تشكيل مستعمرة الفحص لينة آجار

Summary

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

Abstract

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

Introduction

لينة أجار تشكيل مستعمرة الفحص هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع لتقييم التحول الخلوي في المختبر. تاريخيا، تم استخدام فحص آخر، لفحص مولد الرمع، التي وصفها الصولجان وآخرون في عام 1956 لتقييم قدرة الخلايا على تكوين مستعمرات ^1. في هذه التقنية، وفرقت الخلايا على لوحة الثقافة، وتنمو في وجود الخلايا المغذية "أو المتوسطة مكيفة لتوفير عوامل النمو اللازمة. كان الحد من هذه التقنية أنها قدمت فقط المعلومات المتعلقة تشكيل مستعمرة. يتم منع الخلايا الطبيعية من النمو مرسى مستقل، نظرا لنوع معين من الموت أفكارك، ودعا anoikis ^2. ومع ذلك، تحولت الخلايا لديها القدرة على النمو والانقسام من دون ملزم لالركيزة. للاستفادة من هذا المفهوم، طور الباحثون لينة أجار تشكيل مستعمرة الفحص. ومنذ ذلك الحين تم تعديل أجار لينة تشكيل مستعمرة الفحص، في السنوات الأخيرة، من أجل التصدي ليرة سوريةاحتياجات ecific. تباين واحد ينطوي على دمج صبغة فلوروميتريك للسماح الإنتاجية العالية مستعمرة العد. اختلاف آخر ينطوي استخدام الحل أجار متخصص للسماح للاسترجاع من خلايا قابلة للحياة بعد تشكيل مستعمرة عندما تكون هناك حاجة البروتين أو الحمض النووي العينات.

في أجار لينة تشكيل مستعمرة الفحص التقليدي، وتزرع الخلايا في طبقة من أجار لينة مختلطة مع خلية ثقافة المتوسط ​​الذي يرتكز على طبقة أخرى من أجار لينة، ويخلط أيضا مع خلية ثقافة المتوسط، ولكن تحتوي على تركيز أعلى من أجار. هذا يمنع الخلايا من الانضمام إلى لوحة الثقافة، ولكن يسمح تحول الخلايا لتشكل مستعمرات مرئية. الأساس المنطقي وراء هذه التقنية هو أن الخلايا الطبيعية تعتمد على الخلية إلى خارج الخلية اتصال مصفوفة لتكون قادرة على النمو والانقسام. على العكس، تحول الخلايا لديها القدرة على النمو والانقسام بغض النظر عن البيئة المحيطة بهم. وبالتالي، كانت خلايا قادرة على تشكيل مستعمرات بطريقة مستقلة ج-مرسىonsidered أن تتحول ومسرطنة. الهدف العام من هذه الطريقة هو قياس هذه القدرة في الخلايا بطريقة شبه الكمية وصرامة.

إشارات الطريق WNT أمر بالغ الأهمية في التطور الجنيني، وغالبا ما ينظم دي في تكون الأورام ^3-6. هناك مسارات متعددة ترتبط مع إشارات WNT. مسار قانوني ينطوي على إشارات WNT وتنظيم النسخ الجيني المصب من خلال آثاره على coactivator النسخي بيتا كاتينين. Wnts أيضا إشارة من خلال عدة مسارات غير متعارف عليها، على سبيل المثال، في مسار مستو قطبية الخلية، والذي ينظم العناصر المتورطة في بنية هيكل الخلية ^7، ومسار WNT الكالسيوم، الذي ينظم إطلاق الكالسيوم من الشبكة الإندوبلازمية ^8. بروابط WNT تمارس أنشطتها من خلال ربط مستقبلات Frizzled. على الرغم من أن عدة Wnts وقد ثبت أن upregulated في سرطان الرئة، وقد تبين Wnt7a أن ينظم إلى أسفل في غير األصغرل خلية سرطان الرئة من خلال المروج مثيلة ^9. Wnt7a تربط Fzd9 وبمثابة القامع الورم من خلال مسار غير متعارف عليه. استعادة WNT-7A وFZD-9 يمنع نمو خلايا غير صغيرة خلية سرطان الرئة ^10. وتوسط آثار Wnt7a / Fzd9 من خلال تفعيل إرك-5، والذي بدوره، ينشط بيروكسية تنشيط مستقبلات ناشر γ (PPARγ) ^11،12. هنا، وتبين لنا أن overexpression من Wnt7a وFzd9 النتائج في قمع النمو مرسى مستقل لسرطان الرئة خط الخلية الفئران. تم اشتقاق خلايا CMT167 الفئران من سرطان الرئة في C57BL / ¹³ الفئران lcrf وكانت ستابلي مع Wnt7A وFzd9. وقد أكد overexpression من Wnt7A وFzd9 بواسطة الكمي-PCR (Q-PCR) وظائف Wnt7A وFzd9 overexpression وأكد من خلال تفعيل المصب من PPARγ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد المواد والكواشف

1. تسمية كل بئر من زراعة الأنسجة تعامل وحة 6 جيدا بشكل مناسب لكل خط الخلية أو حالة قيد التحقيق.
2. إعداد 2X مستنبت الخلايا عن طريق إذابة 1 غرام من مسحوق المتوسطة و 0.2 غرام من بيكربونات الصوديوم في دي المتأينة المياه إلى الحجم النهائي من 50 مل.
3. تمر هذه الوسيلة من خلال مرشح 0.2 ميكرون لتعقيم.
4. إضافة مكونات إضافية لازمة لثقافة طبيعية للخط الخلوي من الفائدة. على سبيل المثال، تنمو CMT خط 167 خلية في المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين حل. المتوسط ​​الدافئة إلى 37 درجة مئوية في حمام الماء الساخن قبل استخدامها.
5. إعداد 1X خلية ثقافة المتوسط ​​بشكل منفصل كما تفعل لزراعة الخلايا العادية من خط خلية من الفائدة.
6. إعداد 1٪ أجار النبيل بإضافة 1 غرام من أجار نبيلة إلى 100 مل من الماء منزوع الأيونات.
   ملاحظة: سوف نوبل أجار لا تذوب تماما مع الانفعالات وحدها.
7. إعداد0.6٪ نبيلة أجار عن طريق إضافة 0.6 غرام من أجار نبيلة إلى 100 مل من الماء دي المتأينة. كلا الحلول أجار ويمكن إجراء في 100 مل زجاجة الزجاج مع الأغطية محكمة السد للتخزين على المدى الطويل.
8. الأوتوكلاف خلطات آغار النبيلة لتعقيم. هذه الخلطات يمكن إجراء في وقت مبكر وتخزينها في 4 درجات مئوية ولكن يجب أن يكون ساخنا مرة أخرى في وقت التجربة حتى يذوب تماما أجار.
9. تحضير محلول كلوريد تترازوليوم نتروبلو بجعل 1 ملغ / مل محلول المخزون في برنامج تلفزيوني 1X (8 ز كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام بوكل، 1.44 ز نا ₂ هبو ₄ و 0.24 غرام KH ₂ PO ₄ في H ₂ O إلى الحجم النهائي من 1000 مل ). وسوف تستخدم هذه في نهاية التجربة وصمة عار على المستعمرات.

2. تصفيح من طبقة سفلية من آجار

1. ترخي الغطاء على زجاجة من 1٪ أجار النبيل والميكروويف لمدة 1-2 دقيقة. في حين تسخين في الميكروويف، ومراقبة عن كثب الحل لتجنب غليان. مواصلة التدفئة، في حين خلط متقطع،حتى يذوب تماما أجار والحل واضح.
   ملاحظة: استخدم قفازات مقاومة للحرارة للتعامل مع قارورة بعد التسخين. الفشل في القيام بذلك قد يؤدي إلى حرق أو إصابة خطيرة.
2. وضع ذاب حل أجار وقبل تحسنت مستنبت 2X في دلو الجليد مملوءة ماء الصنبور الساخن (42 درجة مئوية). وضع أيضا أنبوب مخروطي 50 مل في حامل أنبوب في دلو الثلج مع الماء الساخن. دلو لنقل ثقافة خلية غطاء للخطوات اللاحقة.
3. للطبقة السفلية من أجار، سوف تحتاج 1.5 مل من مزيج من أجار والمتوسطة في بئر من لوحة 6 جيدا.
4. لضمان وجود كمية كافية من هذا الخليط، وإعداد ما مجموعه 12 مل لكل لوحة 6 جيدا.
5. نبدأ بإضافة 6 مل من مستنبت إلى 50 مل أنبوب مخروطي ثم 6 مل من 1٪ الحل أجار النبيل.
6. عكس أنبوب مخروطي عدة مرات لخلط. سوف نعمل بخطى سريعة منع تصلب المبكر للأجار لينة.
7. وضع ما يقرب من 5.5 مل من الخليط في 5 مل بي المصليةpette.
8. السماح لفقاعات الهواء لترتفع إلى أعلى العمود ماصة قبل إيداع 1.5 مل من هذا الخليط في كل بئر. توخي الحذر لتجنب ترسب أي فقاعات الهواء في الآبار لوحة.
9. تغطية لوحات والسماح خليط أجار ليصلب في درجة حرارة الغرفة، في الثقافة خلية غطاء محرك السيارة، لمدة 30 دقيقة.

3. طلاء الطبقة العليا من الخلايا التي تحتوي على آجار

1. مرة واحدة وقد عززت الطبقة السفلى من أجار، يبدأ التحضير للطبقة العليا.
2. أولا، من قبل خلايا الحصاد trypsinization وتمييع لهم 1: 5 في مستنبت (مثلا 1 مل من التربسين، إضافة 4 مل من المتوسط) في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
3. عد الخلايا وحساب عدد الخلايا اللازمة لكل بئر لإعداد تعليق خلية النهائي في هذا الوقت. وهذا العدد تختلف تبعا لنوع الخلية. استخدام 5000 خلية / كذلك نقطة انطلاق وتعديل حسب الحاجة. لذلك عدد الخلايا، وكنت إعداد تعليق خلية من 6667 خلية / مل (أي كل أهلا وسهلاسوف يحصل ل 0.75 مل من هذا التعليق و 0.75 مل من أجار لإجمالي حجم 1.5 مل. وسيتم أيضا تركيز خلايا تخفيفه 1: 2 لعدد الخلايا الكلي للنهائي 5000).
4. فإن حجم التعليق الخلية اللازمة لكل بئر من لوحة 6 جيدا مرة أخرى تكون 1.5 مل. إعداد تعليق خلية إضافي بقيمة 12 مل لكل لوحة 6 جيدا.
5. تذوب 0.6٪ محلول أجار في الميكروويف على النحو الوارد أعلاه ووضعها في دلو الثلج التي تحتوي على الماء الساخن مع 50 مل أنبوب مخروطي الشكل في حامل أنبوب وتعليق خلية النهائي من الخطوة 3.3.
6. نقل دلو الثلج ذاب مع 0.6٪ أجار لغطاء محرك السيارة زراعة الخلايا لخطوات لاحقة.
7. مزيج 0.6٪ أجار وتعليق خلية في نسبة 1: 1، وإعداد إجمالي حجم 12 مل لكل لوحة 6 جيدا. سيطلب 1.5 مل لكل بئر ولكن خارج ينبغي أن تدلي على النحو الوارد أعلاه.
8. ماصة 6 مل من تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 50 مل.
9. ثم، تضاف 6 مل من 0.6٪ أجار للأنبوب.
   ملاحظة: يجب أن تكون درجة حرارة هذا الخليطأبقى حوالي 42 درجة مئوية لتفادي تصلب سابق لأوانه وتعظيم بقاء الخلية.
10. العمل بسرعة، ماصة هذا الخليط 2-3x لتوزيع الخلايا، ثم وضع 5.5 مل من الخليط في 5 مل ماصة المصلية.
11. يسمح أي فقاعات الهواء لترتفع إلى أعلى العمود ماصة قبل إيداع 1.5 مل من هذا الخليط في كل بئر. توخي الحذر لتجنب ترسب أي فقاعات الهواء في الآبار لوحة.
12. السماح للخليط خلية / أجار ليصلب في درجة حرارة الغرفة، في الثقافة خلية غطاء محرك السيارة، لمدة 30 دقيقة قبل ان يضع الى 37 درجة مئوية الثقافة ترطيب الخلية الحاضنة.
13. الوقت اللازم لتشكيل مستعمرة يختلف كاف لكل خط الخلية، عادة حوالي 21 يوما.
14. ينبغي الحفاظ على طبقة المتوسطة من النمو خلال الطبقة العليا من أجار لمنع جفاف. 100 ميكرولتر من المتوسط ​​أضاف مرتين أسبوعيا كافية لهذا الغرض.

4. تلطيخ لوحات وعد المستعمرات

1. خلايا صمة عار وذلك بإضافة 200 _6؛ لتر من محلول كلوريد تترازوليوم نتروبلو لكل بئر واحتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
2. مرة واحدة هي ملطخة المستعمرات، والتقاط صور فوتوغرافية من الآبار باستخدام تصوير والاعتماد المستعمرات باستخدام برمجيات تحليل الصور.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

التعبير عن Wnt7A وFzd9 في CMT167 خلايا فعال في قمع الورم كما هو موضح لدينا أجار لينة تشكيل مستعمرة الفحص. مبدئيا، استخدمنا Q-PCR لإظهار أن يتم التعبير عن Wnt7A وFzd9 مرنا في مستويات منخفضة في CMT167 الخلايا. أظهرت خلايا CMT167 مستويات منخفضة من الذاتية Wnt7A وFzd9 بالمقارنة مع MLE 12 الخلايا، وا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تأكيدا من المختبر وظيفة الورم القمعية من البروتينات مما يشير أمر صعب. واحدة من فحوصات أكثر صرامة المتاحة لتحقيق هذه الخاصية هي لينة أجار تشكيل مستعمرة الفحص. هنا، ونحن قد يتضح لينة أجار الفحص تشكيل مستعمرة باستخدام سرطان الرئة خط الخلية الفئران overexpressing مست...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cancer Cell Line of Interest	Sigma-Aldrich	10032302	CMT-167 Cells
Powdered RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-089	Used to prepare 2x cell culture medium.
Liquid RPMI 1650 Medium	Cellgro	10-040-CV	Referred to as 1x cell culture medium.
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30910.03	Used to supplement cell culture medium.
Penicillin/Streptomycin	CellGro	30-002-Cl	Used in cell culture medium.
Difco Noble Agar	BD Biosciences	214230	Used to prepare 1.0% and 0.6% agar.
Sodium Bicarbonate	Fisher	BP-328-1	Used in 2x cell culture medium.
Trypsin	Cellgro	25-050-Cl
Sterile Bottle-Top Filters	Fisher	09-761-126	Used to sterile filter 2x medium.
Lipofectamine Reagent	Invitrogen	18324-020	Used in PPAR-RE luciferase assay.
6-well Plates Tissue-culture Treated
37 °C/5% CO2 Incubator
Chemi-Doc Imager	Bio-Rad		Used to take pictures of colonies.
Quantity One Software	Bio-Rad		Used to count cell colonies.
15 ml Conical Tubes
50 ml Conical Tubes
250 ml Erlenmeyer Flasks
Microwave
5 ml Serological Pipettes
Pipette Aid
Micropipette
Hemacytometer w/ cover slip
Pipette Tips
Inverted Light Microscope
Centrifuge
Heat-Resistant Gloves
Saran Wrap
Ice Bucket