جنبا إلى جنب تجميد الضغط العالي والسريع تجميد استبدال الأنسجة النباتية للنقل المجهر الإلكتروني

Summary

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Abstract

منذ 1940s انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) وقد تم توفير علماء الأحياء مع الصور فائقة الدقة من المواد البيولوجية. ومع ذلك، وبسبب البروتوكولات شاقة وتستغرق وقتا طويلا التي تتطلب أيضا خبرة في إعداد العينات خالية من القطع الأثرية، لا يعتبر TEM تقنية سهلة الاستخدام. إعداد نموذج التقليدي للTEM تستخدم مثبتات كيميائية للحفاظ على الهياكل الخلوية. الضغط العالي التجميد هو cryofixation العينات البيولوجية تحت الضغوط العالية لإنتاج معدلات التبريد سريعة جدا، مما يحد تشكيل الجليد، والتي تضر بسلامة التركيب الدقيق الخلوية. تجميد الضغط العالي واستبدال تجميد حاليا أساليب اختيار لإنتاج أعلى مستوى من الجودة في التشكل أقسام الراتنج لTEM. هذه الأساليب تقلل من القطع الأثرية التي ترتبط عادة مع المعالجة التقليدية للTEM المقاطع رقيقة. بعد cryofixation يتم استبدال المياه المجمدة في العينة مع السائلالمذيبات العضوية في درجات حرارة منخفضة، وتسمى عملية استبدال التجميد. عادة يتم استبدال تجميد على مدى عدة أيام في مخصص، معدات مكلفة. هناك ابتكار مؤخرا يسمح للعملية أن تكتمل في ثلاث ساعات، بدلا من اليومين المعتادة. وعادة ما يعقب ذلك عدة ايام اخرى لإعداد عينة تشمل التسلل وتضمينها في راتنجات الايبوكسي قبل باجتزاء. هنا نقدم بروتوكول الجمع بين تجميد الضغط العالي واستبدال تجميد سريع تمكن مصنع تثبيت العينة التي يتعين إنجازها في غضون ساعات. يمكن بسهولة بروتوكول تكييفها للعمل مع الأنسجة أو الكائنات الحية الأخرى. الأنسجة النباتية هي التي تثير قلقا خاصا بسبب وجود فراغات الهوائية والحويصلات مملوءة بالماء التي تعيق تجميد الخالية من الجليد من المياه. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عملية التثبيت الكيميائية طويلة خاصة في النباتات بسبب جدران الخلايا إعاقة تغلغل المواد الكيميائية إلى أعماق الأنسجة. الأنسجة النباتية هي بالتالي particularly تحديا، ولكن هذا البروتوكول هو موثوق بها وينتج عينات من أعلى مستويات الجودة.

Introduction

لدينا معرفة التركيب الدقيق خلية تأتي أساسا من المجهر الإلكتروني، والتي يمكن حلها من التفاصيل في حدود بضع نانومتر ^1. على الرغم من كونها قوية جدا في قرار TEM لا تعتبر سهلة الاستخدام، وإعداد العينات يتطلب وقتا طويلا وبروتوكولات شاقة، ويتطلب بعض الخبرة من ممارس. تثبيت التقليدي للعينات والجمع بين استخدام الألدهيدات ورباعي أكسيد الأوزميوم قبل مزيد من المعالجة التي تشمل الجفاف، والتضمين في الراتنج ومن ثم باجتزاء لإنتاج المقاطع رقيقة جدا أن يتم بعد ذلك ملطخة المعادن الثقيلة. ومع ذلك، فمن المعروف أن التثبيت الكيميائي يمكن ان تنتج القطع الأثرية بما في ذلك تجميع البروتين وفقدان الدهون ^1، والتغيرات في الأغشية التي تؤثر في نهاية المطاف عدة مقصورات الخلوية ^2. وتنسب هذه القطع الأثرية إلى حد كبير إلى بطء معدل التثبيت والجفاف في درجة حرارة الغرفة ^{3 و 4 و 5.}

"jove_content"> Cryofixation من ارتفاع ضغط التجمد (HPF) يتجنب معظم القطع الأثرية التي تسببها التثبيت الكيميائي. مبدأ cryofixation هو أنه يقلل من درجة التجمد للمياه بنسبة 20 درجة، يبطئ التنوي ونمو بلورات الثلج ويزيد من لزوجة الماء في عينة بيولوجية بحيث المكونات الخلوية ويجمد أساسا ^{6 و 7.} يقلل HPF و درجة حرارة العينة إلى أن من النيتروجين السائل، تحت ضغط عال جدا (210 ميجا باسكال أو 2،100 بار) في ميلي ثانية. عند القيام به بشكل صحيح HPF يمنع تشكيل بلورات الثلج الكبيرة التي يمكن أن تسبب ضررا كبيرا على التركيب الدقيق الخلية. HPF يمكن استخدامها لإصلاح عينات من سمك 100-200 ميكرون في تركيزات نموذجية من المواد المذابة البيولوجية ^7. هناك ملاحظات عديدة على الفيزياء والمبادئ الأساسية HPF، على سبيل المثال ^{1 و 7 و 8.}

بعد HPF، يتم تحضين العينات في درجة حرارة منخفضة (-78.5 درجة مئوية إلى -90 و# 176؛ C) في وجود المذيبات التي تحتوي على مثبتات الكيميائية العضوية السائلة مثل رباعي أكسيد الأوزميوم، عموما لبضعة أيام. عند هذه الدرجة المنخفضة، يتم استبدال الماء في عينة من المذيبات العضوية، وعادة الأسيتون أو الميثانول ^{1، 9.} وهكذا، وهذا ما يسمى عملية الاستبدال تجميد (FS). ثم يتم تسخين العينة تدريجيا وخلال هذا الوقت هو ثابت، وعادة مع رباعي أكسيد الأوزميوم وخلات اليورانيل ^9. يشابك في درجات حرارة منخفضة لديه ميزة تحديد الجزيئات التي يتم يجمد ^1. لذا FS تنتج عينات عالية الجودة مقارنة بتلك التي تحددها التثبيت الكيميائية التقليدية في درجة حرارة الغرفة، ولا سيما أنه يؤدي إلى تحسين الحفاظ التركيبية، والحفاظ على أفضل استضداد وتقليل فقدان المكونات الخلوية غير منضم ^{10 و 11.}

ويتم معظم FS على مدى فترات زمنية طويلة، وعادة ما تصل إلى عدة أيام. هذا هو ترو خاصةالبريد لمحطات عينات ^{12، 13، 14.} بروتوكول الأخيرة التي وضعتها وماكدونالد ويب يقلل بدرجة كبيرة من الوقت لFS من عدة أيام إلى عدة ساعات ^15. في هم سريعة الاستبدال تجميد (QFS) الإجراء، يتم FS خروج أكثر من 3 ساعات، بينما في FS السوبر سريعة تتم معالجة عينات (SQFS) في 90 دقيقة. نوعية العينات التي تنتجها هذه الأساليب هي مماثلة لتلك التي حققها بروتوكولات FS التقليدية. لقد اعتمد بروتوكول QFS لالتجهيز النهائي من عينات النبات بعد HPF. وقد ثبت هذا لتوفير الوقت فحسب، بل أيضا المال، كما QFS وSQFS استخدام معدات المختبرات المشتركة بدلا من آلات مكلفة المتاحة تجاريا FS.

الأنسجة النباتية غالبا ما تكون صعبة للغاية للتحضير لTEM. في المتوسط، الخلايا النباتية هي أكبر من أي الخلايا البكتيرية أو الحيوانية. وجود مسعور بشرة شمعية، جدران الخلايا سميكة، وفجوات مملوءة بالماء كبيرة تحتوي على الأحماض العضوية، hydrolases والفينول جompounds التي قد تشغل ما يصل إلى 90٪ من حجم الخلية الكلي ^16، ووجود فراغات الهوائية يقلل بشدة التوصيل الحراري للنظام ^17. علاوة على ذلك، في حالة النباتات، سمك العينة يتجاوز دائما ما يقرب من 20 ميكرون، والحد الأقصى لاستخدام التثبيت الكيميائي. في هذه السماكات، وانخفاض التوصيل الحراري من الماء يمنع معدل تجميد أكثر من -10،000 ° C / ثانية في وسط العينة. مطلوب هذا المعدل لتجنب تشكيل ضررا سداسية الجليد (بلورات الثلج بكثافة أقل وأكبر من 10 إلى 15 نانومتر) ^8. معا، وهذه التحديات الحالية على حد سواء تجميد السليم للعينة وFS اللاحقة. ومع ذلك، cryofixation هو أفضل طريقة لتحديد العينات النباتية. هنا يتم تقديم بروتوكول للHPF-QFS من عينات الأنسجة النباتية. وهو يركز على الأنواع نموذج نبات الأرابيدوبسيس thaliana، ولكن تم أيضا استخدامها مع نيكوتيانا benthamiana. توضح النتائج النموذجية التي HPF-QFS تنتج ساmples من نوعية مماثلة لالتقليدية HPF-FS في جزء من الوقت. مع التعديلات المناسبة، كما يمكن استخدام هذا البروتوكول للعينات البيولوجية سميكة نسبيا الأخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: الإجراء QFS يتطلب الحذر الشديد والحذر من قبل المستخدم، ونحن تسليط الضوء على هذه احتياطات السلامة هنا كما تنبيهات وملاحظات عند الاقتضاء.

1.Preparation لتشغيل HPF

1. قبل البدء في إعداد العينات، تشغيل الثلاجة الضغط العالي باتباع تعليمات الشركة الصانعة.
   ملاحظة: وحدة HPF المستخدمة في هذا البروتوكول هو وحدة مدمجة Wohlwend 02 (الشكل 1A)، ويستغرق حوالي ساعة واحدة إلى واحد ونصف الداخلي البدء قبل ان يفوت HPF يمكن أن تبدأ.
   1. تبديل على Wohlwend الاتفاق 02 ارتفاع ضغط الفريزر.
      1. تشغيل الأداة من خلال تحويل التبديل الرئيسي من "0" إلى "1".
      2. الافراج عن الهواء المضغوط إلى الجهاز.
      3. الافراج النيتروجين السائل إلى الجهاز.
      4. اضغط على زر "SYSTEM تجف".
      5. بعد 30 دقيقة، اضغط على "التنفسيM تجف "الزر مرة أخرى.
      6. اضغط على زر "ON / OFF" للتبديل على الصك.
      7. اضغط على زر "النيتروجين".
      8. يسمح الجهاز ليبرد لمدة 20 دقيقة حتى لو كان "محرك الأقراص في" زر ومضاءة بالفعل.
      9. و"محرك الأقراص في" أضواء زر حتى.
      10. اضغط على "محرك الأقراص في" زر.
      11. اضغط على زر "AUTO".
      12. "نظام READY" أضواء زر حتى.
      13. وضع مسبار درجة الحرارة والضغط داخل غرفة الضغط واقفلها مع دبوس.
      14. اضغط على زر "AUTO JET". هذه الخطوة الشيكات أن زيادة الضغط وانخفاض درجات الحرارة على النحو المطلوب. أساسا التشغيل التجريبي. ومن المتوقع (الشكل 1B) انخفاض حاد في درجات الحرارة وارتفاع حاد في الضغط.
      15. تنفيذ اثنين من أكثر دورات JET.

2. التحضير لReceiviعينات نانوغرام المجمدة

1. ملء صندوق معزول يحتوي على أصحاب cryovial مع النيتروجين السائل (انظر تحذيرات السلامة)، بحيث تتم تغطية حاملي تماما (الشكل 1C).
   ملاحظة: استخدام معدات الوقاية الشخصية بما في ذلك cryogloves ونظارات واقية عند التعامل مع النيتروجين السائل.
2. وضع العدد المناسب من قارورة تحتوي على المتوسطة FS إلى أصحاب أنبوب الألمنيوم في النيتروجين السائل (الشكل 1C). مع هذا البروتوكول ما يصل إلى أربعة أقراص تحتوي كل منها على عينة واحدة يمكن وضعها في cryovial واحد.
   ملاحظة: يجب أن يكون المسمى وقارورة بآلة حادة مثل الكاتب يميل الماس وقلم رصاص لينة جدا.
   1. لتثبيتي خلال QFS استخدام 1٪ أوسو ₄ و 0.1٪ خلات اليورانيل في الأسيتون ^9. إعداد الحل في حجم كبير، الاستغناء aliquots من 1.5 مل في cryovials وتخزينها مجمدة في النيتروجين السائل.
      ملاحظة: اتبع تحذيرات السلامة للتعامل مع أوسو ₄ وخلات اليورانيل.
      ملاحظة: أوسو ₄ وخلات اليورانيل هي مواد كيميائية خطيرة ويجب التعامل معها في غطاء الدخان في حين ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) بما في ذلك الأحذية المغلقة الأصابع، معطف المختبر وقفازات.
      ملاحظة: cryovials تستخدم لعقد عينات لQFS ينبغي أن يكون من الصعب يا الدائري لضمان أن تظل أنابيب مختومة خلال QFS لتجنب تسرب أوسو _4.
3. تحضير عجينة عن طريق خلط الخميرة خميرة الخباز مع حجم مساو تقريبا من 10٪ الميثانول مع مسواك أو غيره صك من هذا القبيل حتى عجينة ناعمة. يعمل عجينة الخميرة باعتبارها cryoprotectant خارج الخلية، ويستخدم لملء الفضاء حول العينة في حامل العينة. كمية من معجون يعتمد على عدد من العينات. لمدة 10 عينات أو أقل لصق (1 مل) يمكن أن تكون مختلطة في أنبوب microcentrifuge.

تجميد 3. ارتفاع ضغط العينات

1. إزالة ورقة (أو الأنسجة الأخرى) من الاهتمام من المصنع ووضعه برفق على قطعة من DENTAل الشمع أو غيرها من سطح القطع. استخدام لكمة من 2.0 مم أو الحجم المطلوب لخفض عينة من ورقة. التعامل مع العينة بلطف مع زوج من ملقط والعمل في أسرع وقت ممكن.
2. تعمل تحت مجهر تشريح، ضع القرص ورقة في الجانب 0.2 ملم من نوع (أ) الناقل العينة وتغطية تماما في معجون الخميرة. تأكد من أن القرص يمتلئ تماما ولصق هو المستوى مع حافة حامل من خلال تخفيف عجينة مع الفرشاة الجميلة (الشكل 2).
3. وضع الناقل في حامل العينة. تغطية عينة مع نوع B الناقل العينة، سطح مستو أسفل.
   ملاحظة: يجب أن يكون حامل عينة جاف وعند درجة حرارة الغرفة.
4. أخذ العينة في حامل العينة، أدخله في الجهاز وبدء دورة التجميد عن طريق الضغط على زر "JET AUTO"، الذي ينبغي أن يتم في ثانية أو اثنتين.
5. العمل في أسرع وقت ممكن، وإزالة حامل من الجهاز ومكان غيض عقد عصيدةلو في النيتروجين السائل في صندوق معزول على رأس الجهاز HPF. تزج نصائح من اثنين من أزواج من الملقط في النيتروجين السائل لفتور لهم.
   ملاحظة: بعد تجميد، يجب التعامل مع الناقلين فقط مع ملقط تبريد النيتروجين السائل. الدافئة (درجة حرارة الغرفة) ملقط وغالبا ما تكون سبب الفشل في cryotechniques.
6. فتح cryovial تحتوي على وسائل الإعلام FS، ووضع غطاء على جانب منطقة الجزاء. مع المعونة من زوج من ملقط تبريد النيتروجين السائل، وإزالة بلطف القرص من صاحب العينة، وضمان أن القرص هو دائما في النتروجين السائل أو البخار. العمل في بخار النيتروجين السائل، عقد أنبوب FS مع واحد ملقط تبرد قبل واستخدام البعض لوضع حامل في القارورة FS. المسمار غطاء القارورة FS مرة أخرى. لا اعتراض أي النيتروجين السائل في القارورة.
   ملاحظة: عند نقل العينات إلى cryovials لQFS، ضمان عدم وجود النيتروجين السائل محاصرين في قارورة. يوسع النيتروجين السائل 700 أضعاف خلال ارتفاع درجات الحرارة وأي في Trappeد النيتروجين السائل يمكن أن يسبب انفجارات خلال هذا الوقت.
7. كرر الخطوات من 3،1-3،7 حتى يتم تجميد جميع العينات المطلوبة. يمكن وضع أقراص متعددة ورقة تحتوي على نفس نوع العينة في نفس القارورة. لاحظ أن صاحب العينة يحتاج إلى أن تجفف وتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة بين أشواط التجمد. للقيام بذلك بسرعة، تسخينها مع مجفف ضربة، ورصد درجة الحرارة عن طريق اللمس.

4. التحضير لتجميد تبديل

1. تماما تزج كتلة سخان الألومنيوم في النيتروجين السائل لمدة 10 دقيقة أو حتى يتوقف غليان nucleate. في حين أن هذا يجري، ضع طبقة من الثلج الجاف (1-2 سم) في الجزء السفلي من الحاويات تستخدم غرفة FS (الشكل 3). حاوية الستايروفوم أو دلو الثلج يمكن استخدامها لFS، جنبا إلى جنب مع سحق الثلج الجاف أو الكريات.
2. إدراج بسرعة cryovials تحتوي على عينات جنبا إلى جنب مع تحقيق درجة الحرارة في الصفوف الوسطى من كتلة سخان. تأكد من أن أغطية علىوثمل قارورة بإحكام على ذلك أن وسائل الإعلام FS لا يتسرب خلال FS. بدء تسجيل درجات الحرارة.
   1. جعل التحقيق في درجة الحرارة عن طريق وضع الحرارية من خلال الجزء العلوي من cryovial بحيث تصل إلى أسفل الأنبوب. ختم غطاء أنبوب مع الراتنج بحيث لا تسرب السائل خارج. ملء الأنبوب مع 1.5 مل الأسيتون في بداية كل تشغيل QFS.
3. باستخدام cryogloves معزول أو ملقط كبيرة، من اجل الخروج عن النيتروجين السائل من كتلة سخان. والحرص على عدم اجل الخروج من cryovials.
   ملاحظة: استخدام معدات الوقاية الشخصية بما في ذلك cryogloves ونظارات واقية عند التعامل مع النيتروجين السائل.
4. وضع كتلة تحتوي على قوارير على طبقة من الثلج الجاف في غرفة QFS. تأكد من وضع كتلة بحيث أنابيب يكذبون أفقيا ولكن مع الميل الصاعد الطفيف. ينبغي أن يكون هناك أي تسرب إذا تم استخدام cryovials الصحيحة.
5. حزمة غرفة QFS مع الثلج الجاف بحيث يتم تغطية الأنابيب FS، على الرغم من أنه ليس من الضروريتغطية الجزء العلوي من كتلة. وضع غطاء على الغرفة.

5. السريع FS

ملاحظة: إجراء المدى QFS في غطاء الدخان في حالة أن أي تسرب ₄ أوسو يحدث عن غير قصد على الرغم من الاحتياطات الأخرى.

1. وضع غرفة QFS على منصة دوار شاكر في غطاء الدخان وتناوب على 125 دورة في الدقيقة لمدة 120 دقيقة. خلال هذا الوقت درجة حرارة كتلة ينبغي أن تزيد تدريجيا إلى حوالي -80 ° C. التحريض يضمن خلط المكونات لFS أفضل.
   ملاحظة: وضع شاكر في غطاء الدخان وموقف هود باب الدخان يجب أن تكون هي نفسها في جميع أنحاء الداخلي QFS ولكل QFS تشغيل لضمان الاحترار ثابت من العينات.
2. إزالة الثلج الجاف من غرفة ومواصلة تهتز لمدة ساعة أخرى.
   ملاحظة: درجة الحرارة يجب أن تزيد إلى حوالي -15 ° C إلى -20 ° C.
3. إزالة العينات ومسبار درجة الحرارة من غرفة QFS وضعها علىشاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة أخرى، حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. إيقاف تسجيل درجات الحرارة.
4. خلال FS، وإيقاف آلة HPF.
   1. إغلاق الصنبور من خزان النتروجين السائل بينما يتم ملء آلة HPF مع النيتروجين.
   2. اضغط على زر "النيتروجين".
   3. الانتظار حتى الحمراء "المكبس لأسفل" تطفئ الخفيفة.
   4. اضغط على "ON / OFF" زر.
   5. اضغط على زر "SYSTEM تجف".
   6. قطع إمدادات الهواء المضغوط إلى الجهاز.
   7. بعد مدة لا تقل عن 12 ساعة (لضمان التجفيف من أي رطوبة)، إيقاف تشغيل الجهاز عن طريق تحويل المفتاح الرئيسي من "1" إلى "0".

6. مشاركة FS معالجة

1. إزالة بعناية وسائل الإعلام FS مع الماصات البلاستيكية ونقل مكان في الحاوية المناسبة للنفايات السامة.
   ملاحظة: أوسو ₄ وخلات اليورانيل هي مواد كيميائية خطرةوينبغي التعامل معها في غطاء الدخان في حين ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) بما في ذلك الأحذية المغلقة الأصابع، معطف المختبر وقفازات.
2. غسل العينات أربع مرات مع 100٪ الأسيتون. جمع يغسل الأولين ووضع في حاوية النفايات السامة.
3. باستخدام ملقط غرامة، وإزالة عينات الأنسجة من أصحاب. الاحتفاظ بعينات الرطب مع الأسيتون كما يتم ذلك، والعمل بلطف شديد لتجنب كسر العينات.
   ملاحظة: ليس غريبا وأنه قد يكون في الواقع مفيدة لديك عجينة الخميرة تقع بعيدا عن العينات في هذه المرحلة. معجون الخميرة عادة البني الداكن جدا في حين أن الأنسجة ورقة لا تزال خضراء.
4. جمع العينات في cryovials تحتوي على الأسيتون. المضي قدما في إعداد العينات (تسلل والتضمين) لTEM وفقا لبروتوكولات المعتادة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وقد تم الحصول على النتائج المقدمة أدناه باستخدام الاتفاق Wohlwend 02 لHPF (الشكل 1A). واحد الميزة الرئيسية لهذا الصك هو سهولة استخدام ناقلات العينة وحامليها. عند استخدام الأدوات الأخرى، يوصي ماكدونالد أن اثنين من المستخدمين يجب تنفيذ إعداد العينات وHPF، واحدة إعداد ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نجاح بروتوكول المقدمة هنا يعتمد بشكل كبير على المستخدم. أولا، يتعين إعداد متقدمة لضمان توفير جميع المواد اللازمة متوفرة وبكميات كافية لإكمال كامل المدى HPF-QFS. ثانيا، يجب على المستخدم العمل بسرعة، والانتقال من خطوة إلى خطوة بطريقة فعالة أن يقلل معالجة عينة، وبالتالي ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch - Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 ml	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs