة من هذا البروتوكول في البحث عنها في ميلينكوف آخرون طبيعة التكنولوجيا الحيوية 30، 271-277 (2012) وفي Kheradpour آخرون بحوث الجينوم 23، 800-811 (2013).

Protocol

1. تسلسل تصميم وتجميع

1. تبدأ MPRA مع تصميم وتركيب تسلسل إلى أن يعاير للنشاط التنظيمي. من أجل التوافق مع سلسلة ناقلات pMPRA، وتصميم كل تسلسل باستخدام القالب التالي: 5'-ACTGGCCGCTTCACTG- فار -GGTACCTCTAGA- علامة -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 "حيث يدل فار تسلسل إلى أن يعاير وعلامة تدل واحدة أو أكثر وتحديد العلامات.
2. يتم فصل المناطق المتغيرة اثنين (فار وعلامة) بواسطة زوج من KpnI (GGTACC) وXbaI (TCTAGA) مواقع تقييد لتسهيل ربط الاتجاه من جزء مراسل الجينات فيما بينها. وبالإضافة إلى ذلك، سيتم إضافة متميزتين SfiI (GGCCNNNNNGGCC) مواقع بواسطة PCR للسماح ربط الاتجاه إلى العمود الفقري pMPRA. يجب أن لا يحتوي على مناطق متغيرة نسخ إضافية من أي من هذه المواقع قيود. إذا لزم الأمر، يمكن استبدال واحد أو أكثر من هذه الانزيمات التقييد، طالما بدائل 1) السماح قطع كفاءة بالقرب من نهايات جزيئات الحمض النووي، و2) لا قطع في أماكن أخرى في تسلسل النواقل. انظر المناقشة للحصول على تفاصيل إضافية.
3. الحصول على الاشعال المطلوبة المذكورة في الجدول 1 من بائع التجاري.

MPRA_SfiI_F	GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG
MPRA_SfiI_R	GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC
TAGseq_P1	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
TAGseq_P2	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [مؤشر] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG

الجدول 1. متواليات التمهيدي. [مؤشر] مؤشر يدل على تسلسل 6 إلى 8 الإقليم الشمالي المستخدمة في التسلسل المضاعفة. الحصول على الأقل 8 الاشعال TagSeq-P2 مع مؤشرات مختلفة. جميعمن الاشعال يجب تنقيته بواسطة HPLC أو PAGE.

4. ويمكن الحصول على مكتبات قليل النوكليوتيد من بائع أو الأساسية منشأة تجارية، أو إنشاء باستخدام القائم على برمجة ميكروأري قليل النوكليوتيد المزج كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. Resuspend ومنتجات عملية شريان الحياة في 100 ميكرولتر TE 0.1 العازلة.
5. تشغيل المكتبات قليل النوكليوتيد على 10٪ TBE-اليوريا تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد. تحميل ما يقرب من 1 بمول في حارة وصمة عار وصمة عار مع الفلورسنت ssDNA حساسة لتقييم جودتها (الشكل 2A).
6. إذا فرقة منفصلة المقابلة لأليغنوكليوتيد] كامل طول يمكن تصور (الشكل 2A، الممرات 1 و 2)، استئصال المقابلة شريحة هلام الأكريلاميد وأزل أليغنوكليوتيد] في 100 ميكرولتر TE 0.1 بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز. خلاف ذلك، والمضي قدما باستخدام OLS تعليق الخام.
7. تضخيم وإضافة ذيول SfiI إلى المكتبة قليل النوكليوتيد باستخدام مستحلب PCR ⁹ سوب>.
8. انشاء 50 ميكرولتر مخاليط تفاعل PCR كما هو موضح في الجدول رقم 2. ثم تتحد مع 300 ميكرولتر النفط والسطحي خليط من Micellula DNA مستحلب وطقم تنقية ودوامة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.

كاشف	1X وحدة التخزين (ميكرولتر)
Herculase الثاني فيوجن البلمرة DNA	0.5
5X Herculase II الاحتياطي الرد	10
dNTP (10 ملم لكل منهما)	1.25
BSA (20 ملغ / مل)	1.25
MPRA_SfiI_F التمهيدي (25 ميكرومتر)	0.25
MPRA_SfiI_R التمهيدي (25 ميكرومتر)	0.25
قالب عملية شريان الحياة (1-10 attomol)	يختلف
nuclease خالية من المياه	50

ve_content "> الجدول 2. مستحلب PCR مزيج التفاعل (مرحلة الماء).

9. استخدام التركيز الذي يعطي الغلة القصوى من منتجات التضخيم دون ظهور التحف (انظر القسم 1.12).
10. الاستغناء المستحلب الناتج في أنابيب PCR وتنفيذ 20 دورات PCR (2 دقيقة عند 95 درجة مئوية، 20 × [20 ثانية في 95 درجة مئوية، و 20 ثانية في 55 ° C، 30 ثانية في 72 ° C]، 3 دقائق في 95 ° C).
11. تجمع وكسر كل 350 ميكرولتر مستحلب PCR رد فعل بإضافة 1 مل إيزوبوتانول وvortexing لفترة وجيزة، ثم تنقية المنتج التضخيم باستخدام عمود تنقية الحمض النووي.
12. تشغيل قسامة على 2٪ أو 4٪ هلام الاغاروز للتحقق خالية من القطع الأثرية التضخيم (الشكل 2B).

الرقم 2. إعداد مكتبات التوليف قليل النوكليوتيد. A) ثلاثة مكتبات التوليف قليل النوكليوتيد الخام المختلفة (شريان الحياة) تعمل على تغيير طبيعة 10٪ TBE-اليوريا المواد الهلامية بولي أكريلاميد. العصابات الموافق أليغنوكليوتيد] طول كامل (*) يمكن تصور ورفعه من المكتبات 1 و 3 2. مكتبة تحتوي على ملوثات التي تتداخل مع تنقية PAGE. إذا كان هذا هو الحال، انتقل مباشرة إلى التضخيم PCR. B) منتجات مفتوحة ومستحلب التضخيم PCR من نفس المدى مكتبة قليل النوكليوتيد على agarose هلام. PCR التضخيم من المكتبات قليل النوكليوتيد معقدة في كثير من الأحيان يخلق منتجات خيالية وغيرها من الأعمال الفنية التي قد تظهر كما العصابات العليا والسفلى. مستحلب PCR يمكن تقليل هذه التحف.

2. البناء المكتبة

1. إعداد العمود الفقري البلازميد خطي من قبل هضم pMPRA1 ناقلات مع SfiI عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة، تشغيل على 1٪ هلام الاغاروز، استئصال الفرقة العمود الفقري (في هذه الحالة، 2.5 كيلوبايت) وتنقيتها باستخدام عمود الدوران هلام تنقية.
2. دايجستالمنتجات مستحلب PCR من الخطوة 1.4 مع SfiI عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة وتنقية باستخدام أعمدة تنقية الحمض النووي.
3. لligate المكتبة المروج العلامة في العمود الفقري ناقلات خطي، إعداد ردود الفعل التي تحتوي على 100 نانوغرام من المنتج PCR هضمها، 50 نانوغرام من خطي العمود الفقري النواقل وT4 DNA يغاز. احتضان بين عشية وضحاها في 16 ° C ثم الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لإبطال نشاط يغاز.
4. تحويل E. القولونية مع رد فعل ربط. للحفاظ على تعقيد المكتبة، وتهدف إلى الحصول على ما لا يقل عن 10X وت م من هناك مجموعات متميزة المروج العلامة في مكتبة مصممة.
5. عندما يكون العدد الكلي للعلامات ما يقرب من 100،000، ويمكن عادة أن يتحقق الهدف عن طريق تنفيذ وت 6-8 تحولات موازية في المكتبة.
6. لكل تحول، والجمع بين 50 ميكرولتر electrocompetent E. خلايا القولونية مع 2 ميكرولتر من مزيج ربط على الجليد. تحويل من Electroporation لل، واستعادة الخلايا في 800 ميكرولتر SOCالمتوسطة التي تهز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ثم الجمع بين الخلايا من التحولات متوازية.
7. لتقييم كفاءة التحول، لوحة التخفيفات المسلسل من alinquot الخلايا تعافى على لوحات أجار LB مع 50-100 ميكروغرام / مل كربنيسيلين واحتضان ليلا 37 درجة مئوية. وت م تقدير إجمالي و(وت لاحظ) × (عامل تمييع) × (V - V) / الخامس، حيث V هو الحجم الكلي للخلايا تعافى والخامس هو حجم قسامة المتخذة لالتخفيفات التسلسلية.
8. في الوقت نفسه، استخدم ما تبقى من الخلايا تعافى لتطعيم 200 مل LB تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل كربنيسيلين. زراعة خلايا في 37 درجة مئوية خلال الليل في حاضنة شاكر ثم عزل DNA البلازميد فقا للإجراءات العادية.
9. هضم قسامة من مكتبة البلازميد معزولة مع SfiI عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة وتشغيلها على 1٪ هلام الاغاروز لتأكيد وجود تدرج.
10. خطي المكتبة البلازميد بواسطة جutting بين المتغيرات المروج والعلامات باستخدام KpnI وXbaI. لتعظيم كفاءة الهضم، نفذ الهضم التسلسلية:
11. أولا، مع هضم KpnI عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وتنقية باستخدام الخرز المغناطيسي. ثانيا، مع هضم XbaI مع اضافة 1 U الروبيان الفوسفاتيز القلوية عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة والحرارة تعطيل عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم تنقية باستخدام الخرز المغناطيسي.
12. تشغيل قسامة على 1٪ هلام الاغاروز للتحقق من الخطية كاملة. إذا بلازميد تقطيعه مرئيا، جزء خطي يجب تنقيته هلام.
13. لإنشاء مكتبة MPRA مناسبة لترنسفكأيشن في خلايا الثدييات، ligate على ORF مع KpnI / XbaI المتوافقة مع نهايات في المكتبة المتوسطة الخطي.
14. لإعداد luc2 متوافق ORF جزء من pMPRAdonor1، هذا هضم البلازميد مع KpnI وXbaI عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وتشغيلها على agarose هلام 1٪. استئصال جزء ORF (1.7 كب في هذه الحالة) وتنقية باستخدام عمود هلام تنقية زيادة ونقصان.
15. استنساخ جزء ORF إلى المكتبة المتوسطة الخطي كما هو موضح في الخطوات 2،3-2،8.
16. هضم قسامة (الموافق 1-2 ميكروغرام) من مكتبة MPRA مع KpnI عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وتشغيلها على agarose هلام 1٪. إذا كان يتم تشغيل المكتبة هضمها بمثابة فرقة واحدة، انتقل إلى القسم 3. إذا لوحظ فرق إضافية (عادة الموافق المرحل من بنيات وسيطة)، ومكتبة يمكن أن يكون أبعد النقي على النحو التالي:
17. هضم 3-5 ميكروغرام من المكتبة ملوثة KpnI عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وتشغيلها على 0.8٪ agarose هلام بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
18. استئصال الفرقة مكتبة الصحيحة، وتنقية الحمض النووي باستخدام عمود الدوران تنقية جل وتنفيذ الربط الذاتي باستخدام عالية تركيز الحمض النووي T4 يغاز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ثم كرر التحول ومكتبة النهائية عزل الحمض النووي كما هو موضح في الخطوة 2.8.

3. Transfection، التشويش، وعزل الحمض النووي الريبي

1. لكل ترنسفكأيشن مستقل والثقافة العدد المطلوب من الخلايا (على النحو الذي يحدده تعقيد مكتبة MPRA، انظر مناقشة) في المتوسطة المناسب. على سبيل المثال، الثقافة HEK293T / 17 الخلايا في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS وL-الجلوتامين / البنسلين / الستربتومايسين. خلايا ثقافة لمدة سنتين على الأقل transfections مستقل لكل مكتبة وحالة تجريبية.
2. بالنقل الخلايا المستنبتة مع البلازميدات MPRA. يجب أن يكون الأمثل طريقة ترنسفكأيشن وشروط كل نوع من الخلايا. لكل عينة transfected والاحتفاظ بها قسامة (50-100 نانوغرام) من DNA البلازميد كعنصر تحكم مطابقة.
3. على سبيل المثال، بالنقل 0.5 × 10 ⁷ HEK293T / 17 الخلايا المزروعة إلى ~ 50٪ التقاء في صحن الثقافة 10 سم مع 10 ميكروغرام DNA البلازميد في 1 مل غروب MEM أنا انخفاض المصل المتوسطة باستخدام 30 ميكرولتر Lipofectamine LTX و 10 ميكرولتر زائد الكاشف. إزالة الخليط ترنسفكأيشن بعد 5 ساعات والسماح للخلايا لاسترداد لمدة 24-48 ساعة.
4. اختياريا، نفذ أي اضطراب المطلوبة لتنشيط تسلسل التنظيمية context- أو التي تعتمد على إشارة في مكتبة مصممة.
5. حصاد الخلايا وعزل بولي (A) + مرنا باستخدام بنسبة ضئيلة (DT) أعمدة السليلوز القياسية أو الخرز باستخدام تعليمات الشركة الخاصة بهم.
6. ضمان قدرة ملزمة القصوى من الأعمدة أو الخرز يتجاوز المبلغ الإجمالي من المتوقع مرنا من خلايا المقطوع. على سبيل المثال، فإن العائد المتوقع من القسم ما يقرب من 3.3 0.5-2.5 ميكروغرام مرنا.

4. تاج تسلسل

1. للقضاء على المرحل من الحمض النووي من ناقلات لست] خلية transfected، علاج كل عينة مرنا 20 ميكرولتر مع 1 ميكرولتر الدناز توربو (2 U) و 2.3 ميكرولتر 10X توربو الدناز العازلة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، إضافة 2.4 ميكرولتر توربو الدناز الكاشف في التعطيل RT لمدة 5 دقائق مع الخلط، الطرد المركزي في 10،000 ز لمدة 90 ثانية، ثم نقل الحل لأنبوب جديد.
2. تحقق النقاء من خلال إجراء PCR كما هو موضح في القسم 4.6 على 60-100 نانوغرام من كل عينة مرنا، ثم تشغيل المنتجات على agarose هلام. إذا amplicons محددة واضحة (0.25 كيلوبايت في حالة استخدام pMPRA1 مع luc2)، العمود تنقية مرنا المعالجة وثم تكرار العلاج الدناز.
3. لتوليد المكتبات التسلسل الوسم وما يليها، وتحويل مراسل مرنا ل[كدنا] وإضافة محولات التسلسل بواسطة PCR.
4. انشاء مرنا / RT مخاليط التمهيدي كما هو موضح في الجدول رقم 3. احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم ضع على الجليد. في موازاة ذلك، بإعداد ردود فعل التوليف [كدنا] كما هو موضح في الجدول رقم 4.

كاشف	1X وحدة التخزين (ميكرولتر)
عينة مرنا (400-700 نانوغرام الكل)	8
بنسبة ضئيلة من 0DT (50 ميكرومتر)	1
dNTP (10 ملم لكل منهما)	1

ove_content "> الجدول 3. RNA / النسخ العكسي مزيج التمهيدي لتخليق [كدنا].

كاشف	1X وحدة التخزين (ميكرولتر)
10X مرتفع الثالث RT العازلة	2
MgCl 2 (25 ملم)	4
DTT (0.1 M)	2
RNaseOut (40 U / ميكرولتر)	1
مرتفع الثالث (200 U / ميكرولتر)	1

الجدول 4. [كدنا] مزيج رد فعل التوليف.

5. الجمع بلطف مرنا / RT التمهيدي ستختلط مع يمزج التوليف [كدنا]. احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة، و 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم ضع على الجليد. أخيرا، احتضان مع 2 U من ريبونوكلياز H عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
6. إنشاء تفاعلات PCR كما هو موضح في الجدول 5 مع 4-6 ميكرولتر[كدنا] خليط التفاعل أو 50 نانوغرام البلازميد مراسل كقوالب. ثم نفذ PCR التضخيم (95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 26 × [95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية]، 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق).

كاشف	1X وحدة التخزين (ميكرولتر)
2X PfuUltra الثاني HotStart PCR ميكس ماجستير	25
TagSeq_P1 التمهيدي (25 ميكرومتر)	0.5
TagSeq_P2 التمهيدي (25 ميكرومتر)	0.5
قالب (مرنا، أو مزيج [كدنا DNA البلازميد)	يختلف
nuclease خالية من المياه	50

الجدول 5. تاج تسلسل PCR مزيج التفاعل.

7. تشغيل منتجات PCR من خلال agarose هلام 2٪، والعصابات المكوس المقابلة لamplicons مكتبة الوسم تسلسل (0.25 كيلوبايت في حالة استخدامpMPRA1 مع luc2) وتنقية هذه باستخدام الأعمدة تدور تنقية هلام.
8. تجمع، وتفسد تسلسل تنقية الوسم amplicons يليها مباشرة بصك التسلسل البورشيد.
9. تصفية منخفضة الجودة يقرأ عن طريق إزالة كل ما أ) يحتوي على موقف واحد أو أكثر مع نوعية PHRED يسجل أقل من 30 في العلامة متسلسلة أو ب) لا تتطابق تماما علامة مصممة. حساب عدد المرات التي تظهر كل علامة المتبقية في كل مكتبة. تطبيع التهم كلمة دلالية لTPM (علامات علامات التسلسل لكل مليون) ومن ثم حساب نسبة مرنا المستمدة من التهم علامة على المشتقة بلازميد التهم علامة لكل زوج من المكتبات التسلسل. إذا ارتبطت علامات مختلفة متعددة إلى كل متغير تسلسل، استخدم نسبها وسيطة لتحليل المصب.

النتائج

MPRA يسهل عالية الدقة، تشريح الكمي للعلاقات تسلسل النشاط من العناصر التنظيمية النسخي. وهناك تجربة ناجحة MPRA تسفر عادة قياسات متكررة للغاية بالنسبة لغالبية متواليات في المكتبة transfected (الشكل 3A). إذا لوحظ ضعف استنساخ (الشكل 3B)، وهذا يدل على تركيز منخفض جدا من mRNAs من مراسل في عينات الحمض النووي الريبي استردادها، إما بسبب 1) النشاط المطلق المنخفض بين متواليات يعاير، أو 2) انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن.

ويبين الشكل 4 ممثل "البصمة المعلومات" ^1،2 الناتجة عن يعاير ~ 37،000 متغيرات عشوائية من تسلسل 145 BP المنبع من الجين البشري IFNB في الخلايا HEK293 مع أو بدون التعرض لفيروس سينداي. المروج تاتا مربع والداني يعرف محسن ¹⁰ يمكن التعرف بوضوح على ريجي غنية بالمعلوماتإضافات بطريقة تعتمد على الفيروس.

الرقم 3. الوسم يليها التكاثر. المؤامرات مبعثر تظهر أمثلة من البيانات الوسم وما يليها من اثنين transfections تكرار مستقل مع ارتفاع (A) ومنخفضة (B) التكاثر. المؤامرة الأخيرة تظهر العديد من العلامات النموذجية مع التهم مرنا عالية في واحدة فقط من مكررات اثنين. تشير هذه التحف عادة أن تركيزات من mRNAs مراسل كانت منخفضة للغاية بالنسبة الكمي PCR التضخيم، إما بسبب الأنشطة المطلقة منخفضة بين بنيات المراسل، أو الكفاءة ترنسفكأيشن منخفضة.

الرقم 4. footprinting معلومات من IFNB النسخ موقع بداية البشري ومحسن القريبة. ويعاير ما يقرب من 37،000 متغيرات عشوائية من 145 النوكليوتيدات (الإقليم الشمالي) منطقة المنبع من الجين البشري باستخدام IFNB MPRA في الخلايا HEK293 مع (A) وبدون (B) التعرض لفيروس سينداي. تظهر أشرطة زرقاء المعلومات المتبادلة بين مخرجات مراسل والنوكليوتيدات في كل موقف. محسن الداني وTATA مربع تبرز بوصفها مناطق محتوى المعلومات عالية على العدوى الفيروسية.

Discussion

MPRA is a flexible and powerful tool for dissection of sequence-activity relationships in gene regulatory elements. The success of MPRA experiments depend on at least three factors: 1) careful design of the sequence library, 2) minimization of artifacts during amplification and cloning, and 3) high transfection efficiency.

The possible lengths of the variable regions in the reporter constructs are largely determined by the synthesis or cloning technology used. Standard OLS is generally limited to about 200 nt, but this protocol is compatible with inserts up to at least 1,000 nt. Note that variable regions that are highly repetitive or contain strong secondary structures may end up underrepresented due to PCR and cloning biases. The length of the tags that identify each of the variable regions should be 10-20 nt and the collection of tags should ideally be designed such there are at least two nucleotide differences between any pair. Tags that contain the seed sequences of known microRNA or other factors that might influence mRNA stability should also be avoided when possible.

A key parameter in the design of MPRA experiments is the total number of distinct reporter constructs to be included in the library (the design complexity, denoted C_D). In practice, C_D is limited by the number of cultured cells that can be transfected. As a rule of thumb, the total number of transfected cells should be at least 50-100 times greater than C_D. For example, if 20 million cells can be transfected with a transfection efficiency of 50%, then C_D should be no more than ~200,000. Note that C_D is equal to the number of distinct regulatory sequence variants multiplied by the number of distinct tags per sequence. The more distinct tags are linked to each regulatory sequence, the more accurate the estimate of the activity of that sequence can be made (because measurements from distinct tags can be averaged), but the fewer distinct variants can be assayed in one experiment. The optimal choice depends on the experimental design. In a simple “promoter bashing” experiment, where a mathematical model will be fitted to the aggregated measurements, a single tag per variant is usually sufficient. In a screen for single-nucleotide polymorphisms that cause changes in regulatory activities, it may be necessary to use 20 or more tags per allele to obtain statistically robust results, because comparing each pair of alleles requires a separate hypothesis test.

If the sequences to be assayed are not expected to contain transcription start sites, a constant promoter can also be added in the same fragment. For example, pMPRAdonor2 (Addgene ID 49353) includes a minimal TATA-box promoter that is useful when the upstream variable region is expected to have significant enhancer activity, while pMPRAdonor3 (Addgene ID 49354) includes a modified, strong SV40 viral promoter that is useful when the variable region is expected to contain silencer activity or other negative regulatory elements.

Raw OLS products often contain a significant fraction of truncated oligonucleotides. These may interfere with accurate PCR amplification of the designed sequences, particularly when there is significant homology between them. Using PAGE purification to remove truncated synthesis products and emulsion PCR to minimize amplification artifacts are effective techniques for ensuring high library quality. If either step is impractical, it is imperative to minimize the number of PCR cycles used at each amplification step. Selection and expansion of the cloned library in liquid culture is generally sufficient to maintain the design complexity, but if recombination-prone vectors are to be used or significant representation bias is observed, the recovered cells can instead be plated directly onto large LB agar plates, expanded as individual colonies and then scraped off for DNA isolation. It is also important to consider the potential impact of synthesis errors, which are typically found at a rate of 1:100-500 in OLS. Full-length sequencing of the reporter constructs prior to transfection is recommended to identify and correct for such errors.

It is not necessary to introduce reporter constructs into every cell in the transfected culture, but transfection efficiencies below ~50% may lead to poor signal to noise ratios. It is advisable to optimize transfection conditions prior to performing MPRA experiments in a new cell type. When working with hard-to-transfect cell types, MPRA signals can be boosted by pre-selecting transfected cells. The pMPRA vector series includes variants that constitutively express a truncated cell surface marker that can be used to physically enrich for transfected cells prior to RNA isolation (for example, Addgene IDs 49350 and 49351).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotide library synthesis	Agilent, CustomArray, or other OLS vendors	custom	If using OLS construction method
pMPRA1	Addgene	49349	MPRA plasmid backbone
pMPRAdonor1	Addgene	49352	luc2 ORF donor plasmid
TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)	Generic	n/a	OLS buffer
Novex TBE-Urea Gels, 10%	Life Technologies	EC6875BOX	PAGE purification of OLS products
Novex TBA-Urea Sample Buffer	Life Technologies	LC6876	PAGE purification of OLS products
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494	PAGE purification of OLS products
Micellula DNA Emulsion & Purification Kit	EURx/CHIMERx	3600-01	Library amplification by emulsion PCR
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600675	Polymerase for emulsion PCR
SfiI	New England Biolabs	R0123S	Library cloning with pMPRA vectors
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S	Library cloning with pMPRA vectors
XbaI	New England Biolabs	R0145S	Library cloning with pMPRA vectors
T4 DNA Ligase (2,000,000 units/ml)	New England Biolabs	M0202T	Library cloning with pMPRA vectors
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli	Life Technologies	C4040-50	Library cloning with pMPRA vectors
LB agar and liquid media with carbenicllin	Generic	n/a	Growth media for cloning
E-Gel EX Gels 1%	Life Technologies	G4010-01	Library verification and purification
E-Gel EX Gels, 2%	Life Technologies	G4010-02	Library verification and purification
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	Library and backbone purification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Library DNA isolation
Cell culture media	n/a	n/a	Experiment-specific
Transfection reagents	n/a	n/a	Experiment-specific
MicroPoly(A)Purist Kit	Life Technologies	AM1919	mRNA isolation
TURBO DNA-free Kit	Life Technologies	AM1907	Plasmid DNA removal
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Life Technologies	18080-051	cDNA synthesis
PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix	Agilent	600850	Polymerase for Tag-Seq PCR
Primers (see text)	IDT	custom	PAGE purify Tag-Seq primers