شقة التصوير من جبل ماوس الجلد وتطبيقه على تحليل الشعر جريب الزخرفة والحسية أكسون الصرف

Hao Chang; Yanshu Wang; Hao Wu; Jeremy Nathans

doi:10.3791/51749

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

يحتوي الجلد الثدييات مجموعة متنوعة من هياكل - مثل بصيلات الشعر والنهايات العصبية - التي تظهر أنماط مميزة من التنظيم المكاني. تحليل الجلد مثل جبل مسطح يستفيد من الهندسة 2 الأبعاد من هذا النسيج لإنتاج كامل سمك صور عالية الدقة من الهياكل الجلد.

Abstract

الجلد هو نسيج غير متجانس للغاية. وتشمل الهياكل داخل بصيلات الشعر عن طريق الجلد والعضلات مقف الشعرة، التخصصات البشرة (مثل مجموعات الخلايا ميركل) والغدد الدهنية والأعصاب والنهايات العصبية، والشعيرات الدموية. يتم التحكم في الترتيب المكاني لهذه الهياكل بإحكام على نطاق والمجهرية - كما رأينا، على سبيل المثال، في ترتيب منظم من أنواع الخلايا داخل بصيلات الشعر واحد - وعلى نطاق والعيانية - كما يراها توجهات متطابقة تقريبا الآلاف من الشعر جريبات داخل المنطقة المحلية من الجلد. تصور هذه الهياكل دون باجتزاء جسديا الجلد ممكن لأن للهندسة 2 الأبعاد لهذا الجهاز. في هذا البروتوكول، وتبين لنا أن الجلد الماوس يمكن تشريح، ثابتة، permeabilized، الملون، وأوضحت أنها سليمة اثنين الكائن الأبعاد، وهو جبل مسطح. بروتوكول يسمح التصور من السهل الهياكل الجلد في مجملها من خلال سمك كامل من مناطق واسعة من الجلد عن طريق التقيدباجتزاء كال وإعادة الإعمار. ويمكن أيضا صورا لهذه الهياكل أن تكون متكاملة مع المعلومات حول الموقف والتوجه النسبية لمحاور الجسم.

Introduction

الجلد هو واحد من أكبر الأجهزة في الجسم، مع وظائف هامة في somato-ضجة كبيرة، والعزل / الحراري، والدفاع المناعي ^1. وقد فهم الأساس الجزيئي والخلوي للتنمية وظيفة الجلد من الاهتمام منذ فترة طويلة بسبب الأهمية الأساسية للالجلد كنظام البيولوجية وصلته الأمراض الجلدية. يحتوي الجلد الثدييات مجموعة متنوعة من هياكل متعددة الخلايا، بما في ذلك طبقات من الخلايا القرنية الطبقية، والنسيج الضام الجلدي، عدة أنواع من بصيلات الشعر والغدد الدهنية والعضلات مقف الشعرة، والأوعية الدموية، وما لا يقل عن اثني عشر فئات متميزة من وارد (الحسية) وصادر العصبية الألياف (الشكل 1). وترتبط مناطق مختلفة من الجسم مع أنواع مختلفة من الجلد بشكل مميز. في معظم الثدييات، وتغطي ما يقرب من سطح الجسم كله مع الجلد التي تعج بصيلات الشعر. [البشر والفئران الخلد عارية تشكل استثناءات لعشرهو النمط.] هو الشعر مفقودة من السطوح الراحي من اليدين والقدمين، والتي ترتبط أيضا مع أنماط المتخصصة البشرة (dermatoglyphs) والغدد خارجية الإفراز، والنهايات العصبية الحسية. الأحداث الخلوية والجزيئية التي تتحكم في النمو، والتمايز، والترتيب المكاني للخلايا داخل بصيلات الشعر هي التي تحظى باهتمام خاص حيث أن كل المعروضات المسام، في مصغرة، العديد من الميزات المركزية للتوالد ^2. وتشمل هذه الميزات وجود الخلايا الجذعية والخلايا الجذعية المتخصصة، والهجرات الخلية فشلت وجه التحديد، وتجميع هياكل متعددة الخلايا من مكونات متميزة جنيني.

توضح هذه المقالة الطرق للتشريح، وتحديد ووضع العلامات، والجلد الماوس التصوير باعتباره ورقة ثنائية الأبعاد سليمة، ويشار إليه على أنه "جبل بأكمله" أو "جبل مسطح" التحضير. منذ الجلد الماوس رقيقة نسبيا، فمن الممكن أن الصورة من خلال سمك كامل من التزلج بالارضن باستخدام المجهر متحد البؤر التقليدية. نهج جبل مسطح لتصوير الجلد الثدييات هو مفيد من الناحية الفنية لأنه يتجاوز الحاجة إلى باجتزاء المادية، مما يسمح الهياكل من أجل إعادة بنائها بالكامل من قبل باجتزاء البصرية. منذ ما يقرب تتم معالجة الجلد بأكمله ككائن واحد، وشقة جبل يسهل أيضا النهج التصوير من مناطق متعددة من سطح الجسم مع الحفاظ على المعلومات حول الموقف والتوجه النسبية لمحاور الجسم. أخيرا، والهياكل داخل الجلد وعادة ما تكون موجودة في الأنماط التي تتكرر على فترات منتظمة، مما يسهل جمع الصور من ممثلي متعددة من بنية معينة. هذه الخصائص هي مألوفة لبيولوجيا عصبية الذين يعملون على شبكية العين، وهي جزء ثنائي الأبعاد من الجهاز العصبي المركزي الذي تتمتع بمزايا مماثلة لدراسات مورفولوجيا الخلايا العصبية ^3.

في جبل النهج شقة الموصوفة هنا هو من الفاءده خاصةذ لدراسة الهياكل التي تظهر التنظيم المكاني على نطاق واسع نسبيا داخل الطائرة ثنائية الأبعاد من الجلد. مثال واحد من التنظيم المكاني على نطاق واسع هو قطبية منسقة من بصيلات الشعر والهياكل المرتبطة بصيلات الشعر - مجموعات الخلايا ميركل، مقف العضلات الشعرة والغدد الزهمية، والنهايات العصبية ^4. موجهة بصيلات الشعر في زاوية مع الاحترام لطائرة من الجلد، والمكون من ناقلات المسام التي تقع داخل الطائرة 2 الأبعاد من الجلد يسلك عموما التوجه فيما يتعلق محاور الهيئة التي تحدد بدقة لكل موقف على الجسم. على سبيل المثال، بصيلات الشعر على نقطة مرة أخرى من منقاري إلى الذيلية والشعر على السطح الظهري للقدم إشارة من الأقرب إلى القاصي. يتم التحكم جريب الشعر التوجه مستو قطبية الخلية إشارة (PCP؛ تسمى أيضا قطبية الأنسجة ^5). تم اكتشاف هذا النظام الإشارات في ذبابة الفاكهة حيث صغيرةتم العثور على مجموعة من الجينات PCP الأساسية للتحكم في اتجاه الشعر جليدية وشعيرات. ثلاثة orthologues الثدييات من الجينات الأساسية PCP - homolog مقلى 6 (Fzd6، كما يشار إلى FZ6)، كادهيرين صندوق تعديل العولمة الأوروبي بفارق سبع تمريرة G-نوع مستقبلات 1 (Celsr1)، ومثل فانغ 2 (Vangl2) - تلعب أدوارا مماثلة في الثدييات الجلد وتنسيق توجهات بصيلات الشعر مع محاور الجسم. دراسات FZ6 الفئران خروج المغلوب (Fzd6 ^tm1Nat، يشار إليها فيما FZ6 ^{- / -)} تشير إلى أن الخلل الأساسي في غياب إشارات PCP هو التوزيع العشوائي الأولي أو الفوضى من التوجه بصيلات الشعر، مع عدم وجود تأثير على هيكل لا يتجزأ من بصيلات ^6-8. يعمل نظام غير PCP الثانية في وقت لاحق إلى تعزيز التوافق المحلية من بصيلات المجاورة، الأمر الذي يؤدي إلى إنتاج أنماط الشعر على نطاق واسع مثل جدلات وخصلات.

والمثال الثاني على نطاق واسعويعتبر التنظيم المكاني داخل الجلد في الأشكال التضاريسية من العرش محوار الحسية. الخلايا العصبية الحسية التي يعصب الجلد لديهم أجسام الخلايا في الجذر الظهرية والعقد الثلاثي التوائم. هذه الخلايا العصبية كشف عن درجة الحرارة، والألم، وحكة، وأنواع مختلفة من التشوهات الميكانيكية التي تؤثر على الجلد والشعر ^9. ويمكن تقسيمها إلى أنواع فرعية على أساس القطر محوار وسرعة التوصيل، ومحطة بنية نهاية العصبية، وأنماط التعبير من المستقبلات، وقنوات، والجزيئات الأخرى. بسبب كثافة عالية من تعصيب داخل الجلد، التحليلات التي تنطوي على تصور كل المحاور (على سبيل المثال، المناعية المضادة للخيط عصبي) أو حتى جميع محاور عصبية من فئة واحدة (كما رأينا عندما تم وضع علامة على نوع من الخلايا واحد عن طريق التعبير عن مراسل الفلورسنت) عموما يكشف تراكب كثيفة من المحاور التي تجعل من المستحيل تحديد مورفولوجية جذع الفردية. للتحايل على هذه المشكلة، ونحن قد استخدمت متفرق للغاية موجهة وراثيا لabeling لإنتاج عينات الجلد الظهرية التي هي تصور الفرد العرش محوار معزولة جيدا عن طريق التعبير عن مراسل النسيجية، الإنسان الفوسفاتيز القلوي المشيمة ^10. هذا النهج يسمح التصور لا لبس فيها الفرد الأشكال التضاريسية محوار الشجرة وتعريف أنواع الخلايا العصبية الحسية الجسدية بناء على معايير مورفولوجية.

Protocol

وقد أجريت هذه الدراسة بما يتفق بدقة مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وقد تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للافق رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة (IACUC) بروتوكول MO11M29 من مؤسسات جون هوبكنز الطبية. استشر الطبيب المبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية المحلية لأساليب المعتمدة من القتل الرحيم. ارتداء القفازات، معطف المختبر، والنظارات الواقية عند التعامل مع مثبتات ألدهيد أو المذيبات العضوية.

1. إعداد مواد

صب لوحات Sylgard
1. اتبع إرشادات الشركة المصنعة، مزيج من وكيل المعالجة مع القاعدة، ويحرك بقضيب من البلاستيك.
2. ماصة 35 مل ~ Sylgard السائل لكل 10 سم القطر الأنسجة طبق الثقافة. أطباق زراعة الأنسجة هي أعمق من الأطباق البكتيرية القياسية؛ وهذا يوفر التخليص الرأسي للدبابيس الحشرات.
3. وضع ديشيس على سطح أفقي في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. سوف فقاعات شكلت خلال خلط تختفي.
4. بعد البلمرة، وتخزين لوحات Sylgard في درجة حرارة الغرفة.
  ملاحظة: يمكن تخزين لوحات Sylgard في درجة حرارة الغرفة لسنوات، وإعادة استخدامها عدة مرات حتى يفصل Sylgard من لوحة.
حلول
1. بنزوات البنزيل والكحول البنزيل (BBBA). خلط كميات بنزوات البنزيل 2 و 1 حجم البنزيل الكحول. متجر في الظلام في زجاجة مع سدادة الزجاج أو تفلون أعلى.
  تنبيه: استخدم BBBA ينبغي التعامل معها بشكل مناسب على أنها نفايات المذيبات العضوية. لا تسمح BBBA في الاتصال البلاستيك.
2. الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إضافة 4 ز PFA إلى 80 مل من الماء، إضافة 0.1 مل 1 N هيدروكسيد الصوديوم، وإثارة على طبق ساخن في ~ 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ~ حتى يذوب تماما PFA، ثم إضافة 10 مل 10X PBS وتبرزي حجم إلى 100 مل مع الماء.
  تنبيه: استنشاق الفورمالديهايد / PFA وBBBA الأبخرة ينبغي أن يكونالتقليل من حفظ هذه الحلول في حاويات مغطاة. الفورمالديهايد / PFA هو مادة مسرطنة.
3. النفط الأحمر O. إعداد الأوراق المالية بنسبة 0.5٪ في الأيزوبروبانول. فورا قبل الاستخدام تمييع مع الماء لتركيز النهائي من 0.3٪ زيت الأحمر O، ثم تصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرون.

2. تشريح الجلد، تثبيت، والمقاصة

الظهراني الجلد لالمناعية والميلانين التصوير
1. بالنسبة للفئران الصغار جدا (على سبيل المثال، والأجنة ويوم بعد الولادة (P الجراء) 0-P3)، الموت ببطء الفئران عن طريق استنشاق isoflurane و. الموت ببطء الفئران الأكبر سنا عن طريق الاستنشاق أو الحقن isoflurane والكيتامين / زيلازين تليها خلع عنق الرحم.
2. إزالة الشعر مع الحلاقة الكهربائية وإزالة الشعر هلام. بالنسبة للفئران أصغر سنا من P8، يمكن تخطي هذه الخطوة.
3. استخدام شفرة حلاقة لاجراء خفض أفقي من قاعدة الذيل على طول كل الجناح، ويمر على الجانب الظهري للقاعدة كل الأطراف، انطلاقا الجانبي للآذان ونهايةجي في الأنف.
4. قشر بلطف الجلد من اجراءات الأنسجة الكامنة من الخلفي إلى الأمامي من خلال عقد الجلد بين أصابع القفاز بحيث لا يتم ذلك بواسطة ملقط مقروص. عند تقشير الجلد على مستوى الأذنين، وأول خطوة من نوعها قبالة آذان مع زوج من مقص والمضي قدما ببطء وخاصة الجلد يمكن المسيل للدموع في هذا الموقع.
5. من هذه النقطة فصاعدا، توجيه الجلد مع الداخل مواجهة. دبوس الجلد لSylgard مع ~ 20 دبابيس الحشرات متباعدة بالتساوي حول محيط؛ لا تمتد أكثر من الجلد (الشكل 2B). تغطية الجلد مع 10-20 مل من برنامج تلفزيوني.
6. تشريح بعيدا الدهون المرتبطة الجلد والنسيج الضام باستخدام ملقط الزاوية أو منحنية مع نهاية مدببة من ملقط تواجه أفقيا لتقليل المخاطر التي ملقط سوف تخترق الجلد. قذف أي فقاعات الهواء التي تم المحاصرين تحت الجلد من قبل المتداول بلطف قضيب من القطن ذات الرؤوس على سطح الجلد.
  ملاحظة: إذا كان الجلد هو الذهابلاستخدامها في جبل المناعية شقة أو الكيمياء النسيجية، وإزالة أكبر قدر من النسيج الضام وقت ممكن؛ إذا كان الجلد هو على وشك أن يستخدم لتصور بصيلات الشعر على أساس الميلانين تصبغ، وإزالة أقل اكتمالا من النسيج الضام هو مرض. الجلد قبل الولادة تتطلب الحد الأدنى من "تنظيف" من النسيج الضام ملتصقة.
7. إصلاح الجلد عن طريق إضافة دبس 20 مل من الطازجة PFA 4٪ / برنامج تلفزيوني أو 10٪ من الفورمالين مخزنة في 10 سم لوحة Sylgard (إذا كان سيتم استخدام الجلد للتصوير الميلانين أو الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) الكيمياء النسيجية) أو 20 مل من الطازجة 2٪ PFA / برنامج تلفزيوني (إذا كان سيتم استخدام الجلد لالمناعية المعدلة وراثيا أو تصور الكيراتين (كرت) 17-GFP ^11)، وتناوب بلطف بين عشية وضحاها في غرفة باردة. في اليوم التالي، وغسل في برنامج تلفزيوني ل> 10 دقيقة.
  ملاحظة: الفورمالين قياسي هو 37٪ الفورمالديهايد؛ وبالتالي، "10٪ من الفورمالين" هو 3.7٪ الفورمالديهايد.
8. لAP تلطيخ والمناعية، والاستمرار في القسم 3. للالميلانين ايماججي، يذوى الجلد من خلال سلسلة متدرجة الايثانول (70٪، 95٪، 100٪)، يوم واحد عن كل خطوة، مع تناوب الأفقي لطيف في درجة حرارة الغرفة. إزالة الأنسجة الضامة المتبقية.
9. مع الجلد في الإيثانول بنسبة 100٪، وإزالة دبابيس الحشرات و، إذا رغبت في ذلك، وتقليم الجلد مع مقص لإزالة معظم الطرفية 1-2 ملم من الجلد مع ثقوب دبوس.
10. نقل الجلد إلى 10 سم صحن الزجاج القطر، ووضع شريحتين المجهر الزجاج على الجلد لمنعها من الشباك، وإضافة 20 مل من BBBA. BBBA يصلب بسرعة الأنسجة لذلك من المهم للبشرة لتكون بالارض تحت وطأة من الشرائح الزجاجية قبل إضافة BBBA.
11. خلال الساعات القليلة القادمة، ورفع الشرائح قبالة الجلد لبضع ثوان للسماح للBBBA لغسل فوق الجلد.
  ملاحظة: ارتداء قفازات عند التعامل مع BBBA. يمكن اعتمادا على العمر ومكان الجلد يكون هناك ما يصل إلى 30٪ انكماش في BBBA.
جلد القدم لتحليل الشعر جريب Patterning
ملاحظة: مجموعة من الأعمار فحص عادة هو P1-P8.
1. بعد القتل الرحيم، وقطع القدمين فوق مفصل الكاحل وجعل قطع على التوالي واحد على طول السطح البطني من خلال باطن القدمين.
2. قشر بلطف الجلد من الأنسجة الكامنة، وانطلاقا في الاتجاه الأقرب إلى القاصي.
3. قطع أرقام للافراج عن الجلد ويعلقون عليه لSylgard مع السطح داخل مواجهة (الشكل 2C). هناك الحد الأدنى من النسيج الضام في الجلد القدم.
4. المعدلة وراثيا Krt17-GFP الجلد هو الآن على استعداد للتصوير. للتصوير الميلانين المضي قدما في تثبيت والجفاف وBBBA المقاصة كما هو موضح في القسم 2.1.
جلد القدم لتصور الدهنية الغدد
1. بعد القتل الرحيم، وإزالة الشعر عن طريق فرك الشعر مزيل هلام على سطح الجلد مع إصبع القفاز والإبهام؛ الانتظار لمدة 10 دقيقة.
  ملاحظة: لا تستخدم الحلاقة الكهربائية، والتي سوف تضر الجلد الحساس القدم.
2. Wرماد سطح الجلد مع ماء الصنبور، ويعلقون تشريح الجلد لSylgard كما هو موضح في القسم 2.2.
3. إصلاح مع 1٪ PFA / برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم يغسل في برنامج تلفزيوني.
  ملاحظة: للحصول على تصور الغدد الدهنية على القدمين، والذي وضع بعد أول أسبوع بعد الولادة، سن الأمثل للتحليل مع النفط الأحمر O هو P21، لأن هذا يمثل الدرك الأسفل من تصبغ الشعر خلال دورة الشعر الأولى ^12، وبالتالي فإن الغدد الدهنية يمكن أن ينظر إليه بسهولة أكبر. مع الفئران البيضاء يمكن أن يؤديها هذا التحليل في أي سن. للحصول على ذرية البيضاء عبر فئرانا معدلة وراثيا المصطبغة إلى خط متحولة التيروزينيز مثل C57BL/6J-Tyr ^ج-2J.
إعداد الذيل الجلد لتحليل توزيع الميلانين، الشعر جريب الاتجاه، والغدة الدهنية التصور
1. بعد القتل الرحيم، وجعل قطع دائرية حول قاعدة الذيل، ثم شق الطولية التي تمتد على طول الذيل طول وجهه البطني.
2. لتحليل توزيع الميلانين وبصيلات الشعر والتوجه، وإصلاح ومعالجة الجلد كما هو موضح في القسم 2.1. لتحليل الغدد الدهنية، وقطع الجلد الذيل إلى سلسلة من قطاعات ~ 0،5-1 سم في الطول قبل التثبيت واحتضان قطعة الجلد في برنامج تلفزيوني / 5 ملي EDTA بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية لإضعاف البشرة ^{الأدمة-13} التصاق.
3. قشر بلطف البشرة من الأدمة، دبوس البشرة لSylgard (الوجه الداخلي لأعلى)، واصلاحها في PFA 4٪ / برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يغسل مع برنامج تلفزيوني، وصمة عار مع زيت الأحمر O كما هو موضح أدناه.
  ملاحظة: الحلاقة الكهربائية و / أو إزالة الشعر هلام يمكن استخدامها قبل تشريح أقدم الجلد الذيل (على سبيل المثال، P21)، ولكن هذا العلاج هو اختياري منذ الشعر على الذيل ليستكثيفة كما في أماكن أخرى في الجسم.

3. ردود الفعل تلطيخ

المشيمة البشرية الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) كيمياء الأنسجة لتصور وراثيا المسمى أكسون العرش ^10،14،15 (أرقام 3A، B)
1. بعد تثبيت PFA على Sylgard، ضع جلود ثابتة في طبق زجاج 10 سم ويغرق تحت PBS / 1 ملي MgCl _2. تناوب بلطف الطبق في حمام الماء عند 70 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة لتدمير النشاط الفوسفاتيز الذاتية.
2. تصور AP النشاط مراسل الكيميائيه النسيجيه مع 4-48 ساعة حضانة في درجة حرارة الغرفة في 0.1 M تريس، ودرجة الحموضة 9.5، 0.1 M كلوريد الصوديوم، و 50 ملي MgCl _2، 0.34 ميكروغرام / مل NBT، و0.175 ميكروغرام / مل BCIP، وعادة ما تستخدم 10-15 مل من محلول تلطيخ P21 في ظهري الجلد. رصد رد الفعل تحت مجهر تشريح، مع الحرص على عدم السماح لها المضي قدما إلى ما بعد الوقت الأمثل، والحكم عن طريق التفتيش البصري من محوار تلطيخ الكثافة النسبية لغير محددة NBT الترسيب.
3. وقف رد فعل عن طريق الغسيل مع ثلاثة تغييرات من PBS/0.1٪ توين 20 على مدى 1 ساعة، وإعادة دبوس جلود لSylgard، يذوى والجلود من خلال سلسلة الإيثانول، ومن ثم نقل إلى جلود طبق 10 سم مع BBBA.
  ملاحظة: BBBA يذوب ببطء راسب NBT. خلال الساعات القليلة الأولى في BBBA، سوف خلفية غرامة عجلت NBT حل؛ نتيجة لذلك، فإن الحل BBBA تلقي بظلالها، وسوف يخفف الجلد. تغيير BBBA جديدة بعد بضع ساعات.
4. بعد التصوير الجلد AP الملون، ونقل ذلك إلى الإيثانول ل> 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ثم تخزينها في الإيثانول النقي في -20 درجة مئوية. ويمكن تخزين الجلود AP الملون في هذا الطريق لعدة أشهر مع عدم فقدان إشارة.
النفط الأحمر O تلطيخ لتصور الدهنية الغدد ⁴ (أرقام 3C-F)
1. إزالة دبابيس الحشرات ونقل الأقدام الثابتة طفيفة أو جلود الذيل من لوحة Sylgard إلى الآبار من 6 جيدا نسيج لوحة الثقافة، معما يصل الى اثنين عينات الجلد لكل بئر. يغسل 60:40 الأيزوبروبانول: الماء لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. وصمة عار في 2 مل 0.3٪ زيت الأحمر O في 60:40 الأيزوبروبانول: المياه (انظر القسم 1.2) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
3. يغسل 60:40 الأيزوبروبانول: الماء لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، تليها مياه الغسيل. تقليم بعناية بعيدا عن حواف من الجلد، بما في ذلك ثقوب دبوس، مع مقص غرامة بحيث يمكن جعل سطح الجلد كما شقة ممكن.
4. وضع الجلد على شريحة مع السطح الخارجي مواجهة، إضافة بضع قطرات من الماء أو المائية المتوسطة المتزايدة، وتغطية الجلد مع ساترة، ثم الشريط بلطف ساترة إلى الشريحة لمزيد لشد الجلد.
جبل مسطح المناعية ^4،16،17 (أرقام الجيل الثالث 3G، H)
1. قطع مستطيل من الجلد PFA ثابتة (على سبيل المثال 1 سم × 0.5 سم)، بمناسبة توجهها مع قطع غير المتماثلة (على سبيل المثال مقطع الزاوية اليمنى الأمامية). أداء الحضانة وغسل الخطوات مع دوران طيف على منصة أفقي بالتناوب. في الآبار من 6 - 12 أو جيدا نسيج لوحة الثقافة، وغسل عدة مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة المتبقي PFA، ويغسل مع ~ 10 التغييرات من برنامج تلفزيوني مع 0.3٪ تريتون X-100 (0.3٪ PBST) أكثر من 5-8 ساعة على درجة حرارة الغرفة لpermeabilize الجلد.
2. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية 0.3٪ في PBST مع 5٪ مصل الماعز و 20٪ DMSO لمدة خمسة أيام في درجة حرارة الغرفة. تغطية الآبار من لوحة واضحة مع الشريط أو البلاستيك لاصقة للقضاء على خسائر التبخر.
3. تغسل مع التغييرات 10-15 من 0.3٪ أكثر من PBST 5-8 ساعة واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية في 0.3٪ PBST مع 5٪ مصل الماعز و 20٪ DMSO لمدة 3 أيام في درجة حرارة الغرفة.
4. تغسل مع التغييرات 10-15 من 0.3٪ أكثر من PBST 5-8 ساعة.
5. يذوى في 25٪، 50٪، و 75٪ الميثانول لمدة 5 دقائق ثم كل 3X في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 20 دقيقة لكل منهما.
6. واضح بين عشية وضحاها في BBBA في درجة حرارة الغرفة.
  ملاحظة: شقة جبل المناعية للجلد تقل أعمارهم عن~ P1 لا يمكن أن يؤديها كما هو موضح أعلاه ولكن مع أقصر الحضانة ويغسل مرة. على سبيل المثال، يمكن immunostained P1 الجلد مع الحضانة بين عشية وضحاها في الأجسام المضادة الأولية والعديد من الحضانة ساعة في الضد الثانوية، ويغسل مع التدخل فقط 2-3 ساعة في 0.3٪ PBST. كما ذكر أعلاه، والجلود الأصغر سنا أيضا رقيقة بما فيه الكفاية بحيث يمكن تصويرها دون BBBA المقاصة.
تصور ميركل الكتل الخليوي مع العصب الطرفي نيون صبغ امتصاص (أرقام 3I-L)
AMI-43 (الأخضر) وAM4-65 (الحمراء) هي الأصباغ الفلورية التي تدخل الخلايا يمكن حلها عبر القنوات غير انتقائية الموجبة ^18. في الجلد يعيشون تؤخذ هذه الأصباغ بشكل انتقائي وحتى تتركز في خلايا ميركل.
1. حل 1 ملغ AM1-43-65 أو AM4 في 2 مل PBS وتخزينها في aliquots في -80 درجة مئوية.
2. حقن تحت الجلد مع الجراء حديثي الولادة 2-10 ميكروغرام لكل غرام صبغ وزن الجسم باستخدام إبرة G 29.
3. في وقت لاحق يوم واحد، الموت ببطء الفئران وديسيهط م جلود الظهرية.
4. إصلاح جلود في PFA 4٪ / برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية خلال الليل، ويغسل مع برنامج تلفزيوني، وجبل الجلد كما هو موضح في القسم 3.2.

4. التصوير وتحليل الصور

التصوير جريب الشعر التوجيه (الشكل 4)
1. استخدام مجهر تشريح لصورة الظهرية، القدم، أو جلود الذيل التي يتم المغمورة في BBBA، بالارض تحت شريحة زجاجية، والتي لا تزال في صحن الزجاج - هذا النهج يقلل التلوث BBBA المجهر.
2. إلقاء الضوء على طبق من الأسفل. لتقليل التباين المكاني في شدة الضوء عبر مجال الرؤية، ورفع الطبق الزجاجي إلى ارتفاع ~ 10 سم فوق سطح العمل القياسية للمجهر تشريح ووضع البلاستيك نشرها أو لوحة من الزجاج أكثر من مصدر الضوء.
3. عودة الجلد إلى الإيثانول بنسبة 100٪ للتخزين طويل الأجل في -20 درجة مئوية.
  ملاحظة: ترك الجلد في BBBA لأكثر من يوم واحد يسبب حبيبات الميلانين لكسرجزء. مرة واحدة على الجلد عولج BBBA أنها سوف تتصلب ويظل ثابتا من تلك النقطة فصاعدا. يمكن ترميز جلود مختلفة مع سلسلة من الشقوق في الأمامية و / أو الخلفية ينتهي، بحيث يمكن تخزين معا، لتوفير مساحة في الفريزر.
التصوير والبحث عن المفقودين أكسون العرش (أرقام 3A، B)
1. وضع AP الملون الجلد (القسم 3.1.3) بين لوحين من الزجاج من النوع المستخدم لالهلامية بروتين صغير. تجنب إدخال فقاعات الهواء بين لوحات والجلد، ثم الفتيل بعناية بعيدا أي BBBA الزائدة مع منشفة ورقية. وضع لوحة شطيرة الجلد لوحة على خشبة المسرح المجهر (الشكل 2D).
2. استخدام مشرق الميدان أو DIC الإضاءة مع الهدف 10X و 2 ميكرون أو 5 ميكرون Z-الخطوات. استخدام مرحلة XY الميكانيكية لالتقاط الصور من المونتاج XY التي يتم خياطتها معا لخلق ثلاثي الأبعاد مجموعة البيانات على نطاق والرمادي واحد.
  ملاحظة: للحصول على واحدة جذع محور عصبي كبير، يمكن أن تكون هذه المجموعة من البياناتق كبيرة مثل 5 غيغابايت.
3. أداء اليدوي، الآلي، أو تتبع شبه الآلي العرش محوار مع أي من مجموعة متنوعة من حزم البرمجيات.
  ملاحظة: البرمجيات مثل Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) هو أداة إعادة الإعمار العصبية الحرة التي يتم تشغيلها في بيئة الكمبيوتر وسهلة نسبيا لإتقان ^10.

النتائج

التصوير Brightfield من flatmounts الجلد يمكن استخدامها لصورة afferents الحسية الجلدية (الشكل 3A ¹⁰⁾ وأنماط بصيلات الشعر على أساس الميلانين تصبغ (الشكل 4). التصوير متحد البؤر من flatmounts الجلد يمكن استخدامها لتحديد هندسة (1) مجموعات الخلايا ميركل، تصور مع المضادة ل?...

Discussion

إتقان أساليب تشريح المذكورة أعلاه يتطلب الصبر فقط، مطرد من ناحية، وعدد قليل من الأدوات تشريح جيدة. تشريح الجلد الظهري من السهل نسبيا، ولكن الذيل والجلد القدم تشريح - وخاصة في سن مبكرة بعد الولادة - هي أكثر تحديا. في سن مبكرة قبل الولادة (على سبيل المثال، قبل E15)، وا...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP)	Roche	11383221001
AM1-43	Biotium	70024
AM4-65	Biotium	70039
Benzyl alcohol	Sigma	402834
Benzyl benzoate	Sigma	B-6630
Confocal microscope	Zeiss	LSM700
Cy3-alpha smooth muscle actin antibody	Sigma	C6198	1:400
Cytokeratin-8	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-I-c	1:500
Dissecting microscope
Dissection tools	Fine Science Tools		scissors and forceps
Electric razor
Fluoromount G	EM Sciences	17984-25
Formalin	Sigma	HT501320
Glass dishes	Pyrex		6 cm and 10 cm diameter
Glass plates	Amersham Biosciences	SE202P-10	10 cm x 8 cm x 1 mm
Hair remover	Nair
Horizontal rotating platform	Hoefer	PR250 Orbital shaker
Insect pins	Fine Science Tools	26002-20
Ketamine/xylazine	Sigma	K113
Nitroblue tetrazolium (NBT)	Roche	11383213001
Oil Red O	Sigma	O0625
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Razor Blades	VWR	55411-055
Secondary antibodies	Invitrogen		Alexa-dye conjugated
Sylgard-184	Fisher Scientific	NC9020938
Tissue culture plastic dishes			10 cm diameter
Tissue culture plates			6- and 12-well

References

Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. . Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. , (2010).
Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
Aal Ertürk, ., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: