نظام الثقافة الماوس الجنين الأمعاء الجامعة ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; التلاعب في مسارات إشارات وتصوير لايف ثلاثي الأبعاد التنمية الزغبة

Summary

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Abstract

تم الاستدلال معظم عمليات التخلق في الأمعاء من الجنين أقسام رقيقة من الأنسجة الثابتة، وتوفير لقطات من التغيرات على مدى مراحل النمو. المعلومات ثلاثي الأبعاد من أقسام مسلسل رقيقة يمكن أن يكون تحديا لتفسير بسبب صعوبة إعادة بناء أقسام التسلسلية تماما والحفاظ على التوجه السليم للأنسجة على أقسام التسلسلية. النتائج الأخيرة من قبل غروس آخرون، 2011 تسليط الضوء على أهمية ثلاثية الأبعاد في فهم المعلومات التشكل من الزغب النامية في الأمعاء ^1. أظهرت إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد من الخلايا المعوية المسمى منفردة أن غالبية الخلايا الظهارية في الأمعاء اتصل كل من الأسطح قمية والقاعدية. وعلاوة على ذلك، أظهرت إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد من الهيكل الخلوي الأكتين على السطح القمي من ظهارة أن لمعة الأمعاء مستمرة وأن شمعة الثانوية وقطعة أثرية من لياليectioning. تلك نقطتين، جنبا إلى جنب مع تظاهرة الهجرة النووية interkinetic في الظهارة المعوية، ويعرف ظهارة الأمعاء النامية بصفة ظهارة مطبقة كاذبة وليس طبقية كما كان يعتقد سابقا ^1. كانت القدرة على مراقبة ظهارة ثلاثة الأبعاد-المنوية لإثبات هذه النقطة، وإعادة التشكل الظهارية في الأمعاء الجنين. مع تطور تكنولوجيا التصوير متعدد الفوتون وبرامج إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد، والقدرة على تصور سليم، وتطوير أجهزة يتحسن بسرعة. ثنائي الفوتون الإثارة تتيح اختراق أقل ضررا أعمق في الأنسجة مع ارتفاع القرار. التصوير ثنائي الفوتون وإعادة الإعمار 3D من الأمعاء بأكملها الماوس الجنين في التون وآخرون، 2012 ساعد على تحديد نمط زغابة ثمرة ^2. نحن هنا وصف نظام الثقافة الجهاز كله الذي يسمح فيفو السابقين تطوير الزغب وملحقات هذا النظام للسماح للثقافةالأمعاء لتكون ثلاثة الأبعاد تصويرها خلال تنميتها.

Introduction

Each intestinal villus is composed of two main tissue compartments: an epithelial surface layer and a mesenchymal core. The mouse small intestine is formed at embryonic day 10 when a sheet of endoderm closes and seals to form a tube of epithelium surrounded by mesenchymal cells³. This flat tube of epithelium undergoes rapid proliferation, growing both in length and girth and undergoes dramatic rearrangements involving dynamic cell shape changes¹. At the same time, the surrounding mesenchyme also undergoes many developmental processes including the formation of the vascular plexus, differentiation of smooth muscle and recruitment of enteric neurons⁴. In the proximal small intestine at embryonic day 14.5, condensations (clusters) of Hedgehog- and PDGF-responsive cells begin to form adjacent to the epithelium^2,5. Formation of mesenchymal clusters continues to spread along the length of the intestine so that they cover the entirety of the small intestine by embryonic day 16.5². As mesenchymal clusters form, the epithelial cells closest to the clusters begin to withdraw from the cell cycle, while the other epithelial cells continue to proliferate. Those cells directly above the mesenchymal cluster that have withdrawn from the cell cycle begin to change shape as the emerging villus buckles into the lumen. Further growth of the villus is driven in part by the continued proliferation of the epithelium between the emerging villi. The mesenchymal clusters remain tightly adhered to the epithelium of the growing villus and continue to express a variety of signaling molecules. The wave of villus emergence propagates along the length of the small intestine following the formation of mesenchymal clusters. As the intestine continues to grow and the intervillus region extends between emerging villi, new mesenchymal clusters form adjacent to the intervillus epithelium and further rounds of villus emergence and growth ensue⁶.

Synchronized development of the epithelium and mesenchyme is essential for villus morphogenesis. Signaling molecules are secreted from one layer to the other where receptors receive and transduce the signal message in order to coordinate development between the epithelium and mesenchyme. Mesenchymal clusters act as signaling centers and express a variety of developmental morphogens^7-10. Disruption of cluster formation or pattern results in loss of villus emergence and pattern. Inhibition of PDGF signaling results in fewer clusters and fewer villi and those villi that do form are misshapen following the abnormal clusters¹¹. Loss of Hedgehog signaling results in complete loss of cluster formation and failure of villus emergence^2,12. Together, these data demonstrate that clusters coordinate development of the villus epithelium with its mesenchymal core.

Using this whole organ culture system, we are able to alter signaling involved in epithelial-mesenchymal cluster cross-talk to determine the role of those signals in villus morphogenesis. Two-photon confocal optical sectioning and reconstruction afford the ability to visualize cluster formation and villus emergence in three-dimensions and better understand the spatial relationships between the mesenchymal clusters and their overlying epithelium. Extending the culture system to four dimensions, we can capture z-stacks of developing clusters and villi over time and observe these interactions. Ultimately, the ability to follow villus development in this manner and observe changes that occur with altered signaling will revolutionize the understanding of epithelial mesenchymal interactions in villus morphogenesis.

Protocol

ملاحظة: تم التعامل مع جميع الفئران إنسانية باستخدام بروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة ميشيغان كلية الطب حدة لمختبر الطب الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الجامعة على استخدام ورعاية الحيوانات.

1. كامل نظام الجهاز ثقافة

1. إعداد وسائل الإعلام والثقافة لوحات
   1. في ثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة، وإزالة 5 مل من BGJb سائل الإعلام من الزجاجة الأسهم وإضافة 5 مل من القلم / بكتيريا. إعداد الأوراق المالية تعمل وسائل الإعلام في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل، وذلك بإضافة 1 مل من 5 ملغ / مل حمض الاسكوربيك إلى 49 مل من BGJb سائل الإعلام (مع القلم / بكتيريا).
   2. إعداد لوحة الثقافة 6 جيدا وذلك بإضافة 1 مل تحت كل من transwells.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام جميع transwells 6، نقل transwells اضافية الى معقمة وحة 6 جيدا العذبة لاستخدامها لاحقا. إضافة 3 مل من العمل BGJb سائل الإعلام إلى كل من ثلاثة أطباق بتري 10 سم معقمة.
2. التحضير للتشريح
   1. نقع أدوات تشريح في 70٪ ethaنول وتأكد للحفاظ على الأدوات نظيفة أثناء العمل.
   2. إعداد منطقة تشريح مع دلو الجليد كبيرة ووضع لوحة الثقافة 6 جيدا و10 سم أطباق بتري مع BGJb سائل الإعلام على الجليد. العمل على الجليد قدر الإمكان بينما تشريح وإعداد الأمعاء للثقافة.
   3. تخدير الفئران الإناث البالغين في الغرفة مع isofluorane (100 ميكرولتر) قبل euthanization خلع عنق الرحم لحصاد أمعاء الجنين.
   4. بعد حصاد الأجنة من الأم، كل مرحلة الجنين بعناية وفقا لتنظيم تايلر الرسم البياني ^13. لا تعتمد على أيام ما بعد الجماع لتحديد عمر الجنين كما كل الاختلافات تصل إلى 24 ساعة في مرحلة التطوير لوحظ بشكل روتيني داخل القمامة واحدة.
3. تشريح للأمعاء الجنين
   1. الموت ببطء الأجنة بواسطة قطع الرأس قبل إزالة الأمعاء.
   2. كل تشريح الأمعاء في 1X Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) ثم جيش التحرير الشعبى الصينىم قبل أن تتحول إلى 10 سم لوحة بتري مع العمل BGJb سائل الإعلام.
   3. إزالة بعناية من الطحال والمعدة والبنكرياس من المعدة والاثني عشر العلوي.
   4. فصل بلطف الثرب مع الحرص على ترك الثرب المرفقة قدر الإمكان وفصل الاتصالات فقط بما يكفي للسماح الأمعاء ليتم تقويمها.
      ملاحظة: للحصول على الأمعاء أقدم من E14.5 أو تلك التي يجري زرعها أطول من 24 ساعة، فصل بلطف الأمعاء إلى 3 شرائح متساوية للسماح لتدفق محتويات اللمعية من خلال الأمعاء ويطرد من خفض الغايات. ومع ذلك، للثقافات التي قبل E13.5، والانتظار حتى بعد 24 ساعة من زراعة قبل فصل 3 شرائح من الأمعاء للسماح للالمصلية أن ينمو بشكل صحيح على طول الأمعاء.
   5. استخدام الماصة الفم لنقل القطع المعوية على transwells لوحة الثقافة (1.1.2).
   6. إعادة بلطف الأمعاء حسب الحاجة بحيث تكون مباشرة عبر transwelلتر.
      ملاحظة: عندما تبدأ الأمعاء تتحرك محتويات اللمعية من خلال أنبوب، فإن أي مكامن الخلل في الأمعاء يسبب نسخة احتياطية وتلف الأمعاء.
4. ثقافة والعلاج
   1. إزالة وسائل الإعلام من تحت transwell، إضافة 700 ميكرولتر من وسائل الإعلام العلاج (وسائل الإعلام العمل مع البروتينات المؤتلف المضافة أو مثبطات الدوائية) تحت transwell.
   2. إضافة 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام العلاج قطرة من الحكمة في أعلى الأمعاء والسماح لها نقع من خلال transwell. إعادة الأمعاء عند الضرورة.
   3. تغيير العلاج وسائل الإعلام على الأقل مرة واحدة يوميا أو أكثر في كثير من الأحيان تبعا لعمر النصف للكاشف العلاج.
5. إعداد البروتين غارقة الخرز الاغاروز عن مصدر المترجمة من كاشف العلاج
   1. resuspend والخرز الاغاروز في حاوية تخزين ونقل 100 ميكرولتر من الخرز agarose في أنبوب 1.5 مل microfuge.
   2. ملء حجم ما تبقى من الأنبوب عقيمة مع 1X دكتوراهosphate مخزنة المالحة (PBS) وتخلط حبات لغسلها. وضع microfuge أنبوب في رفوف لبضع دقائق للسماح للالخرز لتستقر في القاع ثم الماصة قبالة PBS من على أعلى من الخرز. إعادة ملء microfuge أنبوب معقم مع 1X PBS وتكرار عملية الغسيل مرتين أكثر.
   3. إعداد البروتين من الفائدة مرتين في التركيز المطلوب لتلقي العلاج.
   4. مزيج 5 ميكرولتر من الخرز agarose غسلها مع 5 ميكرولتر من الأسهم البروتين 2X وتستنهض الهمم بلطف حبات في البروتين. وضع أنبوب على الجليد لمدة 1 ساعة، والخلط بلطف كل 10-15 دقيقة.
   5. شطف حبات لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني 1X معقم قبل وضع الخرز على الأمعاء.
6. وضع حبات الاغاروز
   1. ضع بلطف حبات الاغاروز على رأس الأمعاء باستخدام الماصة الفم مع الإبر سحبت الشعرية. وضع الخرز مع الحذر الشديد والتعامل معها بخشونة وتلف الأمعاء ومنع تطوير زغابة في المنطقة المصابة.
   2. وضع ضعف عدد حبات كانت هناك حاجة لتحليل منذ الأمعاء سيخضع الحركات وتحوي حوالي نصف من الخرز توضع سوف لفة الخروج من الأمعاء خلال وقت زراعة.
7. تثبيت الأمعاء مثقف
   1. إزالة بعناية وسائل العلاج من تحت transwell والسماح للأمعاء إلى الهواء الجاف لمدة 3 دقائق.
   2. إضافة 1 مل من تثبيتي تحت transwell لمدة 2 دقيقة، ثم تغطية الجزء العلوي من الأمعاء مع 2 مل من تثبيتي للفترة المتبقية من الوقت التثبيت. مع تحديد بارافورمالدهيد 4٪ O / N عند 4 درجات مئوية أو لمدة 2 ساعة على RT.

2. التصوير من الأمعاء الثابتة

1. التصوير Wholemount
   1. وضع الامعاء كلها (مع مضان الذاتية) على شريحة مع 100 ميكرولتر من 1X DPBS. استخدام ملقط لترتيب بلطف الأمعاء.
   2. استخدام مختبر الأنسجة لإزالة بعناية DPBS وإضافة على الفور 100 ميكرولتر من 70٪ الجلسرين لجعل مو الأنسجةإعادة شفافية وزيادة عمق ممكن من التصوير.
      ملاحظة: إذا كان المطلوب مزيدا من تغلغل الأمعاء، بدلا من تركيب الأمعاء في 70٪ الجلسرين، ونقع في الأمعاء بضع قطرات من محلول تركيز واضح لمدة 10-30 دقيقة. الماصة قبالة الحل تركيز واضح وجبل مع جبل الأمعاء واضح.
   3. تغمس كل من الزوايا الأربع من ساترة إلى الصلصال والتقاط كمية صغيرة من الطين لاستخدام الفواصل بين الشرائح وساترة للحفاظ على ساترة من تسطيح الأمعاء.
   4. ختم ساترة على الشريحة مع VALAP ذاب تطبيقها مع مسحة القطن.
   5. صورة الأمعاء على أي مجهر متحد البؤر تستقيم أو مقلوب. يرجى الرجوع إلى المناقشات لمزيد من التفاصيل.
2. Vibratome باجتزاء من الأمعاء الثابتة (عن وجهة مستعرضة هياكل المعوية)
   1. في الأمعاء تضمين 7٪ الاغاروز في قوالب بلاستيكية صغيرة (10 × 10 × 15 مم) وتسمح للكتل الاغاروز ليبرد ويصلب.
   2. إزالة كتل الاغاروز من القوالب البلاستيكية والغراء كتل الاغاروز إلى مرحلة جمع vibratome مع الغراء الفورية.
   3. ملء مرحلة جمع مع الجليد الباردة 1X DPBS.
   4. قطع الفروع في سمك بين 100-150 ميكرون. لأقسام سمكا تستخدم حلول المقاصة (الموصوفة في القسم 2.1.2) لتصور أعمق في المقطع العرضي.
   5. صب vibratome المقاطع من مرحلة جمع في بئر من لوحة 6 جيدا للتخزين عند 4 درجات مئوية.
3. المناعي تلطيخ والأنسجة vibratome مقطوع ثابت
   1. وضع 5-12 أقسام vibratome لكل بئر في لوحة 24 جيدا مع 1X DPBS.
   2. إزالة 1X DPBS وإضافة 500 ميكرولتر من حل permeabilization لكل بئر. بلطف الصخور العينات لمدة 25 دقيقة في RT.
   3. بعد permeabilization، وغسل العينات 3 مرات مع 1X PBS.
   4. منع عينات لمدة 30 دقيقة على الأقل في 500 ميكرولتر من عرقلة الحل.
   5. بعد حجب، والبريدالتبادل عرقلة الحل مع 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل والحفاظ على العينات عند 4 درجات CO / N.
      ملاحظة: التخفيفات الأجسام المضادة الأولية التي تعمل بشكل جيد على أقسام المجمدة والبارافين يعمل بشكل جيد عموما على vibratome أقسام أيضا، ولكن الأجسام المضادة التي تتطلب استرجاع مستضد النووي عموما لا تعمل بشكل جيد مع هذا البروتوكول (مثل BrdU).
   6. في اليوم التالي، وغسل العينات 3 مرات لمدة 15 دقيقة في كل مرة مع عرقلة الحل.
   7. بعد الغسيل، وتطبيق 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية مخففة في عرقلة الحل. التفاف 24 لوحة جيدا في رقائق الألومنيوم لحماية fluorophores من ضوء والصخور العينات لمدة 45 دقيقة إلى 2 ساعة على RT.
   8. غسل العينات 3 مرات مع 1X PBS لمدة 15 دقيقة لكل وجبل الأقسام vibratome على الشرائح كما هو موضح في القسم 2.4.
4. تصاعد vibratome أقسام
   1. إعداد الشرائح لvibratome تصاعد طريق قطع شرائح رقيقة المزدوج الأمراض المنقولة جنسياالشريط المسيخ ووضعها على طول الجانبين طويلة من الشرائح.
   2. وضع بعناية 5-10 أقسام vibratome بين الشريط المزدوج عصا على الشرائح في قطرة من 100 ميكرولتر من 1X PBS.
   3. تتكشف جميع أقسام ونشرها للخروج الى طبقة واحدة عبر الشريحة.
   4. إزالة أي الاغاروز الزائد أو بت متفاوتة يحول دون ساترة من الجلوس شقة.
   5. استخدام بعناية مختبر الأنسجة لامتصاص الزائد 1X PBS من مختلف الأقسام vibratome.
   6. إضافة قطرة من مائي المتوسطة المتزايدة على رأس من المقاطع vibratome ثم ساترة.
   7. ختم لل coverslips على الشرائح مع ذاب تطبيق VALAP مع مسحة القطن.
   8. صورة المقاطع vibratome على أي مجهر متحد البؤر رأسي أو مقلوب. يرجى الرجوع إلى المناقشات لمزيد من التفاصيل حول اختيار نظام التصوير.

3. تصوير لايف من الأمعاء كامل

الأمعاء تحصد من fetuseق بعد E12.5، مع الثرب متصل يقم سليمة، ووضع بنجاح الزغب في الثقافة باستخدام النظام المذكور أعلاه. وبالتالي، يسمح هذا النظام خارج الحي القبض على الصور الحية ض جزء من الأمعاء النامية التي يمكن بناؤها للحصول على عرض ثلاثي الأبعاد من التشكل مع مرور الوقت.

1. وضع التصوير الحي
   1. استخدام الغراء الفورية الالتزام غشاء البولي الفردي إلى شاشة شبكة غرامة. وهذا يوفر سقالة الدعم لعقد الأمعاء في مكان تحت عدسة غمس المجهر مبائر تستقيم. يرجى الرجوع إلى قسم النقاش لمزيد من التفاصيل بشأن اختيار المجاهر التصوير الحية.
   2. وضع شاشة شبكة في وسط بئر من لوحة الثقافة.
   3. وضع تشريح الأمعاء على الغشاء البولي وإضافة قطرة من الغراء الفورية على حد سواء. استخدام الغراء فقط ما يكفي لتركيب الأمعاء، ولكن لا معطف ذلك!
   4. إضافة ثقافة الإعلام خالية من الفينول الأحمر تحت البوليالغشاء في وسط بئر من لوحة الثقافة.
   5. إضافة الماء إلى الحافة الخارجية للوحة الثقافة لتوفير الرطوبة.
   6. منذ الأمعاء الجنين يخضع موجات تشبه تحوي من انكماش في الثقافة، إضافة 100 ميكرولتر من 1: 5 من حل زيلازين في برنامج تلفزيوني 1X إلى 3 مل من وسائل الإعلام للسيطرة على حركة الأمعاء أثناء التصوير. وهذه الجرعة سيطرة الحركات المعوية لمدة 8-10 ساعة دون المساس تطوير زغابة.
   7. للحصول على عرض عرضية من الأمعاء، تضمين الأمعاء الحية في حل الاغاروز 3-4٪ وخفض أبواب سميكة (150-500 ميكرون) على vibratome. تتناسب مع صلابة من الاغاروز مع صلابة من الأمعاء يجري قص وتحدد تجريبيا المرحلة التنموية. عموما، حل الاغاروز 3٪ يعمل بشكل جيد للأمعاء الذين تقل أعمارهم عن E14.5 وحل 4٪ يعمل بشكل جيد للأمعاء E15-E16.
   8. الغراء الأقسام vibratome إلى غشاء البولي اضافته على شاشة شبكة (كما في القسم 3.1.1) والثقافة كما وصفها في القسم 3.1.2-3.1.6.
   9. إجراء التصوير الحي باستخدام ثنائي الفوتون مضان المجهر متحد البؤر (ليزر الإثارة بين 690-1،040 نانومتر) على الوقوف بشكل مستقيم مع جدول الانضباطي.
   10. ثنائي الفوتون الليزر ضبطها إلى 900 نانومتر يوفر الاختراق العميق مع أفضل قرار لإشارات GFP. أنه يقلل من الأضرار التي لحقت الأنسجة أثناء التصوير. بالإضافة إلى ذلك، وضع قوة الليزر إلى أدنى الانبعاثات الممكن يقلل من تلف الأنسجة. عادة للحصول على الإثارة جيدة من GFP، واستخدام السلطة 12٪ على الليزر ثنائي الفوتون.

النتائج

في ثقافة Explants كاملة من أمعاء الجنين يسمح للتحليل الموقع، والتوزيع، ومدة الجزيئات مما يشير إلى أن تنسيق التنمية المعوية، حيث أن هذا النظام يمكن التلاعب في الإشارات مع الكواشف الدوائية أو البروتينات المؤتلف. نظام الثقافة transwell (الشكل 1A، مستنسخة من التون وآ?...

Discussion

الطبيعة الديناميكية والتفاعلات المعقدة للأنسجة الأمعاء وضع التصور 3D تتطلب أن يكون التقدير الكامل لهذه الأحداث التخلق. مع تطور تكنولوجيا التصوير، والقدرة على فحص زغابة التشكل بالتفصيل على تطوير / تحسين ومعها، وتعزيز فهم التواصل والتفاعل المكاني خلال توالد بشكل كبي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	2 pairs
70% Ethanol
1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14040-133	500 ml
6 well plates	Costar	3516
24 well plates	Costar	3524
60 x 15 mm petri dishes	Falcon	451007
Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes	Corning Costar	3428	6 inserts per plate
BGJb media	Invitrogen	12591-038	500 ml
PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin)	Gibco	15140
Ascorbic Acid	Sigma	A0278	make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C
Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly)	Fisher	21-180-10	remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet.
6 inch glass pasteur pipets
Capillary Tubes	World Precision Instruments	TW100F-4	pull to needles
4% Paraformaldehyde			made in 1 x PBS, pH to 7.3
Culture plates	Falcon	353037
Fine mesh stainless steel screen	purchase at hardware store
Polycarbonate membranes	Thomas scientific	4663H25	alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports
Instant glue	purchase at hardware store	gel based preferrably
35 x 10 mm plates	Falcon	351008
7% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
minutien pins	Fine Science Tools	26002-20
Phenol red free media (DMEM)	Gibco	21063-029
Xylazine (100 mg/ml)	AnaSed	139-236
Matrigel	BD	356231	basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free
3-4% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
Imaging of fixed intestines
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
vaseline	purchase at pharmacy		used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
lanolin	Sigma	L7387	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
paraffin	Surgipath	39601006	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
70% glycerol in 1 x PBS
Focus clear and Mount Clear	CelExplorer Labs Co.	F101-KIT
Modeling clay	purchase at art supply store
double stick tape
cotton applicator swabs
plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm)	Tissue Tek	4565
slides
coverslips
lab wipe	Kimberly Clark	34155	lint free delicate task wipe
Theiler staging chart			http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf
Leica SP5X confocal microscope	Leica		Used to conduct the live imaging
Leica DMI 6000 stand	Leica		Used to conduct the live imaging
Aqueous mounting medium (Prolong Gold)	Molecular Probes	P36930
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
24 well plate	Costar	3524
Triton X-100	Sigma	T-8787	used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS
Goat serum			used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS
Tween20	Sigma	P9416