Vibratome باجتزاء شبكية العين الفأر لإعداد الثقافات مبصرة

Summary

الشبكية العصبية على فأرة الحاسوب الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أيام هي على رأس 4٪ كتلة الجيلاتين. بعد عزل طبقة مبصرة (200 ميكرون) من خلال vibratome، هي المصنفة مبصرات بعد التفكك الميكانيكية والأنزيمية للثقافة. طبقة مستقبلة للضوء يمكن استخدامها لالجزيئية، التحاليل البيوكيميائية أو الزرع.

Abstract

شبكية العين هي جزء من الجهاز العصبي المركزي الذي نظم الهندسة المعمارية، مع الخلايا العصبية في طبقات من خلايا مستقبلة للضوء، سواء قضبان ومخاريط في اتصال مع ظهارة الصباغية الشبكية في الجزء الأكثر البعيد على الشبكية النظر في اتجاه الضوء، و خلايا العقدة في المسافة أكثر الداني. هذه العمارة تسمح للعزل طبقة مبصرة من قبل vibratome باجتزاء. الشبكية العصبية تشريح على فأرة الحاسوب الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أيام هي مسطحة جزءا لا يتجزأ من 4٪ الجيلاتين على رأس شريحة من 20٪ الجيلاتين طبقة مبصرة أسفل. باستخدام vibratome وشفرة حلاقة ذو حدين، هو مقطوع شبكية العين الداخلية سميكة 100 ميكرون. يحتوي هذا القسم على خلايا العقدة والطبقة الداخلية مع اسيما الخلايا القطبين. يتم تجاهل قسم سيط من 15 ميكرون قبل أن يتم استردادها 200 ميكرون من شبكية العين الخارجية التي تحتوي على المستقبلات الضوئية. تتم إزالة الجيلاتين عن طريق التسخين عند 37 درجة مئوية. قطعة من الطبقة الخارجية هي incubaتيد في 500 ميكرولتر من محلول رينغر مع 2 وحدات من غراء تفعيلها لمدة 20 دقيقة عند 37 ° C. توقف رد الفعل من خلال إضافة 500 ميكرولتر 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) في Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM)، يضاف بعد ذلك 25 وحدة من الدناز I قبل الطرد المركزي في RT، وغسلها عدة مرات لإزالة المصل ومعلق الخلايا في 500 ميكرولتر من DMEM والمصنف في 1 × 10 ⁵ خلية / سم ^2. وتزرع الخلايا إلى 5 أيام في المختبر، وسجل الجدوى الخاصة بهم باستخدام الحية / الفحص ميت. يتم تحديد نقاء الثقافة لأول مرة عن طريق الملاحظة المجهرية أثناء التجربة. ثم يتم التحقق من صحة الطهارة من البذر وتحديد الخلايا على شريحة نسيجية وتحليلها باستخدام بولكلونل الأرنب مكافحة SAG، علامة مبصرة والفأر وحيدة النسيلة المضادة للRHO، علامة محددة قضيب مبصرة. بدلا من ذلك، طبقة مبصرة (97٪ قضبان) يمكن استخدامها لتحليل الجينات أو البروتين التعبير وللزرع.

Introduction

شبكية العين هي جزء لا يتجزأ من النظام العصبي المركزي والتي لديها بنية الحفظ بين الفقاريات. ويتم تنظيم الخلايا العصبية للشبكية العصبية في طبقات، مع الأكثر بعدا عن الضوء الساقط، وطبقة مبصرة على اتصال وثيق مع ظهارة الصباغية الشبكية (RPE) في الجزء الخلفي من العين. قضيب ومخروط photorecptors هي خلايا حساسة الخفيفة التي تعتمد على جزيئات الحساسة أوبسين لالتقاط الفوتون. يتم تضمين هذه الجزيئات على الأغشية القرص هيكل الخلوي، وتقع على الجزء الخارجي من مستقبلة للضوء الذي يشير في اتجاه RPE ^1. ويتم تجديد هذا الهيكل، والتي غالبا ما تتأثر في حالات الإنحطاط مبصرة في وقت مبكر جدا، بمعدل 10٪ كل يوم. ما يسمى الطبقة الداخلية تحتوي معظم الخلايا العصبية الأخرى التي حساب إشارة وردت من المستقبلات الضوئية، والقطبين، عديم الاستطالات والخلايا الأفقية وكذلك خلايا العقدة. هذه الأخيرة مع محاور لهاتشكيل شعاع وهو العصب البصري. هذه الطبقات هي الحفظ بحيث علماء الأحياء ويستخدم هذا المصطلح النازحين خلايا عديم الاستطالات عندما يتم العثور على الخلايا خارج الطبقة الداخلية ضفيري ^2. ويتم توزيع طبقات من الخلايا العصبية داخل المحرك من الخلايا الدبقية شعاعي مولر. خلايا المستقبلات الضوئية بين القطبين تصل إلى خلايا العقدة. فهي تقع بين طبقة ضفيري الخارجية وطبقة ضفيري الداخلية. الخلايا العقدية تشكل طبقة ضفيري الداخلية في اتصال مع خلايا القطبين. تتم تسمية الخلايا كخلايا amacrin جمعية الموجود في الطبقة الداخلية ضفيري بين الخلايا القطبين والخلايا العقدية. طبقة ضفيري الخارجي يحتوي على خلايا الأفقية. هذا الترتيب الفريد من طبقات الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي يسمح عزل طبقة مبصرة من طبقة الخلايا الداخلية تشريح شبكية العين مسطحة شنت باستخدام vibratome من قبل.

في الأصل، تم استخدام هذه التقنية لعزل خلايا مستقبلة للضوء لترانsplantation في عين الماوس RD1، وهذا نموذج من التهاب الشبكية الصباغي البشري (RP) ^3. الماوس RD1 يحمل طفرة المتنحية في الجينات Pde6b الذي يشفر للقضيب محددة فسفودايستراز بيتا فرعية. الطفرات المتنحية من هذه النتيجة الجينات في RP في البشر ^(4). بعد أن تحولت مبصرات قضيب، والمريض يفقد الرؤية الليلية، ومبصرات مخروطية من المستغرب، والتي لا تعبر عن الجين المتحور، تتحول كخطوة ثانية. لأن يطلب من المخاريط للرؤية اللون والبصر، والمرضى بالعمى تدريجيا وعلاج فعال لهذا المرض لم تضع حتى الان. عن طريق تطعيم طبقة مستقبلة للضوء من النوع البري الماوس انحطاط مخروط من الفأرة المضيف تأخر ^3،5. قضبان خسر في نموذج التنكسية قضيب مخروط لا يمكن الاستعاضة عن زرع لأن الاتصال متشابك بين قضبان وخلايا القطبين لا يمكن الحصول عليها في مرحلة معينة من صتطوير etinal، والتي تمثلت في ظهور المختبر الوطني المرجعي التعبير ^6. هو عرض طبقة من خلايا مستقبلة للضوء عن طريق الجراحة في الفضاء شبه الشبكية الشبكية RD1 قضيب أقل، وبين RPE والشبكية الخارجية الموافق 3٪ فقط من المستقبلات الضوئية المتبقية، المخاريط. بعد أسبوعين من الجراحة، و 40٪ من المخاريط من الحيوان المزروعة مع طبقة مبصرة العادية نجا بالمقارنة مع الحيوان المزروعة مع طبقة طبيعية من الخلايا الداخلية الشبكية، أو للحيوان الشام التي تديرها. تضاريس بقاء مخروط،-موزعة على كامل سطح الشبكية تحور تقع في موقف الأنسجة المطعمة يشير إلى أن التأثير الوقائي يرجع إلى جزيء إنتشاري ^7.

وبعد ذلك، استخدمنا نظام المشاركة في الثقافة وكذلك وسائل الإعلام ثقافة مشروطة للتحقق من صحة حقيقة أن تأثير وقائي يعتمد على إفراز بروتين عن طريق قضبان ^8،9. ونحن نفترض أن هذا البروتين سوف EXPRإسيد بشكل مستمر وتحديدا من قبل قضبان وأن وفاتهم خلال المرحلة الأولى من المرض سوف يؤدي التنكس مخروط الثانوي بحلول فقدان إشارة وقائية من قضبان في غير الخلية بطريقة مستقلة ^10. ونظرا لأهمية مخروط بوساطة الرؤية المركزية في الرئيسيات هذا البروتين المفترض سيكون أداة علاجية ذات الصلة للغاية لRP. ان الحفاظ على المخاريط في RP منع نظريا ما مجموعه 1.5 مليون مريض في جميع أنحاء العالم ليصبح أعمى ^11. وقد استخدمنا منهج فحص محتوى عالية ونموذجا ثقافة التخصيب مخروط لتحديد [كدنا ترميز رود المستمدة من المخروط الجدوى عامل (RdCVF) من مكتبة [كدنا الشبكية ^12. RdCVF هو نتاج تقسم من الجينات التي NXNL1، هو المثير للاهتمام مثلي لترميز الجين للبروتينات thioredoxin المشاركة في الأكسدة التوازن ^(13). المنتج تقسم الثاني من هذا الجين، RdCVFL هو انزيم يحمي هدفها، البروتين جامعة تل ابيب ضد الأكسدة دamage ^14. إدارة RdCVF يمنع الضمور الثانوي من المخاريط وفقدان وظيفتها البصرية في المتنحية، والنموذج السائد للRP ^12،15. وهذا يدل على اثنين من الجوانب الهامة لهذه الاستراتيجية العلاجية المبتكرة ^16. أولا، يمكن تطبيقه في معظم الحالات RP بطريقة الجينات مستقل. ثانيا، يرتبط يتعارض مع عامل المنافسة بقاء CNTF، RdCVF مع الحفاظ على وظيفة البصرية ^17. غياب تأثير وظيفي قد يفسر سبب غياب فائدة سريرية من إدارة CNTF للمرضى RP ^18. هو على الأرجح واحدة من إشارة بقاء هامة بين قضبان ومخاريط لأن مستعمل الإنقاذ مخروط في المختبر عن طريق RdCVF immunodepletion ¹² RdCVF. وبالإضافة إلى ذلك، تعطل جدوى مخروط الجينات المستمدة قضيب يؤدي إلى خلل وظيفي مبصرة والقابلية للالاكسدة ^19.

استخدامطبقة مستقبلة للضوء هي في أصل تحديد RdCVF وإشارة الأكسدة جديدة تشارك في أمراض الاعصاب ^20. توضح هذه المخطوطة البروتوكول المستخدم لعزل والخلايا الثقافة من طبقة مبصرة لتوصيف نشاط RdCVF. يمكن الحفاظ على المستقبلات الضوئية في الثقافة لمدة 5 إلى 7 أيام ^21. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لدراسة التعبير عن جينات محددة مستقبلة للضوء.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على الإجراء من قبل لجنة الأخلاق داروين من جامعة بيير وماري كوري (CE5 / 2009/048)

1. إعداد الجيلاتين الحل، الآلات، Vibratome والثقافة وسائل الإعلام والثقافة لوحة

1. يعد حل الجيلاتين 20٪ قبل يوم واحد على الأقل التجربة.
   1. تحت غطاء محرك السيارة، إضافة 500 ميكرولتر من الجنتاميسين [10 ملغ / مل] إلى زجاجة 500 مل تحتوي على CO ₂ متوسطة المستقلة (CO ₂ -i).
   2. في كوب منفصل، إضافة 20 مل من CO2-I (من الخطوة 1.1.1) والحرارة على 95 درجة مئوية على كتلة التدفئة مع التحريك المستمر لمدة 15 دقيقة. ملاحظة تغيير اللون إلى الأصفر، مشيرا إلى أن الحل هو على استعداد لاستخدامها مرة أخرى.
   3. تزن 4 غرام من الجيلاتين والفقراء تدريجيا إلى حل أعدت فوق (الخطوة 1.1.2) مع زيادة التحريك والتدفئة على 95 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، للحصول على حل اللون الأصفر. السماح للحل الجيلاتين لتبريد تحتغطاء محرك السيارة لحوالي 5 دقائق.
   4. صب 4 مل من محلول الجيلاتين إلى 35 ملم الأطباق ثقافة قطر دون إدخال فقاعات الهواء. الحفاظ على طبق على 21 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تغطية الأطباق مع فيلم من البلاستيك، وتحويل أطباق رأسا على عقب. اختياريا، تخزين الأطباق في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر قبل الاستخدام.
2. يعد حل الجيلاتين 4٪.
   1. تحت غطاء محرك السيارة، إضافة 25 مل من CO ₂ متوسطة -i في حاوية بلاستيكية معقمة، والحرارة في 42 درجة مئوية على كتلة التدفئة. إزالة المتوسطة من كتلة التدفئة وإضافة تدريجيا 1 غرام من الجيلاتين إلى متوسطة الساخن ويقلب. العودة بسرعة الحاوية على كتلة التدفئة (42 ° C) وإبقائه دافئا أثناء العملية.
3. الضبط لجهاز vibratome:
   1. إزالة الأطباق التي تحتوي على محلول الجيلاتين 20٪ تخزينها في 4 ° C. قطع الجيلاتين مع مشرط. الوجه شريحة الجيلاتين والتمسك بها على القرص دعم أسود للvibratome باستخدام قطرة من الصورةالغراء UPER.
   2. كسر شفرة حلاقة إلى نصفين، وتضاف نصف واحد في vibratome عقد وعاء. أدخل القرص دعم السوداء على جهاز vibratome. بدوره على مقبض الباب الأسود إلى الجانب الأيمن. إصلاح الوعاء عقد على رأسه من vibratome. إضافة كمية كافية من CO ₂ متوسطة -i في خزان vibratome لتغطية كتلة الجيلاتين.
   3. التبديل على vibratome وقطع ثلاث 100 ميكرون شرائح من كتلة الجيلاتين. الحفاظ على كتلة الجيلاتين لاستخدامها مرة أخرى.
4. إعداد 40 مل من مستنبت:
   1. إعداد Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) مع 10٪ من مصل العجل الجنين (FCS) تحت غطاء محرك السيارة. إعداد 1 ملغ / مل بولي-D-ليسين باستخدام الفوسفات عازلة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4.
   2. في لوحة 96-جيدا، إضافة 2 ميكروغرام / سم ² من بولي-D-ليسين لمعطف أسفل الآبار. احتضان لوحة لمدة 45 دقيقة عند 37 ° C في حدود 5٪ CO ₂ الحاضنة. وبعد الحضانة، وإزالة PBS واستبدالها مع 200 ميكرولتر/ جيد DMEM والمكان مرة أخرى عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ حاضنة قبل استخدام.

2. تشريح الشبكية بكل

1. استأصل الماوس:
   1. التضحية الماوس وفقا لتوجيه الأوروبي 2010/63: خلع عنق الرحم. قطع الرأس مع مقص منحني وضعه في 100 مم طبق بتري بعد تطهيرها العين مع مطهر.
   2. إزالة العين بعد أن فصل العصب البصري من قبل باجتزاء ذلك بعناية فائقة باستخدام قبضة منحنية. ثم ضع كلتا العينين في طبق بيتري 35 ملم تحتوي على معقم CO ₂ متوسطة -i في 21 ° C.
2. إزالة شبكية العين:
   1. جعل ثقب على مستوى العين-أطرافهم بمساعدة إبرة 18 G لتكون قادرة على تقديم مقص في العالم العين. إدخال مقص مستقيمة داخل الحفرة وقطع بعناية الصلبة تحت القزحية على كل محيط الكرة الأرضية العين لإزالة الجسم الهدبي.
   2. إزالة القرنية والعدسة والحفاظ على غرفة الخلفي من العين مع متجاورة الشبكية لالصلبة. مع اثنين من السيطرة غرامة، وإزالة الجسم الزجاجي الموجود داخل الغرفة الخلفية دون الإضرار شبكية العين. أداء أربعة تخفيضات شعاعي (الشبكية / الصلبة) للسماح تسطيح للشبكية.
   3. تحسن العالم العين وقشر بأنها "البرتقالي". فصل الشبكية من الصلبة والظهارة الصباغية الشبكية (RPE). فصل شبكية العين لا تزال تعلق على مستوى العصب البصري بعناية فائقة مع غرامة مقص المنحنية.
   4. فصل الجسم الزجاجي المتبقية من المحيط باتجاه مركز شبكية العين مع اثنين من السيطرة غرامة. تأكد من أن جميع الزجاجي تتم إزالة تماما للسماح للتسطيح للشبكية.
   5. قطع أقصى من ماصة بلاستيكية ونقل الشبكية إلى 35 مم طبق بتري تحتوي CO ₂ متوسطة -i مع ماصة بلاستيكية.

3. ختم مسطح mounteد الشبكية على الجيلاتين بلوك

1. إزالة 20 - 30 مل من CO ₂ متوسطة -i من خزان vibratome (كتلة الجيلاتين هو حر) للسماح ختم شبكية العين مسطحة محمولة.
2. نقل شبكية العين على شريحة زجاجية باستخدام ماصة بلاستيكية وإضافة قطرة من CO ₂ متوسطة -i قبل ان ينتقل الى شريحة الجيلاتين مع مبصرة لأسفل على شريحة الجيلاتين.
3. إرفاق شبكية العين إلى كتلة الجيلاتين عن طريق حقن بلطف درجة حرارة 4٪ الجيلاتين على جانب واحد من كتلة بين شبكية العين وكتلة الجيلاتين في وقت واحد طرد الجيلاتين الحارة على الجانب الآخر.
4. نضح 4٪ الجيلاتين مع ماصة باستور. الانتظار لمدة 10 دقيقة للسماح الكلي الختم. إضافة CO ₂ متوسطة -i أن تزج كتلة والنصل تماما.

4. باجتزاء الشبكية

ملاحظة: هذه الخطوة الهامة للحصول على طبقة من خلايا مستقبلة للضوء من دون خلايا الشبكية الأخرى (الشكل 1).

1. بدءا من القمة على كتلة الجيلاتين، وقطع 100 ميكرون أقسام التسلسلية للوصول إلى شبكية العين. ثم قص 100-120 ميكرون أقسام الطبقة الداخلية. اعتمادا على التطبيق، هذه الطبقة قد يتم تجاهل أو تخزينها في النيتروجين السائل. ضمان سرعة vibratome بطيئة جدا (في 1 أو 2) خلال باجتزاء من طبقة أو طبقات خلايا مستقبلة للضوء الداخلية.
2. أداء المتوسطة 15 ميكرون أقسام الشبكية المقابلة إلى واجهة بين الداخلية وشبكية العين الخارجي. مراقبة هذا القسم تحت المجهر. غياب الأوعية الدموية يشير إلى أن تم الوصول إلى شبكية العين الخارجي.
3. قطع 200 ميكرون من شبكية العين الخارجية (طبقة مبصرة) مع الجيلاتين وتحويلها إلى طبق قطره 35 ملم مليئة 3 مل من CO ₂ متوسطة -i. يبقيه على الجليد حتى يتم الحصول على جميع أقسام طبقة مستقبلة للضوء من شبكية العين جميع.

5. خلايا النأي مبصرة

1. خذ طبق (عناوين) تحتوي على طبقة مبصرة (ق) ووضعها (منهم) في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
2. باستخدام ملقط فصل بلطف طبقة مبصرة من الجيلاتين وتحويلها في طبق جديد مليئة 3 مل من محلول رينغر. كرر هذه الخطوة (5.2) لكل إعداد طبقة مبصرة.
3. احتضان 2 وحدة من غراء مع 25 ميكرولتر من محلول المنشط (1.1 ملي EDTA، 5.5 ملي L-سياستين، و 60 ميكرومتر β المركابتويثانول) في 5 مل البولي بروبلين أنبوب معقم واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C في حدود 5٪ CO ₂ الحاضنة . ويتحقق تفعيل غراء عند 37 درجة مئوية. خلال هذه الحضانة، وقطع طبقة مستقبلة للضوء في 2 مم ² قطعة (لا صغيرة جدا) ونقل هذه القطع إلى 5 مل أنابيب.
4. شطف شبكية العين مرتين مع 1.5 مل من محلول الحل رينغر تليها خطورة الترسيب. إزالة كل ما تبقى من الحل رينغر من الأنبوب مع العينة.
5. إضافة 475 ميكرولتر من حل قارع الأجراس في أنبوب يحتوي غراء المنشط والمزيج. إضافة هذا الحل إلى الأنبوب الذي يحتوي على شبكية العين.
6. احتضان الأنبوب مع شبكية العين لمدة 20 دقيقة عند 37 ° C في حدود 5٪ CO ₂ الحاضنة. وقف رد فعل عن طريق إضافة 1 مل من 10٪ FCS في DMEM. إضافة 25 U من ديوكسي ريبونيوكلياز I (الدناز I) إلى الحمض النووي يهضم من خلايا الموت. التجانس بعناية تعليق الخلية باستخدام 1 مل-ماصة. تدور في 50 x ج لمدة 6 دقائق في RT.
7. تجاهل طاف لإزالة آثار الدم وإضافة DMEM المتوسطة مع المكملات الغذائية (انظر الجدول من reagents_equipment تحديدا) إلى الخلية بيليه و resuspend بعناية تعليق الخلية مع ماصة 1 مل. تدور في 50 x ج لمدة 6 دقائق في RT. كرر هذه الخطوة (5.7) مرة أخرى.

6 خلايا التثقيف مبصرة

1. طبقة مبصرة على فأرة الحاسوب في PN8 تحتوي على حوالي 1-1500000 الخلايا باستخدام هذه التقنية. البذور خلايا مستقبلة للضوء في 1⁵ × 10 خلية / سم ² في لوحة الثقافة مع الثقافة المتوسطة وثقافة الخلايا لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية في حدود 5٪ CO ₂ الحاضنة. في يوم 5، والمضي قدما لكيمياء المناعة ودراسة الأساليب التالية النشاف الغربية المقدمة من قبل الموردين الأجسام المضادة.
   ملاحظة: خطوات لوقف ثقافة ويتم وصف الاختبارات الأولية في اشارة ^21.

النتائج

وبصرف النظر عن زراعة الأعضاء، كما تم استخدام طبقات مبصرة لدراسة الإشارات الخلية عن طريق بذر خلايا لصنع الثقافات مبصرة ^12،22. بالإضافة إلى ذلك، فهي تستخدم لدراسة التعبير الجيني والساعة البيولوجية إيقاع ^23،24. وقد استخدمنا طبقة مبصرة خلية من النوع البري الماوس في يوم ما بعد الولادة 8 لإعداد الثقافات مستقبلة للضوء في غياب FCS والحفاظ على خلايا لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5٪ CO ₂ (الشكل 1E ). الخلايا ثم تم ثابتة باستخدام 4٪ paraformadehyde ثم شرع لتحليل immunocytochemical باستخدام أساليب المقدمة من الموردين الأجسام المضادة وحيدة النسيلة إما مع الماوس مكافحة RHO (1: 250، ميليبور Mab5316) أو أرنب بولكلونل مكافحة SAG (1: 200، سخية هدية من إيغال جيري وديفيد هيكس). كنا مكافحة RHO ومكافحة SAG (على الرغم من المخاريط التسمية مكافحة SAG وقضبان) يرجع ذلك إلى حقيقة أن مكافحة SAG هو علامة السابقة، من مكافحة RHO. نسبة سلليرة سورية إيجابية للأجسام المضادة لمكافحة RHO أقل من تلك التي إيجابية للأجسام المضادة للتبلد (الشكل 2). ويمكن تفسير ذلك من خلال حقيقة أن SAG، وأعرب عن قضيب arrestin أيضا الأقماع التي تجعل 3٪ من المستقبلات الضوئية في طبقة معزولة، أو بدلا من ذلك من حقيقة أنه خلال نضوج ما بعد الولادة من شبكية العين، والتعبير عن SAG يسبق أن من RHO ^25،26.

تم استخدام طبقة مبصرة أيضا لمراقبة التعبير معين من الجينات التي المستقبلات الضوئية في شبكية العين من النوع البري والدماغ من الحيوانات تتراوح أعمارهم بين 35 يوما أعدت RNA باستخدام CSCL تنبيذ فائق ²⁷ و تهجين إلى الماوس DNA رقاقة صفيف. رسل لرودوبسين (رو)، يتم التعبير عن S-arrestin (ساج) ومخروط transducin (Gnat2) وتحديدا في شبكية العين بالمقارنة إلى الدماغ (الشكل 3A). التعبير هو بارز في طبقة مبصرة (PR) مما كانت عليه في شبكية العين بأكملها والذي يشملطبقة الشبكية الداخلية تظهر أن يتم التعبير عن هذه الجينات في الواقع من قبل خلايا مستقبلة للضوء. لGnat2، والتعبير النسبي بالمقارنة مع رو والضعف يظهر أن يتم التعبير عن ذلك من خلال المخاريط الواردة في طبقة مبصرة معزولة. التعبير عن recoverin (Rcvrn) في طبقة مبصرة بالمقارنة مع شبكية العين بأكملها يتم زيادة (الشكل 3B).

تم استخدام طبقة مبصرة أيضا لمراقبة التعبير عن RHO وGNAT2 باستخدام النشاف الغربي التالية أساليب المقدمة من قبل الموردين الأجسام المضادة ومقارنة لطبقة الشبكية الداخلية (الشكل 4). لاحظ عدم وجود RHO وGNAT2 ^28، علامات من قضبان ومخاريط على التوالي في شبكية العين بأكملها وفي شبكية RD1 الماوس في يوم ما بعد الولادة 35.

فايجوري 1. عرض تخطيطي للباجتزاء vibratome من الماوس شبكية العين. (A) تركيب شبكية العين مسطحة شنت مع مبصرة لأسفل على شريحة الجيلاتين. (ب) قسم الشبكية الداخلية مع شفرة vibratome. (C) قسم الشبكية الخارجية أضيف من الجيلاتين. (D) مراقبة وجود مستقبلة للضوء على حافة جزء من شبكية العين بعد عزل طبقة مبصرة. ويستخدم على نطاق وشريط تستخدم لمضان أخضر من مجهر الضوء الأبيض. وتقع خلايا مستقبلة للضوء في حافة الصورة. (E) خلايا مستقبلة للضوء مثقف (بعد خمسة أيام). (F) التكبير العالي للوحة E.

الشكل 2. التفاضلية التعبير عن RHO وSAG في الثقافة الماوس مبصرة. (A) تلون نوى (الأزرق)، (B) SAG تلطيخ (الأخضر)، (C) RHO تلطيخ (الحمراء). (D) مدموجة الصورة. لأنه يتم التعبير عن تلطيخ SAG في وقت سابق من RHO تلطيخ، وصفت خلايا اثنين فقط ضعف SAG وRHO (انظر *). شريط مقياس: 23 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. مقارنة بين التعبير عن ثلاثة جينات في الدماغ وشبكية العين بأكملها ومبصرات من الحيوانات البرية من نوع الذين تتراوح أعمارهم بين خمسة وثلاثين يوما. (A) رهودوبسن] (رو)، S-arrestin (ساج) ومخروط transducin (Gnat2). (ب) Calbindin (Calb1) وRecoverin (Rcvrn). يتم عرض البيانات كما التعبير النسبي. التعبير النسبي هو قيمة التعبيرتم الحصول عليها من البيانات ميكروأري بعد normaliszation مع برنامج قوي متعدد مجموعة متوسط ​​(RMA) المتوفرة في قاعدة بيانات المعرفة KBaSS (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/).

الشكل 4. التعبير عن RHO وGNAT2 في شبكية العين الخارجية من النوع البري شبكية العين في مرحلة ما بعد الولادة يوم 35. غياب التعبير عنها في الشبكية الداخلية وفي شبكية الفأر RD1 في ما بعد الولادة يوم 35. ACTB، بيتا -actin. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

شبكية العين هي جهاز نموذج في علم الأحياء. دراسة الشبكية أدت إلى 6 اكتشافات كبيرة في علم الأحياء. وهو في الأصل من الورم الأول RB1 القامع الجين. ويكشف الارتباط الجزيئي بين تحركات التيروزين المستقبلة وتحركات MAP من خلال التفاعل مع ابن sevenless. وشارك في اكتشاف PAX6، أول الجين التحكم الرئيسية لالتشكل الجهاز. وهو في مركز الجمعية الوراثية للعامل تكملة H (CFH) مع الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، وأول جين قابلية المرض التي حددها الشاشة الجينوم جمعية اسعة (GWAS). وأخيرا، أدى ذلك إلى أول العلاج الجيني لمرض فقد البصر الخلقية، أول التصحيحية محاكمة العلاج الجيني في الإنسان من أي رثت المرض. والحفاظ على هيكل هذا الجهاز في معظم أنواع الفقاريات. وقد شجع إمكانية الحصول عليها للتلاعب في الجسم الحي في وقت مبكر يوم الجينوم التحقيقات وظيفية على هذا جزءا لا يتجزأ من المائةراؤول الجهاز العصبي.

نعرض هنا كيفية فصل طبقة مبصرة من الطبقة الداخلية للشبكية عن طريق vibratome باجتزاء. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية للحصول على الثقافات مبصرة نقية. بروتوكول تشريح لدينا يجعل التلوث من الخلايا RPE المستبعد جدا.

واحدة من التحديات الكبرى هو تسطيح للشبكية ما هو ضروري لقسم صحيح الداخلي وشبكية العين الخارجي. وباجتزاء من شبكية العين هو الأفضل على شبكية العين مع القطر الصغير مثل تلك من القوارض وهذا القطر هو وجود قيود على تقنية مع المواد المتاحة حاليا.

فإنه من المستحسن قبل البدء في تجربة ذات مغزى من الناحية البيولوجية، وممارسة على عينة من شبكية العين. نحن لتوضيح الطريقة التي تم الحصول عليها من نتائج ممثلة خلايا مستقبلة للضوء مثقف، وذلك باستخدام مواد لإجراء دراسة التعبير عن كلا من mRNAs والبروتينات. ويمكن أيضا أن يؤديها دراسات التعبير بدلا من ذلك على التقطيعةنانوثانية التي حصلت عليها ملقط ليزر، ولكن يتم تنفيذ الثقافات أفضل باستخدام vibratome باجتزاء. نحن يمكن أن تستخدم تقنية الليزر تسليخ مجهري مع استراتيجية كاملة مختلفة. ولكن، لجمع طبقة مستقبلة للضوء مع جهاز تسليخ مجهري للثقافة، فإنه سيكون من الضروري تجنب تثبيتي، وهذا من شأنه تعقيد المنهجية الحالية بشكل كبير.

نحن نعمل على تطوير بروتوكول يهدف إلى دراسة حركية الجينات والبروتينات التعبير في vibratome أقسام أثناء انحطاط خلايا مستقبلة للضوء في نماذج من التهاب الشبكية الصباغي. ونحن نعتقد أن وصف تفصيلي للبروتوكول مفيدا الباحثين في مجال علم الأحياء في شبكية العين، وعلى الأخص للدراسات البروتين وmetabolomic.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytidine 5′-diphosphocholin*	Sigma-Aldrich	C0256	4.7 µM Cytidine 5′-diphosphocholin
Cytidine 5′-diphosphoethanolamine*	Sigma-Aldrich	C0456	2.7 µM Cytidine 5′-diphosphoethanolamine
Linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)*	Sigma-Aldrich	L8384	100 µg/ml linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)
Triiodo-L-thyronine*	Sigma-Aldrich	T6397	0.03 µM Triiodo-L-thyronine
96-well plates	Greiner bio-one	655-095
Binocular microscope	Leica	MZ-75
CO2 independent (CO2-i)	Life Technologies	18045054
DMEM	Life Technologies	41966029
Forceps n°5 Dumont	Bionic	11254-20
Gelatin from porcin skin type A	Sigma-Aldrich	G2500
GeneChip	Affymetrix	U74v2
Gentamicin solution	Life Technologies	15710049
Hydrocortison*	Sigma-Aldrich	H0888	0.55 µM hydrocortison
Insulin* (I)	Sigma-Aldrich	I1884 (ITS)	0.86 µM insulin (I)
Papain	Worthington-biochem	WOLS03124
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P-6407
Progesterone*	Sigma-Aldrich	P7556	2.0 µM progesterone
Prostaglandin*	Sigma-Aldrich	P5172	0.28 µM prostaglandin
Putrescine*	Sigma-Aldrich	P5780	182 µM putrescine
Scalpel Albion	EMS	72000
Scissor	Moria	15396-00
Sodium pyruvate*	Sigma-Aldrich	S8636	1 mM sodium pyruvate
Sodium selenite* (S)	Sigma-Aldrich	I1884 (ITS)	0.29 µM Na2SeO3   (S)
Taurine*	Sigma-Aldrich	T8691	3 mM taurine
Transferrin* (T)	Sigma-Aldrich	I1884 (ITS)	0.07 µM transferrin (T)
Vibratome apparatus	Leica	VT1000-S
* Supplements