دليل ل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تسجيل وحدة واحدة من التي تم تحديدها Optogenetically القشرية التثبيطي Interneurons

Summary

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Abstract

وثمة تحد رئيسي في الفسيولوجيا العصبية لتوصيف خصائص الاستجابة وظيفة من العديد من أنواع الخلايا المثبطة في القشرة الدماغية. نحن هنا نشارك إستراتيجيتنا للحصول مستقرة، معزولة جيدا تسجيلات وحدة واحدة من interneurons المثبطة التي تم تحديدها في القشرة الماوس تخدير باستخدام الطريقة التي وضعتها ليما ^و1 الزملاء. وتجرى التسجيلات في الفئران معربا عن Channelrhodopsin 2 (ChR2) فى فئة محددة العصبية. يتم التعرف على أفراد من السكان من قبل ردهم إلى مضة قصيرة من الضوء الأزرق. هذه التقنية - يطلق عليه "PINP"، أو تحديد ضوئي بمساعدة من السكان العصبية - يمكن تنفيذها مع المعدات القياسية تسجيل خارج الخلية. يمكن أن تكون بمثابة بديل رخيص الثمن وفي متناول التصوير الكالسيوم أو الترقيع الموجهة بصريا، لغرض استهداف التسجيلات خارج الخلية إلى الخلايا المحددة وراثيا. Hيحرث نحن نقدم مجموعة من الإرشادات لتحسين الأسلوب في الممارسة اليومية. نحن المكرر استراتيجيتنا خصيصا لاستهداف (PV +) خلايا parvalbumin إيجابي، ولكن وجدت أنه يعمل لأنواع عصبون أخرى أيضا، مثل (CR +) interneurons، معربا عن calretinin (SOM +)، معربا عن السوماتوستاتين و.

Introduction

Characterizing the myriad cell types that comprise the mammalian brain has been a central, but long-elusive goal of neurophysiology. For instance, the properties and function of different inhibitory cell types in the cerebral cortex are topics of great interest but are still relatively unknown. This is in part because conventional blind in vivo recording techniques are limited in their ability to distinguish between different cell types. Extracellular spike width can be used to separate putative parvalbumin-positive inhibitory neurons from excitatory pyramidal cells, but this method is subject to both type I and type II errors^2,3. Alternatively, recorded neurons can be filled, recovered, and stained to later confirm their morphological and molecular identity, but this is a pain-staking and time-consuming process. Recently, genetically identified populations of inhibitory interneurons have become accessible by means of calcium imaging or visually guided patch recordings. In these approaches, viral or transgenic expression of a calcium reporter (such as GCaMP) or fluorescent protein (such as GFP) allows identification and characterization of cell types defined by promoter expression. These approaches use 2-photon microscopy, which requires expensive equipment, and are also limited to superficial cortical layers due to the light scattering properties of brain tissue.

Recently, Lima and colleagues¹ developed a novel application of optogenetics to target electrophysiological recordings to genetically identified neuronal types in vivo, termed “PINP” – or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. Unlike many other optogenetic applications, the goal is not to manipulate circuit function but simply to identify neurons belonging to a genetically-defined class, which can then be characterized during normal brain function. The technique can be implemented with standard extracellular recording equipment and can therefore serve as an accessible and inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching. Here we describe an approach to PINPing specific cell types in the anesthetized auditory cortex, with the expectation that the more general points can be usefully applied in other preparations and brain regions.

In cortex, PINP holds particular promise for investigating the in vivo response properties of inhibitory interneurons. GABAergic interneurons comprise a small, heterogeneous subset of cortical neurons⁴. Different subtypes, marked by the expression of particular molecular markers, have recently been shown to perform different computational roles in cortical circuits^5-9. As genetic tools improve it may eventually be possible to distinguish morphologically- and physiologically-separable types that fall within these broad classes. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. This strategy was developed specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but we have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons. Although PINPing is conceptually straightforward, it can be surprisingly unyielding in practice. We learned a number of tips and tricks through trial-and-error that may be useful to others attempting the method.

Protocol

ملاحظة: بروتوكول التالي هو وفقا للمعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية التي وافقت عليها جامعة ولاية أوريغون رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. جراحة الحاد

1. تخدير الحيوانات مع كوكتيل الكيتامين medetomidine، عبر داخل الصفاق (IP) حقن (الجدول 1).
   ملاحظة: الفئران المستخدمة في هذه التجارب تم إنشاؤها بواسطة عبور تعتمد على لجنة المساواة العرقية ChR2-EYFP المعدلة وراثيا line10 إلى عصبون خطوط سائق (Pvalb-iCre11، PV +، SST-iCre12، SOM +، الكروم، iCre12، CR +). تسليم الفيروسي من ChR2 أو opsins ذات الصلة يجب أن تعمل بشكل جيد على قدم المساواة، على افتراض يتم الحصول على مستويات التعبير مماثلة.
2. قبل البدء في عملية جراحية، تأكد من أن المعروضات الحيوانية لا استجابة لقرصة أخمص قدميه لطيف. إعادة إدارة التخدير في كافة مراحل التجربة عند الضرورة للحفاظ على هذا عمق التخدير. إذا باستخدام التخدير عن طريق الحقن، زرع اختياريا قسطرة الملكية الفكرية لحقن الصيانة.
3. الحفاظ على الحيوانات المائية مع المياه المالحة أو محلول رينغر اللاكتاتي في كافة مراحل التجربة (حوالي 3 مل / كغ / ساعة)، على سبيل المثال باستخدام كوكتيل مخدر المخفف مناسب لحقن الصيانة (الجدول 1).
4. وضع الحيوان في الجهاز الرأس عقد التجسيمي أو غيرها. ضمان أن يتم تأمين الجمجمة جيدا. هذا أمر ضروري للحفاظ على استقرار تسجيلات خلية واحدة.
5. تطبيق مرهم opthalamic للعيون لمنع جفاف. الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 36،5 حتي 37 درجة مئوية.
6. إجراء استنزاف الصهريج لاستقرار تسجيل إضافية. باستخدام شفرة مشرط، وإزالة أنسجة من وجه الخلفي من الجمجمة لفضح ماجنا صهريج. إحداث شق صغير في الجافية لتصريف السائل النخاعي. استخدام سوى غيض جدا من شفرة، وتجنب الاتصال المخيخ أو المخ الجذعية.
7. باستخدام مشرط، إجراء حج القحف صغيرة (~ 2 مم ²⁾ على المنطقة القشرية من الفائدة (لالسمعيةالقشرة، تقريبا -2.3 ملم الخلفي من bregma، 4.5 ملم الوحشي من خط الوسط).
8. إزالة الجافية، وتغطي القشرة يتعرض مع طبقة من الاغاروز الدافئ 0،5-1 مم (1.5٪ الاغاروز في المياه المالحة، 0.9٪ كلوريد الصوديوم، وتطبيق في ~ 37 درجة مئوية). الحفاظ على رطوبة الاغاروز في كافة مراحل التجربة من خلال تطبيق دوري عدة قطرات من المياه المالحة.

2. تسجيل مجموعة المتابعة

1. إعداد القطب التنغستن (7-14 MΩ، 127 ميكرون قطر، 12 ° طرف مدبب، الايبوكسي المغلفة). Superglue القطب إلى أنبوب الزجاج الشعرية وإضافة الانكماش الحراري أنابيب لقبضة (الشكل 1).
2. جبل الكهربائي على micromanipulator بمحركات (أو الهيدروليكي)، المقرر أن يسافر متعامد على السطح القشري. الانزلاق على الأرض الأسلاك تحت الجلد، ضد الجمجمة. تجنب الاتصال مع العضلات على جانبي الرأس والجزء الخلفي من الرقبة لأنها يمكن أن تولد التحف electromyographic.
3. تضخيم الإشارات الكهربائية باستخدام أمبير خارج الخليةلي فاي إيه مناسبة للتسجيل وحدة واحدة، ومجهزة يفضل مع وضع الاختيار مقاومة. مراقبة نشاط ارتفاعه المستمر (الفرقة تمرير 300 - 5000 هرتز) مع اثنين من الذبذبات ومجموعة من المتحدثين بالطاقة. هنا، ورقمنة البيانات المسجلة بشكل مستمر بمعدل عينة من 10 كيلو هرتز. يتم استخراج المسامير حاليا.
4. دفع الكهربائي من خلال الاغاروز حتى يصل الطرف سطح القشرة. ملاحظة هذه الخطوة من خلال المجهر. "صفر" هذا الموقف على مياداة مجهرية.
5. لتقريب أفضل عمق التسجيل، وتأكيد بصريا أن طرف القطب يخرج على السطح القشري على عمق الصفر عندما سحب القطب في نهاية الاختراق.
   ملاحظة: هناك اختلاف بين القراءة مناور والموقف القطب وحظ تشير أنه قد جنحت نسبة إلى الأنسجة. يمكن أن يكون سبب هذا عدم الاستقرار في المخ أو الحيوان، أو تتلاعب الانجراف.
   1. كما الاختيار إضافية لضمان أنهذه مجموعة الصفر نقطة يتوافق مع سطح القشرة، ومراقبة امكانات الحقل، أثار التحفيز في حين تقدم من خلال أول عدة مئات ميكرومتر من الأنسجة. عند رصد امكانات الحقل، وانخفاض أقل الفرقة تمرير مرشح قطع من مكبر للصوت خارج الخلية إلى 10 هرتز. تأكد من أن الاستقطاب من إمكانات الميدانية المحلية في جميع أنحاء عكس عمق ~ 100 ميكرون، بالقرب من الحدود طبقة I / II ^13. هذا هو نقطة مرجعية موثوقة للقشرة السمعية، ولكن قد تختلف عن المناطق القشرية الأخرى.
6. تركيب الألياف البصرية إلى جانب لمصدر الضوء الأزرق (الشكل 2) الصعود إلى مياداة مجهرية اليدوي. باستخدام المجهر، ضع غيض من الألياف أقرب إلى سطح الاغاروز ممكن. مركز شعاع القطب حيث سيدخل الأنسجة.
7. تنظيم الانتاج من مصدر الضوء مع وحدة تحكم قادرة على توصيل TTL (الترانزستور الترانزستور المنطق) قطار نبض العرض المحدد وduratioN- على سبيل المثال، وهو اردوينو (الشكل 3)، بطاقة الكمبيوتر I / O (كما هو موضح)، أو مولد النبض متاحة تجاريا.
   1. مراقبة إشارة على كل الذبذبات.
8. قياس إجمالي الطاقة ضوء (ميغاواط) في غيض من الألياف الضوئية باستخدام السلطة متر. استخدام هذه القيمة لحساب الإشعاع (ميغاواط / مم ²⁾ بقسمة من مساحة المقطع العرضي للألياف الأساسية. تبدأ قيمة كثافة في حدود 15 - 10 ميغاواط / مم ² وضبط الأسفل إذا لزم الأمر، حتى يتم التخلص من القطع الأثرية.
9. تحقق من التحف الخفيفة مع القطب في الاغاروز، استعدادا لدخول الأنسجة. بدء تشغيل قطار نبض البحث (على سبيل المثال، 30 ميللي ثانية البقول ضوء، 500 مللي ثانية فاصل interstimulus (ISI)).
   1. القضاء التحف ضوء عابرة (الشكل 4) من خلال اعادة تموضع الألياف البصرية قريب إلى القطب لتغيير زاوية ضوء الحادث. إذا استمرت الأعمال الفنية، في محاولة خفض قوة الضوء. في اله حالة نادرة أن القطع الأثرية لا يمكن القضاء تماما (الحد الأدنى فقط)، وتمديد مدة نبض البحث. هذا يمكن أن تساعد في تحديد طفرات العصبية الحقيقية.

3. مستقيم PINP في '

1. تقدم القطب ببطء من خلال الدماغ بمعدل حوالي 1 ميكرون / ثانية. استخدام الذبذبات واحد لمراقبة نشاط مستمر. من جهة أخرى، يؤدي قبالة نبضات الليزر.
2. الاستماع ل 'التجزئة' باهتة من المسامير أثار ضوئية على شاشة الصوت، مما يدل على أن القطب يقترب خلية ChR2 + وكثيرا ما يمكن أن ينظر جيدا قبل إشارة كهربائية هو ظاهر على الذبذبات. إبطاء معدل مسبقا.
   ملاحظة: إذا كانت الخلية تقع مباشرة في طريق القطب، فإن النشاط أثار خفيفة تنمو أكبر (وبصوت أعلى). مع اقتراب القطب عصبون واحد، فإن التجزئة في حل المسامير صغيرة ولكن محددة جيدا من حجم الزي والشكل.
3. حالما لىأثار المسامير-GHT هي كبيرة بما يكفي لتحريك قبالة بشكل فردي على الذبذبات، والبدء في القيام بذلك. ضبط القياس على المحور الأفقي لمراقبة الشكل الموجي الدقيق للارتفاع.
4. توقف وانتظر الأنسجة ليستقر. مقاومة إغراء للتحرك القطب أقرب إلى الخلية. هذه الخطوة الحاسمة لتسجيل مستقرة. إذا بعد عدة دقائق لم تحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء - وهذا هو، استقر الأنسجة، لكنها لم ترفع أي خلية أقرب إلى غيض من القطب - 5 ميكرون مزيد من التقدم والانتظار مرة أخرى.
   1. كرر هذه العملية حتى إما الذروة أو القاع من إمكانات العمل يمكن التقاط موثوق مع عتبة الجهد وضع جيد فوق أرضية الضوضاء (على سبيل المثال، +/- 300 μV أو أكبر).
      ملاحظة: هناك خطر ضئيل من ايجابيات كاذبة أو غموض عند PINPing interneurons المثبطة. يمكن أن معظم الخلايا بسهولة تتبع القطار من البقول مع مدة 30 ميللي ثانية، وبين بولفترة ذاتها 500 ميللي ثانية أو أسرع، مع موثوقة الأول الكمون ارتفاع من 2-5 مللي ثانية (الشكل 5). غالبية الخلايا الكهروضوئية +، على وجه الخصوص، يمكن أن تحافظ على اطلاق كامل 1 ثانية (الشكل 6). لأن هذه الخلايا العصبية المثبطة، ثنائي التشابك تفعيل (غير المباشرة) ليست مصدر قلق كبير.
5. أثناء التسجيل، ومراقبة نشاط مستمر على الذبذبات الأولى. تراقب عن كثب على حجم وشكل التموج باستخدام الذبذبات الثانية. ملاحظة نوعية الصوت على السماعة.
   1. الإنصات للتغييرات المفاجئة، والتي تشير إلى أن الخلية إما رسم قريبة جدا من القطب (حيث تواجه خطر مخوزق أو تالف)، أو ينجرف بعيدا. إذا المسامير تصبح كبيرة ومشوهة، التراجع. إذا كانت تنمو أصغر، تقدم القطب. تحرك ببطء في 2 ميكرومتر الخطوات.
   2. تأكيد جودة التسجيل بعد خاصة من قبل بتركيب جميع الطول الموجي السنبلة، الانحياز إلى الذروة أو القاع. تختلف thres الجهدعقد. عبر مجموعة واسعة من القيم الحدية، ينبغي ألا يكون هناك أي وقت مضى واحد شكل ارتفاع ثابت من الارتفاع موحد (الشكل 5A).
6. إذا في أي نقطة إشارة تصبح ملوثة مع المسامير من الخلايا العصبية المجاورة، على هذه الخطوة. تقدم ببطء، وعلى خارج فرصة أن القطب سيمر من مجموعة من الخلايا المجاورة، ولكن تبقى في نطاق من الخلايا العصبية المستهدفة. (هذا هو عادة غير ناجحة.)
7. نقل الكهربائي من خلال عمق كامل من القشرة (900+ ميكرون) في كل اختراق. إذا واجهت أي الخلايا العصبية تستجيب للضوء بعد العديد من الاختراقات أو، على العكس، هي ملوثة التسجيلات بشكل روتيني مع المسامير من خلايا ChR2- المجاورة، حاول القطب الجديد.
   ملاحظة: حتى في دفعة واحدة، ومقاومة وغيض هندسة كهربائية الفردية يمكن أن تختلف إلى حد كبير. وتسهم كل من العوامل في فعالية "الاستماع دائرة نصف قطرها" من القطب، التي يجب أن تكون كبيرة بما يكفي للكشف عن طفرات أثار ضوئية WHالبحث إيل، بعد تقييد بما يكفي لتمكين تسجيل عصبون واحد في العزلة.
8. اختبار مقاومة من الأقطاب الكهربائية على النحو المرغوب فيه. لتجنب إتلاف الأنسجة، والقيام بذلك مع غيض من قطب كهربائي في الجزء العلوي من طبقة الاغاروز، وأيضا خارج الدماغ. ضمن مجموعة من 7-14 MΩ، ومقاومة بالضبط ليست مؤشرا على يقين من الأداء، أو العائد، لهذا التطبيق. أن قال، انها وكيل معقول للاستماع دائرة نصف قطرها: أقطاب-مقاومة أقل التقاط المزيد من الوحدات. -مقاومة أعلى، أقل.
9. في نهاية التجربة، الموت ببطء الحيوان عن طريق افق مؤسسيا، مثل جرعة زائدة من التخدير، أو خلع عنق الرحم تحت التخدير العميق الطائرة.

النتائج

نحن هنا نشارك إستراتيجيتنا للحصول على تسجيلات وحدة واحدة من interneurons المثبطة وراثيا المبوبة في القشرة الماوس تخدير، وذلك باستخدام طريقة optogenetic التي وضعتها ليما وآخرون ^1. الجدول 1 تفاصيل كوكتيل مخدر المقترحة، الكيتامين-Medetomidine-آسيبرومازين (" KMA "...

Discussion

على الرغم من PINP واضح ومباشر من الناحية النظرية، يمكن أن يكون صعبا من الناحية العملية. والمحدد الرئيسي للنجاح هو اختيار القطب. في دائرة نصف قطرها الاستماع الكهربائي المعلمة حرجة. يجب أن تكون كبيرة بما فيه الكفاية للكشف عن أثار المسامير الضوئية عند الطرف لا يزال على مس?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChR2-EYFP Line	Jackson Colonies	12569
Pvalb-iCre (PV) Line	Jackson Colonies	8069
Sst-iCre (SOM) Line	Jackson Colonies	13044
Cr-iCre (CR) Line	Jackson Colonies	10774
Agarose	Sigma-Aldrich	A9793	Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook)	FST	10066-15
Surgical Scissors	FST	14084-09
Scalpel	FST	10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic Ointment	Foster & Smith	9N-76855
Homeothermic Blanket	Harvard Apparatus	507220F
Tungsten Microelectrodes	A-M Systems	577200	12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass Tubing	Warner Instruments	G150TF-3
Heat Shrink Tubing	DigiKey	A332B-4-ND
Zapit Accelerator	DVA	SKU ZA/ZAA	Use with standard Super Glue.
Microelectrode AC Amplifier 1800	AM Systems	700000
MP-285 Motorized Micromanipulator	Sutter	MP-285
4-channel Digital Oscilloscopes	Tektronix	TDS2000C
Powered Speakers	Harman	Model JBL Duet
Manual Manipulator	Scientifica	LBM-7
800 µm Fiber Optic Patch Cable	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Power Meter	ThorLabs	PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).
Arduino UNO	DigiKey	1050-1024-ND