JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقل محور عصبي من عامل التغذية العصبية الدماغي، وهو عامل التغذية العصبية، هو أمر حاسم لبقاء وظيفة العديد من السكان العصبية. وتتميز بعض الاضطرابات التنكسية من اختلال هيكل محور عصبي وظيفة. أثبتنا التقنيات المستخدمة لدراسة الاتجار المباشر لQD-عامل التغذية العصبية في غرف ميكروفلويديك باستخدام الخلايا العصبية الأولية.

Abstract

عامل التغذية العصبية تلعب دورا هاما في العديد من جوانب بقاء الخلايا العصبية، والتمايز، والوظيفة. وينظر بشكل متزايد العجز الهيكلية والوظيفية في محاور كميزة المبكرة من أمراض الاعصاب، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) ومرض هنتنغتون (HD). حتى الآن غير واضح هو آلية (ق) التي يتم الناجم عن إصابة محور عصبي. أبلغنا تطوير تقنية جديدة لإنتاج نشطة بيولوجيا، monobiotinylated عامل التغذية العصبية الدماغي (mBtBDNF) التي يمكن استخدامها لتتبع نقل محور عصبي من عامل التغذية العصبية. تم إنتاج عامل التغذية العصبية الكم نقطة المسمى (QD-عامل التغذية العصبية) عن طريق التصريف النقطة الكمومية 655 إلى mBtBDNF. تم استخدام جهاز ميكروفلويديك لعزل المحاور من أجسام الخلايا العصبية. إضافة QD-عامل التغذية العصبية إلى المقصورة محور عصبي سمحت التصوير الحي للنقل عامل التغذية العصبية في محاور عصبية. أثبتنا أن QD-عامل التغذية العصبية انتقلت أساسا retrogradely حصرا، مع عدد قليل جدا من توقف، في سرعة التحرك نحو 1.06 ميكرون / ثانية. هذا النظام يمكن أن تستخدم لتحقيق ليchanisms من تعطل وظيفة محور عصبي في AD أو HD، فضلا عن الاضطرابات التنكسية الأخرى.

Introduction

الخلايا العصبية مستقطبة للغاية الخلايا التي عمليات طويلة وغالبا ما وضعت للغاية تعتبر أساسية لإنشاء والحفاظ على بنية ووظيفة الدوائر العصبية. محور عصبي يلعب دورا حيويا في تحمل البضائع من وإلى نقاط الاشتباك العصبي. البروتينات والعضيات توليفها في سوما الخلية تحتاج ليتم نقلها من خلال محاور للوصول إلى المحطة قبل المشبكي لدعم وظيفة الخلايا العصبية. في المقابل، تلقت إشارات تحتاج في محاور البعيدة ليتم transduced ونقلت إلى سوما. هذه العمليات ضرورية لبقاء الخلايا العصبية، والتمايز، والصيانة. يجب أن تجرى في أن النقل محور عصبي في بعض الخلايا العصبية من خلال مسافات أكثر من 1،000 مرة من قطر جسم الخلية، وتصور إمكانية بسهولة أنه حتى العجز صغيرة يمكن أن تؤثر بشكل ملحوظ وظيفة الخلايا العصبية والدائرة.

الدماغ المستمدة عامل التغذية العصبية (عامل التغذية العصبية)، وهو عضو من عائلة neurotrophin من عوامل النمو، موجود في أماهمناطق الدماغ نيويورك، بما في ذلك الحصين والقشرة المخية، والدماغ الأمامي القاعدية. عامل التغذية العصبية تلعب دورا حاسما في تشكيل الإدراك والذاكرة من خلال دعم بقاء، والتمايز، ووظيفة الخلايا العصبية التي تشارك في الدوائر المعرفية. عامل التغذية العصبية يربط مستقبله، والتيروزين كيناز TrkB، في محطة محوار حيث ينشط مسارات الإشارات بوساطة TrkB بما في ذلك mitogen تنشيط بروتين كيناز / خارج الخلية التنظيم إشارة بروتين كيناز (MAPK / إرك)، فوسفتيدلينوستول-3-كيناز (PI3K) وفسفوليباز C-جاما (PLCγ). يتم تعبئتها البروتينات التي تشارك في هذه الممرات مما يشير إلى هياكل حويصلي التقامي لتشكيل عامل التغذية العصبية / TrkB يشير دخلول؛ جسيم داخلي 1-6 التي يتم نقلها بعد ذلك إلى retrogradely سوما العصبية.

غرفة ثقافة ميكروفلويديك هي عبارة عن منصة مفيدة جدا لدراسة البيولوجيا محور عصبي في ظل ظروف طبيعية، وكذلك في تحديد الإصابة والمرض 7،8. بواسطة محاور عزلمن أجسام الخلايا، سمح جهاز واحد لدراسة النقل وتحديدا في محاور 8-10. منصات ميكروفلويديك PDMS مقرها مع 450 ميكرون الحواجز مرسمة مجهارية المستخدمة في هذه الدراسة تم شراؤها تجاريا (انظر الجدول المواد). لدراسة نقل عامل التغذية العصبية الدماغي، قمنا بتطوير تكنولوجيا جديدة لإنتاج عامل التغذية العصبية monobiotinylated (mBtBDNF). ونحن قد استفادت من الببتيد البيوتين متقبل، AP (المعروف أيضا باسم AviTag). وهو تسلسل الأحماض الأمينية 15 الذي يحتوي على بقايا يسين التي يمكن و ligated تحديدا إلى البيوتين من قبل كولاي يغاز انزيم البيوتين، البيرة. نحن تنصهر في AviTag إلى C-محطة من الفأرة قبل proBDNF [كدنا] بواسطة PCR (الشكل 1A). تم استنساخ بناء إلى متجه التعبير الثدييات، pcDNA3.1 MYC-له النواقل. نحن أيضا استنساخ الحمض النووي البكتيري البيرة في pcDNA3.1 MYC-له النواقل. البلازميدات كانا عابر شارك transfected-إلى خلايا HEK293FT للتعبير عن كل من البروتينات. البيرة المحفز للربط من بيوفي خصيصا ليسين يقيمون داخل AviTag في C-محطة من عامل التغذية العصبية في نسبة 1: 1 لإنتاج عامل التغذية العصبية monobiotinylated مونومر. البيروكسيديز، تنضج عامل التغذية العصبية مع الكتلة الجزيئية ل~ 18 كيلو دالتون تم استردادها وتنقيته من وسائل الإعلام باستخدام ني الراتنج (الشكل 1C). كان biotinylation من عامل التغذية العصبية كاملة، كما دلل على ذلك عدم القدرة على كشف معدلة عامل التغذية العصبية التي immunoblotting (الشكل 1D). Streptavidin مترافق نقاط الكم، QD 655، واستخدمت لتسمية mBtBDNF لجعل QD-عامل التغذية العصبية. لم بحضور AviTag لا تتداخل مع نشاط عامل التغذية العصبية كما كان mBtBDNF قادرة على تفعيل TrkB فسفرته (الشكل 1E) وتحفيز ثمرة neurite (الشكل 1F) إلى الحد من عامل التغذية العصبية الدماغي البشري المؤتلف (rhBDNF). المناعية أظهرت أن عامل التغذية العصبية QD-colocalized مع TrkB محاور في قرن آمون، مشيرا إلى أن QD-عامل التغذية العصبية غير النشطة بيولوجيا (الشكل 1G). لدراسة نقل عامل التغذية العصبية، وأضيف إلى عامل التغذية العصبية QD-البعيدة مقصورة محوارالثقافات ميكروفلويديك تحتوي على الفئران E18 الخلايا العصبية قرن آمون (الشكل 2A). تم القبض QD-عامل التغذية العصبية النقل إلى الوراء في الوقت الحقيقي من محاور التصوير الحي من العلامة الحمراء الفلورسنت (دعم الفيديو S1، S2). من خلال تحليل مخطاط التموج ولدت، لوحظ QD-عامل التغذية العصبية ليتم نقلها retrogradely في سرعة التحرك نحو 1.06 ميكرون / ثانية (الشكل 3A). وقد استخدمت أو GFP mCherry الموسومة عامل التغذية العصبية لتتبع حركة محور عصبي من عامل التغذية العصبية. العوائق الرئيسية هي أنها ليست مشرقة بما فيه الكفاية للدراسات جزيء واحد. أيضا، فإن وجود كل من تقدمي والحركات عامل التغذية العصبية الوراء يجعل من الصعب تقييم ما إذا كان أو لم نقل retrogradely عامل التغذية العصبية في مجمع neurotrophin / مستقبلات.

في هذا الفيديو، ونحن لشرح التقنيات المستخدمة لدراسة الاتجار المباشر لQD-عامل التغذية العصبية في غرف ميكروفلويديك باستخدام الخلايا العصبية الأولية. وultrabrightness وصمود ممتازة من نقاط الكم ماكوفاق من الممكن تتبع أداء طويل الأجل لنقل عامل التغذية العصبية. هذه التقنيات يمكن استغلالها لتعزيز الدراسات وظيفة محور عصبي في AD، HD، والاضطرابات العصبية الأخرى.

Protocol

وتجرى العمليات الجراحية والحيوانية من بدقة وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تمت الموافقة على جميع التجارب التي تنطوي على استخدام الحيوانات جامعة كاليفورنيا سان دييغو المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. البلازميد الاستنساخ والتعبير وتنقية مونو المعقدة البيروكسيديز-عامل التغذية العصبية الدماغي (mBtBDNF)

ملاحظة: بناء قبل proBDNFavi والبيرة [كدنا] في ناقلات pcDNA3.1 وcoexpress في الخلايا HEK293FT 10. تنقية mBtBDNF باستخدام الخرز ني NTA فقا للطريقة التي تم نشرها مسبقا على إنتاج عامل نمو الأعصاب monobiotinylated ناضجة ونشطة بيولوجيا (mBtNGF) 10.

2. إعداد ميكروفلويديك الغرف

يجعل جهاز ميكروفلويديك عصبون زراعة من الممكن عزل fluidically محاور عصبية من أجسام الخلايا العصبية. تجميع غرف مع coverslips المغلفة الطازجة الحق قبل كل تشريح. غرف ميكروفلويديك تستخدمفي هذا البروتوكول يتم شراؤها تجاريا (انظر الجدول المواد والمعدات و). غسيل يدوي وإعادة استخدامها غرف شراؤها تجاريا يصل إلى 5-6x.

  1. غسل اليد في غرف ميكروفلويديك 1٪ Alconox. شطف ثلاث مرات بالماء ملي-Q لمدة 30 دقيقة لكل منهما. غرف غسل اليد مرة أخرى في 70٪ من الإيثانول.
  2. وضع خارج غرف لتجف على Parafilm في غطاء تدفق الصفحي. تشع وتعقيم جانبي غرف لمدة 20 دقيقة تحت أشعة فوق البنفسجية. متجر غرف تعقيم عقيمة في 15 سم طبق مختومة مع parafilm في درجة حرارة الغرفة.
  3. وضع 24 × 40 مم رقم 1 coverslips الزجاج في وعاء زجاجي. نقع لل coverslips في 35٪ حمض هيدروكلوريد بين عشية وضحاها على محور دوار. في اليوم التالي، وشطف لل coverslips ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل منهما مع الماء.
  4. تعقيم لل coverslips واحدا تلو الآخر عن طريق غمس كل ساترة في الإيثانول بنسبة 100٪ وملتهبة أكثر من الموقد بنسن. تخزين coverslips الجافة في طبق بتري معقمة والحفاظ عليه في درجة حرارة الغرفة حتى الطلاء.
  5. وضع أوور لل coverslips في صحن الثقافة 15 سم. معطف كل ساترة مع 0.7 مل من 0.01٪ بولي-L-يسين (PLL) واحتضان في غطاء محرك السيارة في درجة حرارة الغرفة.
  6. بعد 1 ساعة، وشطف لل coverslips ثلاث مرات مع الماء المعقم. coverslips الجافة مع فراغ ومكان كل ساترة في طبق ثقافة 6 سم.
  7. لتجميع غرفة ميكروفلويديك، ضع الغرفة مع الجانب مرسمة مجهارية في أسفل على ساترة المغلفة PLL بحذر على عدم لمس microgrooves. ضغطت بلطف إلى أسفل الغرفة مع طرف ماصة لضمان ومختومة الغرفة بإحكام.

3. تشريح العصبية الثقافة وعلى لوحة الدوائر

  1. وضع اثنين E17-E18 الحصين الفئران (الدماغ واحد) في تشريح 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على 2 مل عازلة تشريح (HBSS، لا الكالسيوم والمغنيسيوم لا، مع 1٪ القلم / بكتيريا و 10 ملي HEPES. شطف الأنسجة 3X مع 5 مل تشريح العازلة في كل مرة. إزالة المنطقة العازلة تشريح قدر الإمكان وإضافة 900 ميكرولتر من دي الطازجةssection العازلة.
  2. لهضم الأنسجة، وإضافة 100 ميكرولتر من 10X التربسين (2.5٪) في المخزن المؤقت تشريح لجعل تركيز العمل 1X. وضع أنبوب مخروطي في 37 ° C حمام الماء. بعد 10 دقيقة من الهضم، وإضافة 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل الدناز الأول إلى تركيز النهائي حوالي 1 ملغ / مل.
  3. باستخدام الزجاج باستور ماصة مصقول النار، يسحن بلطف الأنسجة التي pipetting صعودا وهبوطا 5-10x. مباشرة بعد سحن، إخماد التربسين 2 مل مع الطلاء المتوسطة (Neurobasal مع 10٪ FBS، 2 مم GlutaMax، 2٪ B27).
  4. ترك العينة في غطاء محرك السيارة لمدة 5 دقائق للسماح أي حطام من الأنسجة ليستقر في القاع. إزالة بعناية 2 مل من طاف في العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي نظيف والطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه. Resuspend وبيليه في 50 ميكرولتر سائل الاعلام الطلاء
  5. عد الخلايا مع عدادة الكريات. الحمل 15-20 ميكرولتر تعليق الخلية (~ 40،000 خلايا) في حجرة واحدة من غرفة ميكروفلويديك. وضع الغرفةفي الحاضنة لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا لنعلق على ساترة. بعد 10 دقيقة، إضافة وسائط أكثر الطلاء لملء كل من المقصورات من الغرفة.
  6. في اليوم الثاني من التشريح، وتحل تماما محل وسائل الإعلام الطلاء مع وسائل الاعلام الصيانة (Neurobasal مع 2 مم GlutaMax، 2٪ B27) في كل خلايا الجسم والمقصورة محور عصبي. محاور عصبية من الخلايا العصبية قرن آمون تبدأ لعبور microgrooves في يوم 3 والوصول إلى مقصورة محوار بين يوم 5-7. خلال هذه الفترة من الزمن، استبدال نصف وسائل الإعلام مع وسائل الاعلام زراعة صيانة جديدة كل 24 ~ 48 ساعة.

4. محور عصبي نقل QD-عامل التغذية العصبية

  1. قبل أن يعيش التصوير من QD-عامل التغذية العصبية النقل محور عصبي، تستنزف عامل التغذية العصبية من كل من جسم الخلية ومحور عصبي مقصورات للغرفة ميكروفلويديك بدقة من قبل شطف كل من مقصورات مع عامل التغذية العصبية حرة، حرة المصل وسائل الإعلام Neurobasal كل 30 دقيقة لمدة 2 ساعة.
  2. خلال استنزاف عامل التغذية العصبية، وإعداد تقارن QD-عامل التغذية العصبية. مزيج 50 نانومتر من أحادية المعقدة البيروكسيديز BDNF ديمر مع 50 نانومتر تقارن QD655-streptavidin في وسائل الإعلام neurobasal واحتضان على الجليد لمدة 60 دقيقة.
  3. إزالة وسائل الإعلام في المقصورة محور عصبي وإضافة 300 ميكرولتر QD-عامل التغذية العصبية مع تركيز النهائي من 0.25 نانومتر لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية. لتقليل نشرها من QD-عامل التغذية العصبية في حجرة خلايا الجسم، من المهم جدا أن تحافظ دائما على مستوى أعلى من وسائل الإعلام في المقصورة خلايا الجسم مما كانت عليه في المقصورة محور عصبي. يغسل غير منضم QD-عامل التغذية العصبية بعد الحضانة قبل التصوير الحي.
  4. تنفيذ التصوير الحي النقل QD-عامل التغذية العصبية باستخدام مجهر مقلوب مجهزة النفط 100X عدسة الهدف. الاحماء نطاق والغرفة البيئية المرتبطة به لدرجة حرارة ثابتة (37 درجة مئوية) وCO 2 (5٪). استخدام مجموعة من تكساس مكعبات الأحمر الإثارة / الانبعاثات لتصور إشارة QD655.
  5. اكتساب والتقاط الصور الوقت الفاصل ضمن محاور الوسطى بسرعة 1 إطار / ثانية أي ما مجموعه 2 دقيقة باستخدام كاميرا CCD. استخدام microgrooves مع عدم وجود محاور ثار لها أي QD، وبالتالي عدم وجود إشارة كجهاز تحكم عن التسلل.
  6. تحليل النقل عامل التغذية العصبية باستخدام أي برنامج تحليل الصور أو المعاهد الوطنية للصحة يماغيج.

النتائج

إنتاج وتنقية النشطة بيولوجيا عامل التغذية العصبية أحادي المعقدة البيروكسيديز

تم إنشاء ناقلات التعبير من عامل التغذية العصبية تنصهر مع تسلسل AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) وفقا لبروتوكول نشرت سابقا 10. وكان من المتوقع الكتلة الجزيئية للبر...

Discussion

في هذه الدراسة، ونحن التقرير تطور تقنية جديدة لإنتاج نشطة بيولوجيا، monobiotinylated عامل التغذية العصبية الدماغي (mBtBDNF) التي يمكن استخدامها لتتبع نقل محور عصبي من عامل التغذية العصبية. بواسطة التصريف البروتين إلى نقطة الكم streptavidin، واستخدام غرفة ميكروفلويديك، الأسلوب يسمح...

Disclosures

أعلنت أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نشكر يو (بولين) هو جين تاو، راشيل Sinit للحصول على المساعدة الفنية. وتدعم الدراسة التي منحة المعاهد الوطنية للصحة (PN2 EY016525) وبتمويل من متلازمة داون مؤسسة البحوث والعلاج ومؤسسة لاري L. Hillblom.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Platinum pfx DNA polymerase Invitrogen11708021
EcoRI FermentasFD0274
BamHI FermentasFD0054
HEK293FT cellsInvitrogenR70007
DMEM-high glucose mediaMediatech10-013-CV
D-biotin SigmaB4639
TurboFect FermentasR0531
PMSF  SigmaP7626
AprotininSigmaA6279
Ni-NTA resinsQiagen30250
Protease inhibitors cocktailSigma S8820
Silver staining kit G-Biosciences786-30
Human recombinant BDNFGenentech
Microfluidic chambersXonaSND450
24 x 40 mm No. 1 glass coverslips VWR48393-060
Poly-L-Lysine Cultrex3438-100-01
HBSSGibco14185-052
DNase IRoche10104159001
TrypsinGibco15090-046
Neurobasal Gibco21103-049
FBS Invitrogen16000-044
GlutaMax Invitrogen35050-061
B27  Gibco17504-044
QD655-streptavidin conjugatesInvitrogen Q10121MP
anti-Avi tag antibodyGenScriptA00674
streptavidin-agarose beads Life Technology SA100-04
Trichloroacetic acidSigmaT6399
HRP-streptavidin Thermo ScientificN100
anti-pTrkB antibodya generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibodyBD Science610101

References

  1. Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
  2. Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
  3. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
  4. Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
  5. Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
  6. Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
  7. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
  8. Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
  9. Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
  10. Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
  11. Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
  12. Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
  13. Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
  14. Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
  15. Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
  16. Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
  17. Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
  18. Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

91

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved