طلب خلايا واحدة والأجنة واحدة في 3D الحبس: جهاز جديد لفحص المحتوى العالي

Summary

نحن الإبلاغ عن الجهاز وطريقة جديدة لدراسة الخلايا والأجنة. الخلايا وحيدة هي أمر بالضبط في صفائف microcavity. من الحبس 3D هو خطوة نحو بيئات 3D التي واجهتها في الظروف الفسيولوجية ويسمح التوجه عضية. من خلال التحكم في شكل الخلية، وهذا الإعداد يقلل من التغيرات المبلغ عنها في فحوصات القياسية.

Abstract

وعادة ما تكون لوحظ الخلايا البيولوجية في (2D) الأسطح المسطحة. هذا الشرط غير الفسيولوجية، والظواهر والأشكال تختلف اختلافا كبيرا. الفرز على أساس الخلايا في مثل هذه البيئات لديها قصور بالتالي خطيرة: عضيات الخلية تظهر الظواهر المتطرفة، الأشكال التضاريسية خلية والأحجام هي عضيات الخلية غير متجانسة و / أو محددة لا يمكن تصور بشكل صحيح. وبالإضافة إلى ذلك، توجد خلايا في الجسم الحي في بيئة 3D. في هذه الحالة، خلايا تظهر الظواهر المختلفة وذلك أساسا بسبب تفاعلها مع المحيط المصفوفة خارج الخلية من الأنسجة. من أجل توحيد وتوليد ترتيب الخلايا وحيدة في بيئة 3D من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة لفحوصات خلية القاعدة، ونحن التقرير هنا التصنيع الدقيق وتطبيقات جهاز لفي المختبر زراعة الخلايا 3D. ويتكون هذا الجهاز من مجموعة 2D من microcavities (عادة 10 ⁵ تجاويف / سم ^2)، مليئة الخلايا واحد أو الأجنة لكل منهما. POSI خليةنشوئها، والشكل، والاستقطاب وتنظيم الخلايا الداخلية أصبحت ثم تطبيع تظهر بنية 3D. كنا صب متماثلة إلى نمط مجموعة من microcavities، (PDMS) طبقة "eggcups"، على لثنائي ميثيل بولي سيلوكسان رقيقة الالتزام على ساترة. كانت مغطاة تجاويف مع فبرونيكتين لتسهيل التصاق. تم إدراج الخلايا بواسطة الطرد المركزي. تم تحسين نسبة الملء لكل نظام والسماح لتصل إلى 80٪. وأكد الخلايا والأجنة جدوى. طبقنا هذه المنهجية لتصور من العضيات الخلوية، مثل جهاز نواة وجولجي، ودراسة العمليات النشطة، مثل إغلاق حلقة cytokinetic خلال الانقسام الخلوي. يسمح هذا الجهاز تحديد من الميزات الجديدة، مثل التراكمات الدورية وعدم تجانس من الميوسين والأكتين خلال إغلاق حلقة cytokinetic والظواهر المتراصة لجولجي والمواءمة النواة. نحن ميزت طريقة لخلايا الثدييات، الانشطار الخميرة، في مهدها الخميرة، C. ايليجانس ثإيث التكيف المحددة في كل حالة. وأخيرا، وخصائص هذا الجهاز تجعل من اهتمام بوجه خاص لفحوصات فحص المخدرات والطب الشخصي.

Introduction

الحالي في المقايسات خلية مقرها المختبر هما ثنائي الأبعاد (2D). هذا التكوين غير الطبيعي لخلايا الثدييات، وبالتالي ليست ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ^1؛ تظهر خلايا مجموعة متنوعة من الأشكال والأحجام والظواهر غير المتجانسة. ما يقدمونه قيود خطيرة إضافية عند تطبيقها على الطلبات الفرز، مثل توزيع المختلين داخل الطائرة والظواهر المتطرفة من العضيات الخلوية (ألياف الإجهاد، وعلى وجه الخصوص). هذا مهم بشكل خاص في التجارب السريرية لاختبار المخدرات، حيث يتم إنفاق الميزانيات الكبيرة كل عام. معظم هذه الأدوية تفشل على الرغم من عند تطبيقها على النماذج الحيوانية بسبب حالة الثقافة 2D الاصطناعية في المراحل المبكرة من فحص المخدرات. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام هذا النهج، عضيات الخلية المحددة لا يمكن تصور صحيح، مثل حلقة أكتوميوزين cytokinetic خلال الانقسام الخلوي، وعموما الهياكل التي تتطور في الطائرة عموديا على مستوى المراقبة. بعضوقد اقترحت المقايسات 2D جديدة من أجل التغلب وقد لوحظ السلبيات المذكورة أعلاه ومعلومات هامة لتنظيم الهيكل الخلوي ^2،3. ومع ذلك، هذه المقايسات لا تزال موجودة واحد قيدا خطيرا: تظهر خلايا النمط الظاهري انتشارها جدا على عكس ما لوحظ في الجسم الحي، حيث تظهر خلايا بنية 3D. هذه القطع الأثرية المرتبطة مع أسلوب الثقافة قد يؤدي الميزات غير الفسيولوجية مثل ألياف الإجهاد تعزيز ^1،4،5.

توفر ثلاثي الأبعاد تجارب زراعة الخلية مزايا متعددة بالمقارنة مع 2D بيئات ^6،7. فهي من الناحية الفسيولوجية أكثر أهمية، والنتائج هي بالتالي ذات مغزى. وكمثال على ذلك، فإن الخلايا جزءا لا يتجزأ من الهلاميات المائية تظهر هياكل تشبه 3D ولكن الأشكال التضاريسية التي تختلف من خلية واحدة إلى ^8،9 آخر. ومع ذلك، الأشكال التضاريسية التي تختلف من خلية واحدة إلى أخرى، مما يعقد التطبيقات الفرز. استراتيجية بديلة هو تضمين واحدالخلايا في تجاويف microfabricated ^10،11. موقف الخلية، والشكل، والاستقطاب وتنظيم الخلايا الداخلية يمكن أن تصبح ثم تطبيع. وإلى جانب توفير بنية تشبه 3D إلى الخلايا، microcavities كما يسمح للدراسات فحص عالية المحتوى ^10،12-14. الخلايا وحيدة يمكن أن يؤمر في المجهرية والعضيات الخلوية والتطورات التي يمكن ملاحظتها بشكل متواز. يوفر هذا الانتظام إحصاءات جيدة مع انخفاض عدد الخلايا وقرارات الزمنية / المكانية أفضل. مركبات مفيدة هي أسهل لتحديد موثوق.

في هذه الدراسة، نقدم لك مجموعة من تلفيق وتطبيق نظام جديد ثقافة الخلايا وحيدة مثل 3D للتطبيقات عالية المحتوى الفرز ^10،12،13. يتكون الجهاز من مجموعة من microcavities من اللدائن المرنة (10 ⁵ تجاويف / سم ^2)، صاغ "eggcups" (EC). هي الأمثل الأبعاد والحجم الكلي للالمفوضية الأوروبية في هذا العمل إلى حجم نموذجي للخلايا NIH3T3 وهيلا الفرديةأثناء انقسام الخلية. يتم تحديد لتوجيه صحيح شكل خلية لتصور من العمليات النشطة - التشكل من تسوس الأسنان - أسطواني. يستخدم صب متماثلة إلى نمط مجموعة من المفوضية الأوروبية في الصعود إلى ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان رقيقة (PDMS) طبقة الالتزام على الزجاج ساترة ^15،16. يتم إدخال الخلايا في المفوضية الأوروبية عن طريق الطرد المركزي. نحن هنا التقرير المراقبة وتطبيع العضيات الخلوية (ألياف الأكتين الإجهاد، جهاز جولجي والنواة) في 3D (EC) مقارنة مع نفس الخلايا على 2D (شقة) السطوح. نحن أيضا الإبلاغ عن مراقبة العمليات الديناميكية النشطة مثل إغلاق حلقة أكتوميوزين cytokinetic خلال خلية الانقسام ^17. وأخيرا، وتبين لنا نتائج هذه المنهجية على أنظمة أخرى مع الجدران الصلبة، مثل مهدها الخميرة، الخميرة الانشطار وC. الأجنة ايليجانس التي تؤكد انطباق منهجية لدينا مجموعة واسعة من أنظمة نموذجية.

نقدم المقبل لص مفصل وشاملrotocol من أجل افتعال وتطبيق "eggcups" لالتصنيع الدقيق 3D. نهجنا هو بسيط ولا يحتاج إلى غرفة نظيفة. ونحن نتوقع أن هذه المنهجية الجديدة ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص لفحوصات فحص المخدرات والطب الشخصي، في استبدال أطباق بتري. وأخيرا، سوف يكون لدينا جهاز مفيد لدراسة توزيع استجابات الخلايا للمؤثرات الخارجية، على سبيل المثال في سرطان ¹⁸ أو في البحوث الأساسية ^19.

Protocol

1. التصنيع الدقيق من "Eggcups"

1. تلفيق للماجستير: Microcavities صفيف
   1. حرارة رقاقة 3 '' السيليكون تصل إلى 200 درجة مئوية لتتبخر أي وجود الرطوبة.
   2. تدور معطف طبقة رقيقة من SU-8 مقاومة للضوء. ضبط مستوى الصوت من الراتنج والغزل السرعة حسب المطلوب سمك ومقاومة للضوء نوع. وهذا سمك تملي عمق "eggcups" (EC). لطبقة سميكة 30 ميكرون وSU-8 2025، تدور معطف في 2800 دورة في الدقيقة.
   3. قبل خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (الخطوة 1 من 2) لسميكة SU-8 2025 طبقة 30 ميكرون. التكيف مع الوقت اعتمادا على نوع مقاوم الضوء وسمك المطلوب. تحقق ورقة البيانات المصنعة للحصول على مزيد من التفاصيل.
   4. قبل خبز الرقاقة عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (الخطوة 2 من 2) لسميكة SU-8 2025 طبقة 30 ميكرون. التكيف مع الوقت اعتمادا على نوع مقاوم الضوء وسمك المطلوب. تحقق ورقة البيانات المصنعة للحصول على مزيد من التفاصيل.
   5. تحميلرقاقة على اليجنر قناع للتعرض للأشعة فوق البنفسجية. وضع قناع ضوئيه على ذلك. يظهر قناع نمط من الميزات دائرية (أقراص) من 20 ميكرون في القطر. ضمان اتصال تام بين بعضها البعض.
      ملاحظة: مصنعي مختلفة توفر أقنعة ضوئيه. فإن القرار المكانية تحديد التكلفة النهائية. توفر أقنعة خلات حل مقبول (≈10 ميكرون) بتكلفة منخفضة. توفر أقنعة الكروم قرار أفضل ولكن هي أكثر تكلفة. تكييف بأقطار من الأقراص (من قناع ضوئيه) إلى حجم الخلايا. سوف أبعاد الأقراص على قناع تحديد قطرها من تجاويف في الجهاز. بأقطار صغيرة من شأنها أن تؤدي إلى تعبئة منخفضة؛ أيضا سوف كبيرة قطرها لا حصر الخلايا. لخلايا هيلا وNIH3T3، واقترح بأقطار من 20 ميكرون إلى 25 ميكرون.
   6. تحقق قوة المعرض السابق مصباح الأشعة فوق البنفسجية وتحسين زمن التعرض وفقا لذلك. أشرق (الطول الموجي = 365 نانومتر) 41.5 ثانية (أو الأمثل وقت التعرض) في250 ميغا جول / سم ^2.
      ملاحظة: SU-8 2025 هو مقاومة للضوء سلبي، وهو ما يعني أن المناطق التي تعرضت للأشعة فوق البنفسجية ويمكن الشفاء منه. في هذه الحالة، كانت ملامح دائرية سوداء وبقية شفافة. عمل مقاوم الضوء الإيجابي في الطريق المعاكس: ويشفى مناطق غير مكشوفة. حدد مقاومة للضوء وفقا لذلك، اعتمادا على التصميم والصور وقناع.
      ملاحظة: حماية العينين من الأشعة فوق البنفسجية مع نظارات السلامة المناسبة.
   7. إزالة بلطف قناع من طبقة مقاومة للضوء.
   8. بعد خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (الخطوة 1 من 2) لسميكة SU-8 2025 طبقة 30 ميكرون. بعد خبز الرقاقة عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (الخطوة 2 من 2) لسميكة SU-8 2025 طبقة 30 ميكرون. التكيف مع الوقت اعتمادا على نوع مقاوم الضوء وسمك المطلوب. تحقق ورقة البيانات المصنعة للحصول على مزيد من التفاصيل. بعد ما بعد الخبز، تبريد ويفر إلى درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء لحوالي 1 دقيقة.
   9. وضع رقاقة في زيادة ونقصان المغطي وإسقاط ملم قليلة من SU-8 المطور لتغطيةمنطقة رقاقة بأكملها. تطوير لمدة 2 دقيقة ثم تدور معطف في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. كرر الإجراء ثلاث مرات.
   10. شطف مع 2-بروبانول لضمان إزالة كاملة من غير المطورة SU-8. ظهور مناطق بيضاء هو مؤشر التنمية غير مكتملة. إذا كان الأمر كذلك، كرر الخطوة تطوير وقتا إضافيا.
   11. من الصعب خبز الرقاقة عند 200 درجة مئوية لضمان متانة المجهرية ملفقة. هذه الخطوة اختيارية.
   12. تخزين "رقاقة 3" مع المجهرية داخل 94 مم × 15 مم البوليسترين طبق بيتري.
       ملاحظة: ليست هناك حاجة لمعالجة السطوح، في silanization وجه الخصوص، للخطوات المقبلة.
2. تلفيق من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) طبق الاصل: أركان صفيف
   1. تخلط جيدا في نسبة 01:10 (ث / ث) وعبر رابط وقبل البوليمر ليصبح المجموع 30 غرام داخل أنبوب 50 مل.
      ملاحظة: استخدام نسبة 01:10 (ت / ت) ويعمل أيضا.
   2. أنبوب الطرد المركزي في 1800 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة فقاعات الهواء.
   3. إسقاط برفق PDMS على رأس المجهرية.
      ملاحظة: في حالة ظهور فقاعات الهواء خلال هذه الخطوة، ديغا العينة باستخدام مضخة فراغ لمدة 15-20 دقيقة.
   4. وضع العينة في الفرن على 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
      ملاحظة: وقت المعالجة يختلف بين المستخدمين، وجنبا إلى جنب مع عبر رابط: قبل البوليمر نسبة. هذه المرة سوف تملي جمود PDMS. ومن الموصى به لعلاج أكثر من 2 ساعة والتمسك فترة علاج الثابتة.
   5. استخدام مشرط لقطع بلطف مجال الاهتمام (ختم) من حوالي 1 سم ² الذي يضم حوالي 10 ⁵ microcavities أو "eggcups".
      ملاحظة: أول خطوة من نوعها في PDMS ثم قشر تشغيله بلطف. التحقق من جودة النسخة المتماثلة PDMS مع المجهر الضوئي.
3. تلفيق "eggcups" صب متماثلة. في ما يلي، موصوفة اثنين من استراتيجيات بديلة لتصنيع "eggcups". كل من البروتوكولات هي سيميلار وتقديم نتائج متطابقة:
   1. استراتيجية 1
      1. تفعيل الطابع PDMS ملفقة من قبل الأكسجين العلاج البلازما لمدة 30 ثانية. تخزين مؤقت الطوابع تفعيلها في طبق بيتري مغلق لمنع تراكم الغبار.
         ملاحظة: ضبط الوقت المعرض في حالة استخدام الغازات الأخرى للبلازما.
      2. ضع PDMS تنشيط ختم رأسا على عقب حتى (الجانب مع الهياكل) في طبق بيتري بجانب غطاء أنبوب 15 مل. ملء الغطاء مع 200 ميكرولتر من Trimethylchlorosilane (TMCS). إغلاق طبق بتري والسماح للsilanize ختم لمدة 7 دقائق.
         ملاحظة: بعض التشوه مؤقت على الطابع و / أو تغيير في اللون (أبيض) يمكن ملاحظة. وختم استعادة شكلها الأصلي في وقت قصير، وسوف لن تتأثر الهياكل.
         ملاحظة: TMCS تنتج الحادة الاستنشاق والجلد سمية، وغير قابلة للاشتعال للغاية (مع فلاش باك اشتعال قادرا على تحدث عبر مسافات طويلة). ونتيجة لذلك، فإنه ينبغي أن تستخدم في خزانة الدخان بعيدا عن مصدرالصورة الاشتعال.
      3. وضع ختم PDMS على زيادة ونقصان المغطي مع الهياكل رأسا على عقب فوق. وضع قطرة صغيرة من بضعة ميكرولتر (حوالي 20 ميكرولتر) من PDMS السائل (01:10 ث / ث عبر رابط: قبل البوليمر) على رأس الهياكل. تدور معطف في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لإيداع طبقة رقيقة من PDMS على أعلى من الهياكل.
         ملاحظة: في حالة عدم ختم تناسب تدور المغطي ظرف مكان الطابع على رأس طبق غطاء بيتري مع وجود ثقب صغير في وسطها.
      4. وضع ختم في الفرن عند 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لعلاج طبقة PDMS المغلفة تدور المودعة.
      5. تفعيل طبقة PDMS رقيقة عن طريق وضع ختم PDMS رأسا على عقب فوق، جنبا إلى جنب مع كوب ساترة # 0 25 مم في القطر، وذلك باستخدام الأكسجين نظافة البلازما لمدة 30 ثانية. المضي قدما بسرعة إلى الخطوة التالية.
         ملاحظة: Coverslips مع سمك أخرى والأشكال والأبعاد يمكن استخدامها أيضا. ومع ذلك، يمكن لبعض الهياكل الخلوية يكون من الصعب تصور حسب سمك ساترة المختارة والهدفالتكبير و / أو NA و / أو العمل عن بعد. التحقق من ورقة بيانات موضوعية.
      6. ضع في اتصال الطابع (الجانب مع الطبقة المغلفة تدور رقيقة) مع ساترة الزجاج. اضغط بلطف في جميع أنحاء سطح الطابع مع ملاقط لجعل "الترابط". وأخيرا، والحفاظ على الضغط المستمر على رأس ختم لحوالي 10 ثانية.
      7. بعد 30 دقيقة بلطف "قشر" الطابع من ساترة من أجل "تحرير" "eggcups" (انظر الشكل 1). شطف جيدا مع الإيثانول والجافة. إذا لم يتم الالتزام PDMS "eggcups 'حسنا على ساترة الزجاج (أي أنها فصل خلال' 'unpeeling خطوة)، والنظر في تعديل إعدادات نظافة البلازما وإعادة تشغيل في خطوة 1.3.1.5.
         ملاحظة: هذه الخطوة حساسة. إيلاء الاهتمام لتفادي الكسر ساترة و / أو انفصال طبقة PDMS رقيقة.
      8. الغراء قطعة صغيرة (مقبض) من PDMS شفي من 1 مم × 1مم × 3 مم في حجم عند حافة ساترة مع قطرة صغيرة من PDMS السائلة وعلاج PDMS كما كان من قبل. وهذا سوف يسهل التلاعب العينة بعد ذلك (انظر الشكل 1). هذه الخطوة اختيارية.
   2. استراتيجية 2
      1. Hydrophilize في PDMS الطوابع ملفقة من قبل الأكسجين العلاج البلازما لمدة 30 ثانية. تخزين مؤقت الطوابع تفعيلها في طبق بيتري مغلق لمنع تراكم الغبار.
         ملاحظة: ضبط الوقت المعرض في حالة استخدام الغازات الأخرى للبلازما.
      2. Hydrophilize 25 ملم coverslips قطر زجاج # 0 الأكسجين العلاج البلازما في 15 واط لمدة 30 ثانية. المضي قدما بسرعة إلى الخطوة التالية.
         ملاحظة: Coverslips مع سمك أخرى والأشكال والأبعاد يمكن استخدامها أيضا. ومع ذلك، فإن الهياكل الخلوية يكون من الصعب تصور حسب سمك ساترة المختارة والخصائص الموضوعية (انظر الملاحظة أعلاه).
      3. تدور معطف قطرة صغيرة من PDMS (01:10 ث / ث عبر رابط: قبل بولymer) من عدد قليل ميكرولتر على coverslips الزجاج. تدور معطف في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لسمك النهائي من حوالي 50 ميكرون.
      4. الغراء قطعة صغيرة (مقبض) من PDMS شفي من 1 مم × 1 مم × 3 مم في حجم عند حافة ساترة مع قطرة صغيرة من PDMS السائلة وعلاج PDMS كما كان من قبل. وهذا سوف يسهل التلاعب العينة بعد ذلك (انظر الشكل 1). هذه الخطوة اختيارية.
      5. تخزين مؤقت لل coverslips المغلفة PDMS-على مسح نظيفة داخل طبق بيتري للحماية من ترسب الغبار.
      6. وضعت قطرة من كاشف silanizing على رأس كل طابع والسماح لها تتبخر لمدة 1-2 دقيقة. ثم، وتجفيفها تحت تيار من N _2.
         ملاحظة: في هذه الخطوة، تشويه مؤقت من الطابع ويمكن ملاحظة خلال التبخر. وختم استعادة شكلها الأصلي بعد التجفيف مع N ₂ دون أي تشوه دائم من المجهرية.
      7. إسقاط بلطف شديد الطابع silanized على رأسPDMS تدور المغلفة ساترة الزجاج المخزنة في طبق بيتري. تأكد من أن كلا الجانبين موازية تماما أثناء الاتصال. تجنب الضغط أو تحريك ختم بعد وضعها على ساترة PDMS المغلفة.
      8. وضع طبق بتري مع العينات في فراغ لمدة 1-2 ساعة لإزالة فقاعات الهواء.
         ملاحظة: تأكد من أن عينات أفقية تماما لتجنب النزوح الطوابع. تجنب أيضا الاهتزاز المحتمل الناجم عن مضخة فراغ.
      9. وضع العينات في الفرن عند 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
      10. بلطف، تقشر طابع للكشف عن "eggcups". شطف جيدا مع الإيثانول والجافة.
          وهناك حاجة الممارسة في هذه المرحلة: ملاحظة. إيلاء الاهتمام لتفادي الكسر ساترة و / أو انفصال طبقة PDMS رقيقة.

2. تقديم خلايا في "Eggcups"

من أجل إدخال خلايا الثدييات داخل "eggcups، PDMS شمال شرق السطحمحرران أن functionalized مع بروتينات التصاق المصفوفة خارج الخلية. يستخدم هذا المثال فبرونيكتين ولكن غيرها من البروتينات المثيرة للاهتمام، مثل الكولاجين، ويمكن استخدامها.

1. Hydrophilize و"eggcups" في نظافة البلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية.
   ملاحظة: تحسين المعلمات إذا لزم الأمر.
2. يعد حل في برنامج تلفزيوني 1X من 20 ميكروغرام مل ^-1 الفيبرونكتين من مصادر الأبقار.
3. تعقيم "eggcups" مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 5 دقائق. إيداع قطرة صغيرة (حوالي 20-50 ميكرولتر) من محلول فبرونيكتين لتغطية كامل منطقة 'eggcups "واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. حماية عينة من الجفاف.
4. شطف بلطف "eggcups" مع برنامج تلفزيوني 1X. كرر 3 مرات.
   ملاحظة: عينة جاهزة للاستخدام فورا أو تخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام لعدة أسابيع.
5. إدخال حسب الطلب قطعة من البلاستيك اسطوانية من 63 ملم في الطول، 26 مم نصف قطرها الخارجي و 7 ملم من أبعاد دائرة نصف قطرها الداخلية في أنبوب 50 مل (انظرالشكل 2) ²⁰
   تنبيه: استخدام المواد الأشعة فوق البنفسجية تعقيم أو تعقيم لهم استخدام مسبق.
   ملاحظة: هذه القطعة يمكن أن تكون ملفقة بسهولة في المختبر. أو أي آلة متجر المتاحة.
6. وضع 13 مل من مستنبت خلوي من داخل أنبوب (انظر الجدول 1). المتوسط ​​يجب ملء لا يقل عن 2 سم فوق قطعة اسطوانية لضمان الغمر الكامل للعينة.
   ملاحظة: للحصول على تفاصيل من أنواع معينة من الخلايا، ونظم نموذج أخرى مثل الخميرة أو C. ايليجانس الأجنة، والمتوسطة المقابلة المستخدمة، تشير إلى الباب 5 الجدول 1. تم تحسين البروتوكول وصفها لهيلا، وخلايا NIH3T3، وخطوط الخلايا الأخرى (انظر الجدول 1).
7. إدخال بلطف جدا "eggcups 'داخل الأنبوب وبالتوازي مع الجانب العلوي من قطعة من البلاستيك. استخدام ملاقط حادة لعقد العينة باستخدام مقبض PDMS. اضغط بلطف ساترة حتى تقع على رأس الجانب العلوي من قطعة من البلاستيك، الامم المتحدةسمسم مغمورة بالكامل (انظر الشكل 2).
   ملاحظة: من المستحسن استخدام الملقط حادة ومستقيمة. مع ملاقط منحنية، والتلاعب في عينة من الصعب وربما تسبب الكسر.
8. خلايا ثقافة حتى 80-100٪ التقاء في P60 طبق بتري وجمع لهم من قبل trypsinization.
   ملاحظة: خلايا يمكن أن يكون من النوع البري، transfected أو تعامل مع أي دواء من الفائدة.
   ملاحظة: تجنب تشكيل المجاميع الخلية التي ستساعد على تجنب الخلايا وحيدة لدخول "eggcups". لتحسين هذه الخطوة، ماصة صعودا وهبوطا جيدا بعد trypsinization.
9. إعادة تعليق الخلايا في مستنبت 5 مل. ماصة 200 ميكرولتر من الخلايا على رأس 'eggcups ".
   ملاحظة: إسقاط الخلايا كما تركزت ممكن على رأس 'eggcups' ولكن تجنب الاتصال الجسدي. هذا سوف يمنع الكسر و / أو ضرر من العينة.
10. أجهزة الطرد المركزي في 1800 x ج لمدة 2 دقيقة.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي الأول، وتحقق في هيئة التصنيع العسكريroscope نسبة ملء "eggcups".
11. ماصة مرة أخرى 200 ميكرولتر من الخلايا على رأس 'eggcups "وأجهزة الطرد المركزي في 1800 x ج لمدة 2 دقيقة. تكرار لما مجموعه ثلاث مرات من أجل تحسين نسبة الملء.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي الماضي، تحقق مع المجهر نسبة ملء "eggcups". إذا لزم الأمر، كرر ملء + الطرد المركزي خطوات حتى وصلت نسبة ملء المرجوة.
12. إزالة عينة من الأنبوب باستخدام الملقط حادة عقد مقبض PDMS. تأكد من أن نكون حذرين في عدم الخلايا المثيرة للقلق "التي تقام في 'eggcups" (انظر الشكل 2).
13. وضع العينة في طبق بيتري مع متوسطة. شطف لإزالة الفائض من الخلايا التي ليست في 'eggcups من قبل pipetting صعودا وهبوطا ثلاث مرات بلطف بجانب كل جانب (مجموع 4 الجانبين) من مجموعة المجهرية.
    ملاحظة: pipetting لبشدة أيضا قد تفرجبعض الخلايا خارج من 'eggcups ".
14. استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة لإزالة الخلايا nonattached.
    ملاحظة: في هذه الخطوة يمكن إضافة المخدرات من اهتمام.
15. إصلاح الخلايا أو إعدادهم للوقت الفاصل بين imaging.See خطوة 4.1.

3. مراقبة من ديناميات الخلوية النشطة في "Eggcups ': Cytokinetic حلقة إغلاق

ملاحظة: يستخدم هذا المثال خلايا هيلا التي و transfected مع MYH10-GFP وLifeact-mcherry للميوسين والأكتين، على التوالي، والجزيئات النشطة الرئيسية المشاركة في إغلاق حلقة cytokinetic خلال الانقسام الخلوي. يتم إعداد الجهاز مع microcavities من 25 ميكرون في القطر. للمراقبة، وكان يستخدم مجهر مقلوب epifluorescence، مجهزة الهدف النفط 60X (1.40 NA، مدينة دبي للإنترنت، خطة آبو) وGFP (الميوسين) وTxRed (الأكتين) مرشحات. بدلا من ذلك تم استخدام المجهر مبائر تستقيم، مجهزة 25X أو 63X HCX الأشعة تحت الحمراء APO الهدف لتر ماء (0.95 NA). لهذا إكساءmple، فإنه ينصح بشدة لمزامنة الخلايا باستخدام كتلة الثيميدين مزدوج، كتلة الإنقسامية أو الإنقسامية للاهتزاز من طريقة ^21-24.
ملاحظة: سمك PDMS تستخدم ل 'eggcups "تتيح استخدام مجموعة متنوعة من الأهداف في كل من المجاهر المقلوب وضعه في وضع مستقيم.

1. المكان "eggcups" إلى حامل المجهر وملء مع 1 مل من 10٪ FCS L-15 متوسطة المراقبة. لتجنب التبخر، ووضع غطاء زجاجي على أعلى من حامل أو تطبيق طبقة رقيقة من الزيت المعدني على الجزء العلوي من medium.Select الهدف النفط 60X.
   ملاحظة: L-15 متوسطة كافية لعدم _CO-2 الاجواء. لاحظ أيضا أن بعض المركبات من DMEM هي السيارات الفلورسنت. عند استخدام هذه الوسيلة، فمن المستحسن أن photobleach المركبات الفلورية التي كتبها إلقاء الضوء عليه مع مصباح كثافة عالية لمدة 1-2 ساعة.
   ملاحظة: تجنب استخدام الأغطية البلاستيكية عند العمل مع التصوير مدينة دبي للإنترنت.
2. وضع حامل مع "eggcups" وobserمتوسطة vation في المجهر. التركيز بعناية باستخدام ضوء brightfield حتى "eggcups"، والخلايا في نفس الطائرة من المراقبة.
3. فتح البرنامج وضبط المعلمات. اختيار المرشحات TxRed وGFP لالأكتين والميوسين. ضبط الوقت المعرض لكل قناة. معدل الاستحواذ النموذجي هو 5 ثانية لكل القنوات.
   ملاحظة: قد يكون الوقت المعرض إلى تعديل اعتمادا على الإعداد المستخدم، صبغ أو غيرها من العضيات الخلوية في المصالح.
4. تحديد المنطقة ذات الاهتمام والسعي لخاتم cytokinetic باستخدام إما GFP أو قناة TxRed. التركيز بدقة.
   ملاحظة: الحلبة هي أكثر وضوحا في الميوسين وأسهل للاعتراف.
5. تشغيل الاستحواذ التلقائي في كل القنوات حتى يتم إغلاق عصابة تماما.
   ملاحظة: يمكن ملاحظة بعض photobleaching من. ضبط المعلمات المجهر من أجل الحد من ذلك.

4. مراقبة من العضيات الخلوية الثابتة في "Eggcups"

هذه الخطوة لا يمكن أن يؤديها قبل أو بعد الخطوة رقم 3. الخلايا يمكن أن تكون ثابتة مباشرة بعد الخطوة الطرد المركزي وملطخة للعضية من الفائدة أو بعد المراقبة في المجهر. يوضح هذا المثال تلطيخ من جهاز جولجي، نواة والأكتين الألياف على الخلايا الليفية NIH3T3 في "eggcups".

1. تثبيت خلايا في 'Eggcups "
   1. إعداد 3٪ امتصاص العرق (PFA) ودافئة عند 37 درجة مئوية. إزالة عينة "eggcups 'من أنبوب 50 مل (أو حامل المجهر) ووضعه داخل P35 طبق بيتري. شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X.
      هي بروتوكولات لإعداد 3٪ امتصاص العرق المتاحة على نطاق واسع في مكان آخر: ملاحظة.
      تنبيه: استخدام قفازات النتريل وحماية العين أثناء إعداد منهاج العمل.
   2. إزالة برنامج تلفزيوني وإسقاط 1 مل من 3٪ PFA واحتضان لمدة 17 دقيقة. إزالة PFA وشطف مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X. خلايا Permeabilize باستخدام 1 مل من 0.5٪ يسحقلمدة 3 دقائق ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق.
2. تلطيخ الخلايا في 'Eggcups "
   1. احتضان خلايا لجولجي جهاز تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية الأرنب بولكلونل مكافحة Giantin في التخفيف 1: 500 في برنامج تلفزيوني. وضع قطرة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة على ورقة فيلم من البلاستيك واحتضان الخلايا داخل "eggcups" رأسا على عقب لمدة 45 دقيقة.
      ملاحظة: حماية عينة مع غطاء لمنع جفاف.
   2. الافراج بعناية "Eggcups" ووضعها في طبق بتري P35. شطف 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما، مع برنامج تلفزيوني 1X.
   3. إعداد الكوكتيل في برنامج تلفزيوني مع الثانوي الأجسام المضادة و Cy3 الماعز المضادة للأرنب (1: 1000) ومع Phalloidin اليكسا فلور 488 (1: 200) لتلطيخ ألياف الأكتين الإجهاد.
   4. احتضان الخلايا مع انخفاض 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة على ورقة فيلم من البلاستيك واحتضان خلايا داخل "eggcups" رأسا على عقب لمدة 45 دقيقة.
   5. الافراج بعناية "eggcشكا "ووضعها في طبق بتري P35. شطف 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما، مع برنامج تلفزيوني 1X.
   6. احتضان خلايا لتلطيخ نواة وضع قطرة 100 ميكرولتر من 1 ميكروغرام مل ^-1 دابي في برنامج تلفزيوني على ورقة فيلم من البلاستيك واحتضان خلايا داخل "eggcups" رأسا على عقب لمدة 45 دقيقة. هذه الخطوة لا يمكن أن يؤديها مع خطوة 4.2.3.
   7. الافراج بعناية "eggcups" ووضعها في طبق بتري P35. شطف 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما، مع برنامج تلفزيوني 1X.
   8. جبل الخلايا باستخدام الجلسرين 15 ميكرولتر: برنامج تلفزيوني (1: 1 ت / ت) على شريحة ميكروسكوب القياسية وختم عينة مع طلاء الأظافر لتجنب الجفاف.
      ملاحظة: اعتمادا على سمك "eggcups، قد يكون من الصعب في تصاعد مستمر. فمن المستحسن لتخزين ثم العينة في طبق بيتري P35 في برنامج تلفزيوني، وحمايتها من الجفاف.
3. مراقبة المجهر
   ملاحظة: للحصول على هذا المثال تم استخدام المجهر مبائر تستقيم، ومجهزة PMT والهجين كاشفات. و25X أو 63 وقد تم اختيار X HCX الأشعة تحت الحمراء APO الهدف لتر ماء (0.95 NA) لتوفير مجال واسع من العينة وتبين انطباق الجهاز لتطبيقات فحص عالية المحتوى.
   1. حدد الهدف 25X أو 63X المياه.
      ملاحظة: أهداف مختلفة يمكن استخدامها تبعا للتطبيق وإشارة. ولكن من المستحسن استخدام أهداف الفتحة العددية العالية.
   2. ضع عينة ثابتة مع 'eggcups "والتركيز بعناية باستخدام ضوء brightfield (المرحلة التباين أو DIC) حتى" eggcups "والخلايا هي في الطائرة من المراقبة.
   3. فتح البرنامج وضبط المعلمات. اختيار المرشحات GFP، و Cy3 دابي لالأكتين، جولجي والمراقبة النواة، على التوالي؛ ضبط الوقت معرض لجميع القنوات.
      ملاحظة: قد يكون الوقت المعرض إلى تعديل اعتمادا على الإعداد.
   4. تحديد وتركيز المنطقة من اهتمام. بدء التقاط الصور (انظر الشكل 3).

TLE "> 5. التكيف للمراقبة من خلايا الخميرة وجيم ايليجانس الأجنة

1. الانشطار والناشيء خلايا الخميرة
   ملاحظة: يستخدم هذا المثال خلايا الخميرة الانشطار التي يتم تمييزها مع RLC1-mcherry وأمراض الشرايين التاجية-GFP للميوسين والأكتين، على التوالي. خلايا الخميرة في مهدها لا وصفت هنا fluorescently. للمراقبة الانشطار الخميرة تم استخدام مقلوب الغزل القرص مبائر المجهر. واستخدمت هدف النفط 100X HCX PL APO CS (1.4 NA) لجميع عمليات الاستحواذ. بدلا من ذلك، لوحظت خلايا أيضا باستخدام المجهر المرحلة على النقيض من المقلوب مجهزة 20X المرحلة الهدف الهواء المقابل LCPlanFl (0.4 NA). في هذا المثال، بروتوكول مطابق لكل أنواع الخلايا.
   1. تحضير السطح "eggcups" كما هو موضح أعلاه. للانشطار والناشئين خلايا الخميرة، وإعداد تجاويف من 5 ميكرون في القطر (انظر الجدول 1). في هذه الحالة، لا يحتاج إلى أن functionalized مع بروتينات التصاق السطح.
      ملاحظة: ملء كاليفورنيان يكون الأمثل باستخدام "eggcups" المخروطية. هذا الشكل يلتقط ويحتفظ خلايا تجنب الإفراج خلال الخطوة الشطف بعد الطرد المركزي. ملء مئوية هو الأمثل في حوالي 80٪. يمكن أن تكون ملفقة هذه 'eggcups "المخروطية عن طريق ديب رد الفعل ايون النقش ^13.
   2. خلايا الخميرة في وسائل الإعلام ثقافة الصحيح (انظر الجدول 1) حتى الوصول إلى الكثافة الضوئية (OD) في حدود 0.2 و 0.8. يصوتن ثقافة خلايا الخميرة لإزالة الركام.
   3. إدراج خلايا الخميرة في "eggcups عن طريق الطرد المركزي. الطرد المركزي، يتم إضافة 4 مل من الخلايا المستزرعة في التطوير التنظيمي المناسب على الأنبوب مع "eggcups". بعد الطرد المركزي الأول، يهز بلطف أنبوب لاعادة تعليق الخلايا التي ليست في 'eggcups "، في حين لا نشعر بالانزعاج خلايا في' eggcups". دون فتح الأنبوب، الطرد المركزي مرة أخرى وكرر هذه الخطوة مرتين. وهذا يضمن ترسبمن الخلايا من ثقافة إلى microcavities فارغة وسوف تزيد من نسبة الملء.
      ملاحظة: عند العمل مع الخميرة، فمن المستحسن قبل تسخين الطرد المركزي إلى درجة حرارة خلال التجارب
      ملاحظة: بروتوكول يمكن أن يكون مؤقتا هنا واستمر حتى 12 ساعة في وقت لاحق. في هذه الحالة، وتخزين العينة في درجة حرارة وتغطية ذلك لمنع التبخر.
   4. وضع "eggcups" في حامل المجهر وملء حامل مع فلتر تعقيم المتوسطة للتصوير. الآن شطف الخلايا مع وسائل الإعلام نفسها حتى تتم إزالة خلايا الخميرة العائمة بكفاءة. الحرص على عدم إزعاج الخلايا في 'eggcups "أثناء عملية الشطف.
   5. حدد هدف النفط 100X والتركيز بعناية. فتح البرنامج وضبط المعلمات. لالخميرة الانشطار، حدد GFP الفلاتر وTxRed لالأكتين والميوسين وضبط الوقت المعرض لكل من القنوات. معدل الاستحواذ النموذجي هو 3 ثانية.
      ملاحظة: اعتمادا علىوfluorophore، نوع من العلامات وانشاء، وقت التعرض يختلف عن الأنظمة الأخرى.
2. C. ايليجانس الأجنة
   ملاحظة: يستخدم هذا المثال C. ايليجانس الأجنة 25-30 ميكرومتر واسعة و50-55 ميكرومتر طويلة. كانت أجنة مثقف كما هو مبين في ^25. بروتوكول البصرية بسيط لكيفية التعامل مع جيم ايليجانس يمكن العثور عليها في ^26. تم إجراء المراقبة باستخدام المجهر المرحلة على النقيض من المقلوب مجهزة الهدف الهواء 40X 0.55 NA.
   1. تحضير السطح "eggcups" كما هو موضح أعلاه و25 ميكرون في القطر (انظر الجدول 1). في هذه الحالة، لا يحتاج إلى أن functionalized مع بروتينات التصاق السطح.
   2. ثقافة C. الأجنة ايليجانس في وسائل الإعلام ثقافة الصحيح (انظر الجدول 1).
   3. إدراج الأجنة في "eggcups عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه (انظر القسم 2،6 حتي 2،12) باستخدام الماء عالى النقاء كما مستنبت.
      ملاحظة: تم الأجنة "يتصرف" بشكل طبيعي في الماء عالى النقاء لمدة التجربة. وبدلا من استخدام منطقة عازلة M9 الفسيولوجية للتجارب طويلة الأمد.
   4. شطف العينة كما هو موضح أعلاه (انظر القسم 2.14). وضع "eggcups" إلى حامل المجهر. حدد هدف الهواء 40X والتركيز بعناية. فتح البرنامج وضبط المعلمات. تحديد سعر شراء 3 ثانية.

النتائج

و"eggcups" (EC) هي منهجية عالية المحتوى الفرز الجديدة التي تسمح التصور من الخلايا المنحى والأجنة في بيئة 3D. بالإضافة إلى ذلك، بعض العمليات الخلوية، التي يصعب مراقبة في 2D الثقافات القياسية (شقة)، ويمكن ملاحظة هذا الأسلوب الجديد. ويوضح الشكل 1A ملخص للإجراءات ا?...

Discussion

وقد استخدم صب متماثلة من أجل افتعال "eggcups". عملية التصنيع لا يحتاج إلى غرفة نظيفة. فمن السهل والبسيط، على الرغم من بعض الممارسات قد تكون مطلوبة. على وجه الخصوص، والإفراج عن طابع PDMS هي الخطوة الأكثر أهمية من أجل إنتاج مساحة واسعة من جودة عالية "eggcups". لهذا السبب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ddH20 (ultrapure)	Millipore	-	Use always fresh water.
Parafilm (plastic film)	Bemis	PM-999	Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask	Selba	-	http://www.selba.ch
Silicon wafer	Siltronix	-	http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist	MicroChem	2000 series	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer	MicroChem	-	http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol	Sigma-Aldrich	19030	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent )	Sigma-Aldrich	SL2-25ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Chlorotrimethylsilane (TMCS)	Sigma-Aldrich	386529-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves	Kleenguard	57372	http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0	Knittel glass	KN00010022593	http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers	SPI	0WSSS-XD	http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube	BD Falcon	352070	http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 kit	http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides	Dutscher	100001	http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium	Fisher Scientific	41965-039	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum	Sigma-Aldrich	C8056-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25200-072	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x	Fisher Scientific	14200-067	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium	Fisher Scientific	21083-027	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin	Fisher Scientific	15140-122	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35	Greiner	627102	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60	Greiner	628163	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94	Greiner	633179	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 %	Sigma-Aldrich	P6148-500G	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 %	Sigma-Aldrich	93443-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488	InVitrogen	A12379	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647	InVitrogen	A21245	1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin	Abcam	ab24586	1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html
rabbit anti-anillin	Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008).		1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine	Transduction Lab	610000	http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	111-166-047	http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR
1 mg/ml for 1 min
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells	-	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells	ATCC	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast	-	-	For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms	-	-	For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-732	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-522	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media)	MP Biomedicals	4110-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging	MP Biomedicals	4110-012	For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM)	MP Biomedicals	4104-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
(Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters	Millipore	-	http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2